CN111073825A - 具有抗植物土传病害作用的细菌及其用途 - Google Patents

具有抗植物土传病害作用的细菌及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株对植物有益生作用并能防治植物土传病害的细菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillius velezensis)及其菌剂，属生物农药技术领域。该菌株分离于三年生三七根部土壤，经过鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15320。所述的贝莱斯芽孢杆菌，该菌株悬液或菌株发酵液或菌株发酵液提取液或含有该菌株的菌剂，不仅可一定程度上促进植物的种子萌发和植物的生长，还可以显著降低植物土传病害的发生率，特别是降低植物在连作地上的土传病害发生率。含有该菌株的菌剂也可与有机肥混合制成菌肥使用，为植物病害的生物防治领域带来广阔的应用前景。

Description

具有抗植物土传病害作用的细菌及其用途
技术领域：
本发明涉及一种生防菌细菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillius velezensis)及其应用，具体涉及一株对植物生长具有益生作用的贝莱斯芽孢杆菌细菌及其在防治植物土传病害，特别是在连作地植物土传病害中的应用，属生物农药技术领域。
背景技术：
近20年来，我国逐步实现了由传统农业向现代农业的转变，中国农业年鉴2015年公布的数据显示，我国保护地种植面积已超过380万hm2，高附加值蔬菜2035.26万hm2。我国重要的中药材如人参、三七的种植面积均居世界首位，2015年，人参种植面积达到0.21万hm2，三七种植面积达到3.02万hm2。随着单一作物栽培面积的扩大和连年栽培，造成土壤中病原菌、虫卵积累，毁灭性土传病害如根腐病、枯萎病、疫病、青枯病及根结线虫病等连年发生，逐年加重，作物产量和品质受到严重影响，一般造成减产20～40％，严重的减产60％以上甚至绝收，造成连作障碍。植物土传病害是指病原体如真菌、细菌、线虫和病毒随病残体生活在土壤中，条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害，真菌病原菌主要包括：柱孢菌、尖孢镰刀菌、茄腐镰孢菌、立枯丝核菌、轮枝孢霉菌、茎点霉菌，细菌病原菌以假单孢菌、青枯雷尔氏菌等为主。因此，抑制根围***病原物的活动就成为保护根系并进行土传病害防治的基础。
由于化学方法的高效及简便，仍旧是现阶段在大田生产中采用的防治土传病害的主要措施，化学方法虽然能够大量的杀灭土壤中的微生物，但对根腐病、枯萎病的防治效果收效甚微，且农药残留、重金属超标等随之而来的问题也不可忽视，特别是不能防治连作土壤中爆发的根腐病。植物根际寄居着大量与植物生长密切相关的微生物类群，通过施加根际促生菌，对根际微生态环境的合理调控，改善植物根际环境，抑制病原微生物繁殖的生物防治手段在作物特别是药用植物的安全性、种植的可持续性方面有巨大的应用潜力。
发明内容：
本发明的目的在于：针对目前土传病害中根腐病、锈腐病、枯萎病、疫病、青枯病等严重发生，且农药、轮作、土壤的化学处理等防治措施效果不理想，同时带来环境污染的问题，提供一种高效防治植物土传病害及促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌细菌(Bacillusvelezensis)菌株及其应用。
具体技术方案如下：
本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌细菌(Bacillus velezensis)，经过形态学和分子生物学研究鉴定为Bacillus velezensis。在所述菌株在LB培养基上培养2天，菌落整体呈灰白色，直径为3-5mm，边缘锯齿形，表面有褶皱，无色素；所述LB培养基组成为：酵母浸粉3g～8g,蛋白胨6g～20g,氯化钠3～10g，琼脂10g～20g,定容至1L蒸馏水中，PH自然，121℃灭菌30min。本发明还提供了所述贝莱斯芽孢杆菌细菌在促进植物生长和土传病害防控中的应用。
所述贝莱斯芽孢杆菌细菌在促进植物生长和根腐病、锈腐病、枯萎病、疫病、青枯病等防控中的应用中，通过使用贝莱斯芽孢杆菌细菌菌株菌悬液或菌株发酵液或菌株发酵液提取液或固体菌剂或四者联合使用对植物进行灌根处理。
所述的植物可以为药材、蔬菜等。
菌株菌悬液通过如下方法制备：将所述的菌株接种于LB培养基平皿中，20-40℃倒置培养1-3天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成菌悬液，使用紫外分光光度计在波长600nm下测定菌悬液浓度，所述的菌悬液的浓度为：0.1-0.8。
菌株发酵液通过如下方法制备：将所述的菌株接种于LB固体培养基平皿中，20-40℃倒置培养1-3天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成菌悬液，使用紫外分光光度计在波长600nm下测定菌悬液浓度，所述的菌悬液的浓度为：0.1-0.8；取菌悬液接种于发酵培养基LB中，20-40℃，120-200r/min，培养1-5天。
菌株发酵液提取液通过如下方法制备：将所述的菌株接种于LB固体培养基平皿中，20-40℃倒置培养1-3天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成菌悬液，使用紫外分光光度计在波长600nm下测定菌悬液浓度，所述的菌悬液的浓度为：0.1-0.8；取菌悬液接种于发酵培养基LB中，20-40℃，120-200r/min，培养1-5天，得发酵液。所得的发酵液使用等体积乙酸乙酯萃取，收集浓缩萃取液。
菌株固体菌剂通过如下方法制备：将所述的菌株接种于LB固体培养基平皿中，20-40℃倒置培养1-3天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成菌悬液，使用紫外分光光度计在波长600nm下测定菌悬液浓度，所述的菌悬液的浓度为：0.1-0.8；取菌悬液接种于发酵培养基LB中，20-40℃，120-200r/min，培养1-5天。将发酵液接种到固体发酵培养基中，20-40℃培养，培养1-3d后在无菌条件下进行搅拌，搅拌后继续培养1-3d，得到固体发酵菌剂；将所得固体菌剂放在30-40℃的干燥箱内，鼓风烘干20-30h，将固体菌剂烘干至含水量在10-20％以下，该菌剂活菌数可以达到1.0-5.0×109个/g以上，包装。
所述的LB固体培养基为：酵母浸粉3g～8g,蛋白胨6g～20g,氯化钠3～10g，琼脂10g～20g,定容至1L蒸馏水中，PH自然，121℃灭菌30min；所述的LB发酵培养基为：酵母浸粉3g～8g,蛋白胨6g～20g,氯化钠3～10g,定容至1L蒸馏水中，PH自然，121℃灭菌30min；所述的固体发酵培养基为：麦麸300-350g，玉米粉50-100g，豆饼粉5-10g，KNO3 0.5g，K2HPO41.5g，NaCl 1.5g，CaCO3 4g，加水400ml，121℃灭菌30min。
所述的生防菌贝莱斯芽孢杆菌细菌在促进植物生长及防治根腐病、锈腐病、枯萎病、疫病、青枯病等中的应用，方法如下：
可在植物种子期使用，使用紫外分光光度计在波长600nm下稀释菌悬液浓度为：0.1-0.8，再稀释102-104倍，1L稀释液浸泡1公斤种子。
可在植物成株期或种苗期灌根使用，使用紫外分光光度计在波长600nm下稀释菌悬液浓度为：0.1-0.8，稀释102-104倍，每株使用50ml。连续使用2-3次，每次间隔30-90天。该菌剂也可与有机肥混合配制成菌肥使用。
可在植物成株期或种苗期灌根使用，发酵液或发酵提取液稀释102-104倍施用，每株使用50ml。连续使用2-3次，每次间隔30-90天。该菌剂也可与有机肥混合配制成菌肥使用。
可在植物成株期或种苗期直接撒施，将固体菌剂撒施在植物苗床上，每亩用量为10-40kg，或者将菌剂用细沙混匀之后散于植株根际。连续使用2-3次，每次间隔30-90天。该菌剂也可与有机肥混合配制成菌肥使用。
本发明有益效果：
本发明筛选出的生防菌贝莱斯芽孢杆菌细菌(Bacillus velezensis)菌株菌悬液或菌株发酵液或发酵液提取液或固体菌剂能够明显抑制土传病害致病菌腐皮镰孢、柱孢、链格孢、疫恶霉、青枯雷尔氏菌等的生长，并且促进植株生长。由于是生物制剂，因此没有化学农药使用带来的一系列问题，对减少农业污染且有效防治根腐病、锈腐病、枯萎病、疫病、青枯病等大有益处。本发明生防细菌贝莱斯芽孢杆菌细菌分离自土壤，其与土壤生态和谐相容，有利于充分发挥菌株的优势。
本发明生防细菌菌株培养条件简单，遗传稳定，易于工业化生产扩大，具有良好的开发应用前景。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)已在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间：2018年01月29日，保藏编号为CGMCC No.15320。
附图说明：
图1为贝莱斯芽孢杆菌细菌(Bacillus velezensis)菌落形态。
图2为贝莱斯芽孢杆菌细菌(Bacillus velezensis)发酵液对连作地三七的防病效果。
具体实施方式：
为了更好的理解本发明，下面附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制，下面实施例中所述的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CGMCC No.15320的获得：
从云南省采集三年生三七根际土壤，将土样除去石块后称取5g，放入盛有45mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，此即10-1的土壤悬液；逐级稀释至10-2、10-3、10-4、10-5后，分别取各稀释液涂布于分离平板，倒置，26℃培养1～5d。培养观察，单菌落长出后转接到LB培养基上培养，即获得了菌株CGMCC No.15320。
实施例2贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CGMCC No.15320的鉴定
1形态特征观察
将培养1-5天的菌株Bacillus velezensis CGMCC No.15320打开平皿盖，在黑色背景下拍照。菌落呈灰白色，表面有褶皱，无色素产生，最外周呈灰白色(图1)。
2 16S rRNA序列分析
液氮研磨法提取菌株基因组DNA后，采用引物：16s F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；16s R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，进行PCR扩增。凝胶电泳后送生物工程(上海)有限公司测序，序列全长为1524bp(见SEQ)。将所得序列提交到GenBank数据库进行BLAST分析比对，发现与CGMCC No.15320同源性较高的菌株属于Bacillusvelezensis，并且在NCBI上提交了菌株序列号为MH371021。
实施例3贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌悬液对三七、黄瓜、辣椒、玉米种子萌发的促进作用
将所述的菌株接种于LB培养基平皿中，26-30℃倒置培养1-5天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成菌悬液，使用紫外分光光度计在波长600nm下稀释菌悬液浓度为：0.1-0.8，稀释100倍，备用。以蒸馏水作为对照，每组三个重复，每个重复100粒种子，每组使用菌悬液稀释液50mL浸泡1-5h。筛网过滤得到种子，20-25℃保湿培养20天，统计三七种子萌发率；20-25℃保湿培养24小时，统计黄瓜种子萌发率；20-25℃保湿培养5天，统计辣椒、玉米种子萌发率，结果见表1，显示，使用贝莱斯芽孢杆菌处理过的种子萌发率均高于对照组，并有显著性差异，说明菌悬液对植物种子萌发有促进作用。
表1.贝莱斯芽孢杆菌菌悬液对植物种子萌发率(％)影响
Figure BDA0001834432350000041
注：*，P<0.05；***，P<0.001.
实施例4贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)发酵液对三七、黄瓜、辣椒、玉米的促生作用
将所述的菌株接种于LB培养基平皿中，26-30℃倒置培养1-5天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成菌悬液，使用紫外分光光度计在波长600nm下测定菌悬液浓度，所述的菌悬液的浓度为：0.1-0.8；取菌悬液接种于发酵培养基LB中，26-30℃，120-200r/min，培养1-5天，发酵液稀释100倍，备用。以蒸馏水作为对照，每组三个重复，每个重复接种100株植株，每株灌根50mL。施肥时间：二年生三七、黄瓜、辣椒、玉米出苗后5d。分别于灌菌后30d采集植物样品进行全株鲜质量、根系酶活力测定。根系活力测定方法为氯化三苯基四氮唑(TTC)法，参照张志良《植物生理学实验指导第三版》。
通过以上测量指标，运用Graphpad软件进行显著性差异分析，结果如表2，结果显示，菌株Bacillus velezensis发酵液可以显著提高三七、黄瓜、辣椒及玉米植株的生物量，并且表3结果显示可显著提高植株根系活力，对植物的营养吸收起到促进作用，对植物有促生作用。
表2.贝莱斯芽孢杆菌发酵液对植物种苗生物量(g/株)促进作用
Figure BDA0001834432350000051
注：*，P<0.05；**，P<0.01.
表3.贝莱斯芽孢杆菌发酵液对植物种苗根活力[μg/(g·h)]增强作用
Figure BDA0001834432350000052
注：*，P<0.05；**，P<0.01.
实施例5贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)发酵液对三七、人参、黄瓜、辣椒、玉米防病效果
发酵液制备方法同实施例4，以蒸馏水作为对照，每组三个重复，每个重复接种100株种苗，每株苗灌根50mL。黄瓜、辣椒、玉米45d后各补加一次菌剂，灌根90d后，测定植株存苗率。
贝莱斯芽孢杆菌细菌(Bacillus velezensis)发酵液组与对照组(CK组)相比，发酵液组发病植株数目较CK组少，存苗率高，见表4，对照组在未施药的条件下发现患有：三七根腐病、三七疫病、人参锈腐病、黄瓜枯萎病、黄瓜青枯病、辣椒枯萎病、辣椒青枯病、玉米根腐病，而施用贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)发酵液组健康苗存苗率高，有显著性差异，说明该菌可有效预防三七根腐病、三七疫病、人参锈腐病、黄瓜枯萎病、黄瓜青枯病、辣椒枯萎病、辣椒青枯病、玉米根腐病等。
表4.贝莱斯芽孢杆菌发酵液对植物防病效果(存苗率％)
Figure BDA0001834432350000061
注：*，P<0.05；**，P<0.01.
实施例6贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)固体菌剂对连作三七防病效果
发酵液制备方法同实施例4，将发酵液接种到固体发酵培养基中，20-40℃培养，培养1-3d后在无菌条件下进行搅拌，搅拌后继续培养1-3d，得到固体发酵菌剂；将所得固体菌剂放在30-40℃的干燥箱内，鼓风烘干20-30h，包装。选取间隔三年的拮抗植物处理三七连作土壤，在移苗期施用固体菌剂，以清水作为对照，施用量为0.5-2.0g/株，每组三个重复，每个重复接种400株三七苗，分别在3个月、6个月、12个月后进行菌剂追加，追加量同上，15个月后观察三七根腐病发生情况，对照组根腐病发生率是76％，处理组根腐病发生率是27％，结果表明处理组较对照组根腐病发生率降低了49％，在连作土地上显示出良好的防病效果，见图2。
实施例7贝莱斯芽孢杆菌细菌(Bacillus velezensis)发酵液乙酸乙酯提取液抑菌测试
采用96孔板-比浊法，将Bacillus velezensis发酵液乙酸乙酯提取液对三七根腐病致病菌(Fusarium solani,Cylindrocarpon destructans)、三七疫病致病菌(Phytophthora cactorum)、人参锈腐病致病菌(Cylindrocarpon destructans)、黄瓜枯萎病致病菌(Fusarium oxysporum)、黄瓜青枯病致病菌(Ralstonia solanacearum)、辣椒枯萎病致病菌(Fusarium oxysporum)、辣椒青枯病致病菌(Ralstonia solanacearum)、玉米根腐病致病菌(Fusarium moniliforme)作拮抗测试。发酵液提取物作用终浓度为0.5mg/ml。真菌将孢子从斜面洗下制成孢子悬浮液，血球计数板计数，稀释至孢子浓度107cfu/ml，吸取上述稀释好的真菌孢子悬液0.5ml加入50ml液体PDB培养基中，混匀成真菌混悬液；细菌将菌体用无菌水制成OD600＝0.3的菌悬液，吸取上述稀释好的细菌菌悬液0.5ml加入50ml液体LB培养基中，混匀成细菌混悬液。空白对照组(CK)：198μl混悬液+2μl无菌水；DMSO对照组：198μl混悬液+2μl DMSO；阳性对照组：198μl混悬液+2μl G418或198μl混悬液+2μl硫酸链霉素；实验组：198μl混悬液+2μl发酵液萃取物(Extract)，每组三个平行。将96孔板置于28℃培养箱中培养，真菌48h后600nm处测量OD值，细菌24h后600nm处测量OD值。结果发酵液萃取物对Fusarium solani抑制率66.41±0.56％,对Cylindrocarpon destructans抑制率58.38±0.61％，对Phytophthora cactorum抑制率53.12±0.72％，对Fusarium oxysporum抑制率73.62±0.62％，对Ralstonia solanacearum抑制率80.44±0.37％，对Fusariummoniliforme抑制率54.37±0.71％，与空白对照组存在显著性差异。活性筛选实验结果表明，菌株Bacillus velezensis的发酵液对三七根腐致病菌、三七疫病致病菌、人参锈腐病致病菌、黄瓜枯萎病致病菌、黄瓜青枯病致病菌、辣椒枯萎病致病菌、辣椒青枯病致病菌、玉米根腐病致病菌具有较好的拮抗作用。
所述的PDB培养基为：土豆100g～200g,葡萄糖5g～20g,定容至1L蒸馏水中，PH自然，121℃灭菌30min。

Claims (10)

1.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillius velezensis)，其特征在于，保藏编号为：CGMCCNo.15320。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillius velezensis)在防治植物土传病害中的应用。
3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillius velezensis)在防治植物连作地上土传病害中的应用。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的土传病害为根腐病、锈腐病、枯萎病、疫病、青枯病。
5.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillius velezensis)在促进植物生长或种子萌发中的应用。
6.如权利要求2-5任何一项所述的应用，其特征在于，使用贝莱斯芽孢杆菌的菌株悬液或菌株发酵液或菌株发酵液提取液或含有该菌株的菌剂对植物进行灌根或撒施处理。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的菌株悬液通过如下方法制备：将所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株接种于LB固体培养基平皿中，20-40℃倒置培养1-3天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成菌悬液，使用紫外分光光度计在波长600nm下测定菌悬液浓度，所述的菌悬液的浓度为：0.1-0.8。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的菌株发酵液通过如下方法制备：将所述的菌株接种于LB固体培养基平皿中，20-40℃倒置培养1-3天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成菌悬液，使用紫外分光光度计在波长600nm下测定菌悬液浓度，所述的菌悬液的浓度为：0.1-0.8；取菌悬液接种于LB发酵培养基中，20-40℃，120-200r/min，培养1-5天，得菌株发酵液，活菌数可以达到1.0-5.0×109个/ml以上；将前述所得的菌株发酵液使用等体积乙酸乙酯萃取，收集浓缩萃取液，得菌株发酵液提取液，备用。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的含有该菌株的固体菌剂通过如下方法制备：将权利要求7所得的菌株发酵液接种到固体发酵培养基中，20-40℃培养，培养1-3d后在无菌条件下进行搅拌，搅拌后继续培养1-3d，得到固体发酵菌剂。
10.如权利要求7或8或9所述的应用，其特征在于，所述的LB固体培养基为：酵母浸粉3g～8g,蛋白胨6g～20g,氯化钠3～10g，琼脂10g～20g,定容至1L蒸馏水中，PH自然，121℃灭菌30min；所述的LB发酵培养基为：酵母浸粉3g～8g,蛋白胨6g～20g,氯化钠3～10g,定容至1L蒸馏水中，PH自然，121℃灭菌30min；所述的固体发酵培养基为：麦麸300-350g，玉米粉50-100g，豆饼粉5-10g，KNO3 0.5g，K2HPO4 1.5g，NaCl 1.5g，CaCO3 4g，加水400ml，121℃灭菌30min。
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