CN107365723B - 化学制剂和生防微生物联合防控连作番茄青枯病 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了化学制剂和生防微生物联合防控连作番茄青枯病，本发明分离到了对番茄青枯病病原菌有显著拮抗作用的一株拮抗菌(芽孢杆菌B8)，该菌株B8属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqueBaciens)，于2017年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.14042。利用该拮抗菌生产液体菌剂及微生物有机肥料，液体菌剂中拮抗菌数量大于109/ml，微生物肥料中拮抗菌数量大于5.0×107个/g。连作番茄土壤中联合使用拮抗菌液体菌剂、含有拮抗菌的微生物有机肥和0.3％(W/V)亚磷酸钾溶液处理，对番茄青枯病的防治率高达70％以上。

Description

化学制剂和生防微生物联合防控连作番茄青枯病
技术领域
本发明涉及使用化学药剂、拮抗菌菌剂及微生物有机肥联合防控番茄青枯病，属于植物土传病害的综合防治领域。
背景技术
番茄青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种土传病害，发病率通常在20％-30％，连作时尤为严重，有时发病率高达70-80％，甚至绝收。目前，还没有有效的化学农药防治番茄青枯病，迫切需要开发防控番茄青枯病的新技术。我们发现亚磷酸钾(KH2PO3),既可作为磷钾肥，一定浓度下又具有抑制病原菌-青枯劳尔氏菌生长的能力，亚磷酸钾和拮抗菌株F8对青枯病的抑制具有协同作用，亚磷酸钾和拮抗菌株F8液体菌剂及微生物有机肥联合使用，可以显著提高防控番茄青枯病的效果，也符合绿色农业的需求。
发明内容
本发明的目的在于研制一种利用化学抑菌剂亚磷酸钾、拮抗菌液体菌剂及微生物有机肥料防控番茄青枯病的综合技术，其综合防治效率达到60-80％，为集约化番茄种植业的持续发展提供技术。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一株用于防治番茄青枯病的拮抗菌B8，属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，于2017年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.14042。主要生物学特性为：B8在LB培养基上生长时，菌落呈灰色，圆形，开始时菌落表明光滑，后期菌落表面有皱褶。B8的细胞为杆状，生长后期细胞内形成球形的芽孢。拮抗菌B8菌株具有发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖产酸的能力，能水解淀粉和液化明胶。
上述的拮抗菌B8在制备用于防控番茄青枯病的生防制剂中的应用。
采用上述的拮抗菌B8生产的用于防控番茄青枯病的生防制剂。
上述的拮抗菌B8在防控番茄青枯病中的应用。
上述的拮抗菌B8在联合化学制剂亚磷酸钾防控番茄青枯病中的应用。
上述的应用，包括以下步骤：(1)采用上述的拮抗菌B8分别制备B8液体菌剂和B8微生物有机肥；(2)将步骤(1)制备的B8液体菌剂和浓度为10％～30％(W/V,10～30g/100ml)的淀粉溶液按照1:1的体积比混合制成混合液；(3)将番茄苗用步骤(2)制备的混合液蘸根，使拮抗菌B8细胞粘附在番茄苗根部；(4)根部粘附有拮抗菌B8细胞的番茄苗移栽时，将步骤(1)制备的B8微生物有机肥施用在番茄苗根部，最后在每株番茄苗的根部灌浇浓度为0.2％～0.4％(W/V,0.2～0.4g/100ml)的亚磷酸钾溶液。
一种高效防控连作番茄青枯病的方法，包括以下步骤：
(1)采用上述的拮抗菌B8分别制备B8液体菌剂和B8微生物有机肥；
(2)将步骤(1)制备的B8液体菌剂和浓度为10％～30％(W/V,10～30g/100ml)的淀粉溶液按照1:1的体积比混合制成混合液；
(3)将番茄苗用步骤(2)制备的混合液蘸根，使拮抗菌B8细胞粘附在番茄苗根部；
(4)根部粘附有拮抗菌B8细胞的番茄苗移栽时，将步骤(1)制备的B8微生物有机肥施用在番茄苗根部，最后在每株番茄苗的根部灌浇浓度为0.2％～0.4％(W/V,0.2～0.4g/100ml)的亚磷酸钾溶液。
上述的方法，其步骤(2)中所述淀粉溶液的浓度为20％；步骤(4)中所述亚磷酸钾溶液的浓度为0.3％。
上述的方法，其步骤(4)中所述B8微生物有机肥的施用量为40～60g/棵；所述亚磷酸钾溶液的灌浇量为40～60ml/棵。
上述的方法，其步骤(1)中采用上述的拮抗菌B8制备的B8液体菌剂中孢子和细胞的数量达到109/ml数量级；步骤(1)中采用上述的拮抗菌B8制备的B8微生物有机肥中含有5×107个/g以上的拮抗菌F8的孢子。
本发明步骤(1)中用拮抗菌菌株B8生产B8液体菌剂和B8微生物有机肥料的具体生产方法可以参见专利ZL2012 1 0326641.7，但不限于此，也可以采用本领域技术人员公知的其他方法生产。
上述方法中所用的亚磷酸钾为工业级，使用浓度为0.2％～0.4％,优选为0.3％(W/V)。本发明实验显示0.3％的亚磷酸钾(KH2PO3)显著抑制病原菌-青枯劳尔氏菌的生长(见图2)，而对生防菌株B8没有影响。
生防菌株B8的液体菌剂、微生物有机肥料和亚磷酸钾的联合使用的最优选方法：将B8液体菌剂和20％(W/V)的淀粉溶液按照1:1(V/V)的比例混合，用于番茄苗蘸根，使B8细胞粘附在番茄苗根部。B8微生物有机肥采用穴施，按照每棵苗50g的使用量将微生物有机肥撒在番茄苗根部，再覆土，最后在每株番茄苗根部灌浇0.3％(W/V)亚磷酸钾溶液50ml。
本发明的有益效果：
本发明筛选的拮抗菌菌株B8对番茄青枯病具有显著的防控效果，采用该菌株B8制备的生防制剂对番茄青枯病的生物防治显著，盆栽试验和田间试验的结果表明，连作番茄青枯病的土壤中综合施用B8液体菌剂、B8微生物有机肥料和亚磷酸钾后，番茄青枯病的生物防治率高达70％以上，表明联合处理具有显著的协同增效作用，可显著提高对番茄青枯病的防治效果。
附图说明
图1为拮抗菌菌株B8对番茄青枯病病原菌(R.solanacearum)的抑制作用(显示抑菌圈)
图2为0.3％亚磷酸钾对番茄青枯病病原菌(R.solanacearum)的抑制作用(显示抑菌圈)
图3为联合处理对防治番茄青枯病的效果
具体实施方式
(一)菌株的分离和鉴定
从番茄植株根际土壤中采用平板稀释法分离细菌，然后以番茄青枯病病原菌-青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)为指示菌采用对峙法筛选拮抗放线菌，根据生长速度、拮抗能力最终筛选出高效拮抗菌株B8，经过形态特征、生理生化特性以及16S rRNA基因序列将菌株B8鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
该菌株B8于2017年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.14042。主要生物学特性为：F8在LB培养基上生长时，菌落呈灰色，圆形，开始时菌落表明光滑，后期菌落表面有皱褶。B8的细胞为杆状，生长后期细胞内形成球形的芽孢。拮抗菌B8菌株具有发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖产酸的能力，能水解淀粉和液化明胶。
该拮抗菌菌株B8对番茄青枯病病原菌(R.solanacearum)的抑制作用如图1所示。
(二)菌株B8液体菌剂及微生物有机肥的生产
生产方法参见专利ZL2012 1 0326641.7。
1)B8液体菌剂的制备：将菌株B8接种到PDA培养液中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0-7.2，培养温度30℃，170转/分钟，发酵48h后形成芽孢，获得B8液体菌剂，其中的含菌或芽孢量≥5×109个/ml；
所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。
2)B8微生物有机肥的制备：以腐熟的猪粪堆肥和氨基酸有机肥(江苏新天地氨基酸肥料有限公司产品，登记证号：苏农肥(2008)准字0180号，肥料规格：N+P2O5+K2O≥6％，有机质≥30％，氨基酸≥5％)以体积比6：4混合制成。所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2％，含水量25-30％。
将步骤1)制备的B8液体菌剂按20％(V/W，20ml/100g)的比例接种到步骤2)所述的有机肥中进行二次固体发酵，发酵温度为30-50℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵发酵周期5-7天，使拮抗菌含量达到2.0×109个/g以上，获得拮抗菌B8的固体菌剂。最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，获得防治番茄青枯病的F8微生物有机肥，该肥料中含有≥2.0×109个/g的拮抗菌B8、全氮含量为30.9g.kg-1，全磷含量为12.0g.kg-1、全钾含量为20.9g.kg-1。
(三)温室盆栽试验
供试番茄品种为“合作918”,由上海长种番茄种业有限公司出品。育苗4～5片真叶后移栽到装有5kg土壤的盆钵中。设置4个处理：
1)CK；
2)B8液体菌剂+B8微生物有机肥+0.3％亚磷酸钾处理
3)B8液体菌剂+F8微生物有机肥：将B8液体菌剂和20％(W/V)的淀粉溶液按照1:1(V/V)的比例混合，用于番茄苗蘸根，使菌株B8细胞粘附在番茄苗根部。微生物有机肥采用穴施，按照每棵苗50g的使用量将微生物有机肥撒在番茄苗根部，再覆土。
4)0.3％亚磷酸钾处理：CK处理用氮、磷、钾肥补齐养分，在每株番茄苗根部灌浇0.3％(W/V)亚磷酸钾溶液50ml。
每种处理设三个区组，每个区组十五个重复。土壤中接种病原菌，含量为8.5×106个/g土。B8液体菌剂+B8微生物有机肥+0.3％亚磷酸钾综合处理的过程为：将B8液体菌剂和20％(W/V)的淀粉溶液按照1:1(V/V)的比例混合，用于番茄苗蘸根，使菌株B8细胞粘附在番茄苗根部。微生物有机肥采用穴施，按照每棵苗50g的使用量将微生物有机肥撒在番茄苗根部，再覆土，最后在每株番茄苗根部灌浇0.3％(W/V)亚磷酸钾溶液50ml(0.3％亚磷酸钾对番茄青枯病病原菌(R.solanacearum)的抑制作用见图2)。CK处理用氮、磷、钾肥补齐养分。
番茄生长20天后每天调查青枯病发生情况，计算病情指数和防治效果：
病情指数＝∑(各级病株数×相应级数)/调查总植株数×100；
防治效果＝(对照区病情指数—处理区病情指数)/对照区病情指数×100；
病害严重度分级标准：0级：无病状；Ⅰ级：1/4叶片发病；Ⅱ级：1/2叶片发病；Ⅲ级：整株死亡。
结果显示，单独使用0.3％亚磷酸钾对番茄青枯病的防治效果为40.6％，使用B8液体菌剂和B8微生物有机肥对番茄青枯病的防治效果为51.1％，而联合施用B8液体菌剂、B8微生物有机肥和亚磷酸钾的综合处理对番茄青枯病的防治效果达到76.2％(表1),表明联合处理具有协同作用，可显著提高对番茄青枯病的防治效果(图3)。
表1 联合处理对防治番茄青枯病的效果
处理 病情指数(％) 防治效果(％)
CK 90.6 —
综合处理 21.5 76.2
比较例1(B8液体菌剂+B8微生物有机肥) 44.3 51.1
比较例2(0.3％亚磷酸钾处理) 53.8 40.6

Claims (6)

1.拮抗菌B8在联合化学制剂亚磷酸钾防控番茄青枯病中的应用，该菌株B8属于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliqueBaciens），于2017年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 14042。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
（1）采用所述的拮抗菌B8分别制备B8液体菌剂和B8微生物有机肥；
（2）将步骤（1）制备的B8液体菌剂和浓度为10%~30%的淀粉溶液按照1:1的体积比混合制成混合液；
（3）将番茄苗用步骤（2）制备的混合液蘸根，使拮抗菌B8细胞粘附在番茄苗根部；
（4）根部粘附有拮抗菌B8细胞的番茄苗移栽时，将步骤（1）制备的B8微生物有机肥施用在番茄苗根部，最后在每株番茄苗的根部灌浇浓度为0.2%~0.4%的亚磷酸钾溶液。
3.一种高效防控连作番茄青枯病的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）采用拮抗菌B8分别制备B8液体菌剂和B8微生物有机肥，该菌株B8属于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliqueBaciens），于2017年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 14042；
（2）将步骤（1）制备的B8液体菌剂和浓度为10%~30%的淀粉溶液按照1:1的体积比混合制成混合液；
（3）将番茄苗用步骤（2）制备的混合液蘸根，使拮抗菌B8细胞粘附在番茄苗根部；
（4）根部粘附有拮抗菌B8细胞的番茄苗移栽时，将步骤（1）制备的B8微生物有机肥施用在番茄苗根部，最后在每株番茄苗的根部灌浇浓度为0.2%~0.4%的亚磷酸钾溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述淀粉溶液的浓度为20%；步骤（4）中所述亚磷酸钾溶液的浓度为0.3%。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：步骤（4）中所述B8微生物有机肥的施用量为40~60g/棵；所述亚磷酸钾溶液的灌浇量为40~60ml/棵。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中采用所述的拮抗菌B8制备的B8液体菌剂中孢子和细胞的数量达到109/ml数量级；步骤（1）中采用权利要求1所述的拮抗菌B8制备的B8微生物有机肥中含有5×107个/g以上的拮抗菌B8的孢子。
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