CN116926167A - 一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的捕获探针、试剂盒、方法及应用 - Google Patents
一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的捕获探针、试剂盒、方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于核酸靶向捕获技术领域,更具体地,涉及一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的捕获探针、试剂盒、方法及应用。本发明利用提供的靶向捕获尿液样本中目标核酸的捕获探针和试剂盒可以特异性地捕获尿液样本中的目标核酸,快速、特异、高效的对目标核酸进行富集,且能够避免尿液样品中非目标DNA的非特异性结合,实现纯化和富集目标核酸的目的,显著提高捕获特异性,提高目标DNA的纯度。将上述捕获探针或试剂盒应用于尿液样本中尿路上皮癌检测时,能够增加检测特异性和准确性,提高检测灵敏度,降低假阴性结果检出。
Description
技术领域
本发明属于核酸靶向捕获技术领域,更具体地,涉及一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的捕获探针、试剂盒、方法及应用。
背景技术
随着分子生物学技术的发展,检测肿瘤细胞基因组遗传信息和表观遗传信息的变化逐渐成为肿瘤检测的新手段。近年来,无创检测日益兴起,例如,利用尿液中的脱落细胞检测基因组遗传信息和表观遗传信息的变化用来检测尿路上皮癌已成为一种更加便捷和便于普及的检测方式。目前,已有一些DNA甲基化检测标记物通过检测尿液样本对尿路上皮癌具有良好的检测效果,例如VIM,TWIST等基因。但是,核酸的提取量和提取纯度会影响下游检测技术(如PCR检测、测序及分子杂交等)的灵敏度和特异性,最终影响检测效果。
在尿液样本中含有很多的细菌等微生物,为尽量减少尿液样本中细菌等微生物的干扰,临床检测中,取尿液样本时需要患者只取中段尿,操作较麻烦,尽管如此,尿液中的细菌和微生物的DNA依旧是影响人源DNA提取的干扰项,很大程度影响检测的灵敏度和特异性。因此,有必要进一步提高尿液样本中DNA靶向捕获的特异性,提高目标DNA的纯度。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明的目的在于提供了一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的捕获探针、试剂盒、方法及应用,以解决现有技术目标DNA的捕获特异性差、无法有效避免尿液样本中非目标DNA的非特异性结合等技术问题。
为实现上述目的,本发明提供了一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的捕获探针,所述捕获探针包括核酸部分,所述核酸部分包括SEQ ID NO.1~3所示核苷酸序列中的一者或多者。
优选地,所述捕获探针还包括修饰基团,所述修饰基团选自生物素、荧光素、氨基修饰基团、羧基修饰基团、巯基修饰基团、间臂修饰基团和磷酸化修饰基团中的一种或多种。
优选地,所述捕获探针复合物包括所述的捕获探针,还包括固相载体,所述捕获探针的核酸部分偶联于所述固相载体表面。
本发明提供了一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的试剂盒,其包括所述捕获探针或所述捕获探针复合物。
优选地,所述试剂盒还包括裂解结合液、蛋白酶K、洗涤液、漂洗液、洗脱液中的一种或多种。
本发明还提供了一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的方法,采用所述试剂盒对尿液样本中目标核酸进行特异性捕获,得到富集的目标核酸。
优选地,所述方法包括以下步骤:
S1、对尿液样本进行裂解处理,然后与所述捕获探针或所述捕获探针复合物混合,使捕获探针与尿液样本中目标核酸进行特异性结合,形成捕获探针-目标核酸复合体;
S2、将所述捕获探针-目标核酸复合体经洗涤、漂洗、洗脱,得到富集的目标核酸。
本发明还提供了所述捕获探针或所述捕获探针复合物或所述试剂盒,在制备尿液样本中目标核酸文库或尿路上皮癌检测产品中的应用。
本发明提供了一种尿路上皮癌检测产品,其包括所述试剂盒,还包括DNA甲基化转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品、阴性对照品、内参基因的检测引物对和检测探针中的一种或多种。
优选地,所述PCR反应试剂包括用于检测目标核酸甲基化水平的引物对和检测探针,所述目标核酸选自SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.15中至少一种。
优选地,所述引物对包括SEQ ID NO.16~17、SEQ ID NO.19~20或SEQ ID NO.22~23中至少一组;所述检测探针包括SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.24中至少一种;所述DNA甲基化转化试剂包括亚硫酸氢盐。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,具有以下
有益效果:
(1)采用本发明提供的靶向捕获尿液样本中目标核酸的捕获探针、捕获探针复合物和试剂盒用于靶向捕获尿液样本中目标核酸,能够高效特异捕获目标核酸,快速、特异、高效的对目标核酸进行富集,实现纯化和富集目标核酸的目的。将上述捕获探针、捕获探针复合物或试剂盒应用于尿液样本中尿路上皮癌检测时,能够增加检测特异性和准确性,提高检测灵敏度,降低假阴性结果检出。
(2)本发明通过靶向捕获尿液样本中目标核酸方法可以特异性地捕获尿液样本中的目标核酸,靶向捕获的目标DNA能够满足甲基化检测的需求,且能够避免尿液样品中非目标DNA的非特异性结合,显著提高捕获的特异性,从而提高目标DNA的纯度。
附图说明
图1为捕获探针1的二级结构;
图2为捕获探针2的二级结构;
图3为捕获探针3的二级结构。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
术语“靶向捕获”是指通过探针或引物的形式对目标区域进行筛选性富集的方法,其中探针捕获是根据目标区域设计捕获探针,利用碱基互补配对原理对目标区域进行捕获富集。
术语“目标核酸”是指被捕获,被富集,或被检测的目标核酸序列片段,也叫靶标核酸,或靶标DNA。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子,优选多于三个,并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素,而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。“未甲基化DNA”或“甲基化DNA”还可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增DNA。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100%,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中,术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对,从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来,但是qMSP最终的检测指标为荧光信号,因此,在qMSP反应***中,除加入甲基化检测引物对以外,还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比,qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高,更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段,且该技术不需要凝胶电泳检测,操作更加简便。在本申请公开内容中,进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化检测引物对,若Ct值满足所述要求(例如在尿液样本中Ct≤38),则表明待测样本中目标序列是甲基化的。
本发明提供了一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的捕获探针,上述捕获探针包括核酸部分,上述核酸部分包括SEQ ID NO.1~3所示核苷酸序列中的一者或多者。
上述捕获探针的核酸部分在自由状态时能够形成二聚体,减少其与其他非目标片段的非特异性结合。当捕获探针与目标核酸接触时,基于碱基互补原理可配对的碱基数量更多,其与目标核酸的结合自由能大于二聚体本身的自由能。因此当捕获探针与目标核酸接触后,上述捕获探针原本的二聚体结构被破坏,捕获探针与目标核酸产生特异性结合。
一些实施例中,上述捕获探针的具体信息如下表所示。
核苷酸序列 | 序列(5’-3’) |
SEQ ID NO.1 | CTCCCGCCTCTCCGCCCGGAATTCG |
SEQ ID NO.2 | CCGTCGTTCACCGAGGAGCTTTGGG |
SEQ ID NO.3 | CGTTCGCCTCTTCTCCGGGAGCCAG |
一些实施例中,上述捕获探针还包括修饰基团,上述修饰基团用于将上述捕获探针与磁珠通过共价作用、离子键相互作用、离子与偶极分子间相互作用或亲和作用偶联。
一些实施例中,上述修饰基团选自生物素、荧光素、氨基修饰基团、羧基修饰基团、巯基修饰基团、间臂修饰基团和磷酸化修饰基团中的一种或多种。
一些实施例中,上述修饰基团可位于上述捕获探针5’端或3’端的第一个核苷酸上。
本申请还提供了一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的捕获探针复合物,包括上述捕获探针,还包括固相载体,上述捕获探针的核酸部分偶联于上述固相载体表面。
一些实施例中,上述固相载体与上述捕获探针的核酸部分相连接。较佳实施例中,通过间接方式将上述核酸部分交联到固相载体表面,例如通过链霉亲和素与生物素之间的相互结合作用、主客体配位作用、静电吸附作用等,可以实现探针与固相载体的稳定结合,能够在尿液环境中捕获到特异性的目标核酸,便于通过磁分离实现对目标核酸的分离与纯化。
较佳实施例中,上述固相载体为磁珠。上述捕获探针为链霉亲和素磁珠和生物素修饰的捕获探针。利用链霉亲和素与生物素之间的相互结合作用,可以实现特异性捕获的核酸部分与磁珠的稳定结合,从而便于通过磁分离实现对目标核酸的分离与纯化。
一些实施例中,上述目标核酸选自SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15中至少一种。以GRCh38.p13为参考基因组,SEQ ID NO.9来源于Chr10:101140073-101140523正链,SEQ ID NO.12来源于Chr6:27495288-27495605正链,SEQ ID NO.15来源于Chr10:17229155-17229455正链。本申请提出,上述三个目标核酸是检测尿路上皮癌的有效标记物。
一些实施例中,捕获不同目标核酸的捕获探针的特异性核酸部分如下表所示。
目标核酸 | 捕获探针核酸序列 |
SEQ ID NO.9 | SEQ ID NO.1 |
SEQ ID NO.12 | SEQ ID NO.2 |
SEQ ID NO.15 | SEQ ID NO.3 |
一些实施例中,根据要捕获的目标核酸的数量的不同,可选择对应的捕获探针的核酸序列。在一些实施例中,捕获两种或三种目标核酸,因此捕获探针包括对应的两个或三个核酸序列。在一些实施例中,两个或三个不同的核酸序列可负载在一个磁珠上,也可以分别负载在不同磁珠上,对此没有特别的限定。
按照本发明的另一方面,还提供了一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的试剂盒,其包括上述捕获探针或上述捕获探针复合物。
一些实施例中,上述试剂盒还包括裂解结合液、蛋白酶K、洗涤液、漂洗液、洗脱液中的一种或多种。
一些实施例中,上述裂解结合液包括10mM Tris-HCl、5%SDS、1mol/LEDTA。
一些实施例中,上述洗涤液包括5mM EDTA、20mM Tris-HCl、80%v/v无水乙醇,pH=8.0。
一些实施例中,上述漂洗液包括5mM EDTA、20mM Tris-HCl、80%v/v无水乙醇,该漂洗液的pH值为8.0。
一些实施例中,上述洗脱液包括10mMTris-HCl、1mM EDTA、pH=8.0。
本发明还提供了一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的方法,采用上述试剂盒对上述尿液样本中目标核酸进行特异性捕获,得到捕获富集的目标核酸。
一些实施例中,上述靶向捕获尿液样本中目标核酸的方法,包括以下步骤:
S1、对尿液样本进行裂解处理,然后与上述捕获探针或上述捕获探针复合物混合,使捕获探针与尿液样本中目标核酸进行特异性结合,形成捕获探针-目标核酸复合体;
S2、将上述捕获探针-目标核酸复合体经洗涤、漂洗、洗脱,得到捕获的目标核酸。
作为可选方式,在上述靶向捕获尿液样本中目标核酸的方法中,步骤S1具体包括如下步骤:
S1-1、制备捕获探针复合物:合成捕获探针的核酸部分,然后将核酸部分与磁珠混合,使磁珠与核酸部分相连接,形成捕获探针复合物;
S1-2、对尿液样本进行裂解处理,然后与上述捕获探针复合物混合,使捕获探针与尿液样本中目标核酸特异性结合,形成捕获探针-目标核酸复合体。
较佳实施例中,上述对尿液样本进行裂解处理的方法可以为但不限于:向尿液样本中加入蛋白酶K、裂解结合液进行裂解处理。
本发明还提供了上述捕获探针或上述捕获探针复合物或上述试剂盒,在制备尿液样本中目标核酸文库中的应用。
本发明提供了一种尿液样本中目标核酸文库的制备方法,包括以下步骤:采用上述捕获探针或上述捕获探针复合物或上述试剂盒对尿液样本中的目标核酸进行特异性捕获和PCR扩增,获得所述目标核酸文库。
本发明还提供了上述捕获探针或上述捕获探针复合物或上述试剂盒,在制备尿路上皮癌的检测产品中的应用。
按照本发明的另一方面,还提供了一种尿路上皮癌的检测产品,其包括如上述的试剂盒,以及DNA甲基化转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品、阴性对照品、内参基因的检测引物对和检测探针中的一种或多种。
一些实施例中,上述PCR反应试剂包括用于检测目标核酸甲基化水平的引物对和检测探针,上述目标核酸选自SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12或SEQ IDNO.15中至少一种。
一些实施例中,上述引物对包括SEQ ID NO.16~17、SEQ ID NO.19~0或SEQ IDNO.22~23中至少一组;检测探针包括SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.24中至少一种。
需要说明的是,若一种引物对与上述SEQ ID NO.16~17、SEQ ID NO.19~0、SEQID NO.22~23所示的核苷酸序列具有至少具有85%(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%等)以上的序列一致性,且该引物对同样具有一定的尿路上皮癌检测功能(特异性或灵敏度与本申请引物对相比,相当或略有下降或略有提高或大幅提高等),也在本发明保护范围内。
一些实施例中,上述PCR反应试剂还包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
一些实施例中,上述DNA甲基化转化试剂包括但不限于亚硫酸氢盐。
一些实施例中,上述阳性对照是指其中包含甲基化的目标核酸,用于监测PCR反应试剂的检测性能,上述阴性对照是指其中不包含甲基化的目标核酸,用于监测实验是否受到污染。
一些实施例中,上述试剂盒还可以包括至少一个设备的任何制品(例如,包装或容器)。容器可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其他容器。试剂盒还可以进一步包括用于接收生物样品的适合装置、用于实施在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书。
一些实施例中,上述内参基因可以为但不限于ACTB。一些实施例中,上述内参基因ACTB的检测引物对包括上游引物和下游引物,其中上游引物为:5’-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3’(SEQ ID NO.25),下游引物为:5’-AATAACACCCCCACCCTGC-3’(SEQ ID NO.26),上述内参基因ACTB的检测探针为:5’-GGAGTGGTTTTTGGGTTTG-3’(SEQ IDNO.27)。
一些实施例中,本发明所用检测探针为荧光探针。例如为TaqMan探针,上述目标核酸的检测探针和上述内参基因的检测探针均含有荧光报告基团和荧光淬灭基团,其中检测探针的5’端包含有荧光报告基团,上述各探针的荧光报告基团独立地选自FAM、ROX、CY5、VIC中的任意一种或多种;检测探针的3’端包含有荧光淬灭基团,上述各探针的荧光淬灭基团独立地选自MGB、BHQ1、BHQ-2、BHQ-3中的任意一种或多种。各探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于前述所列举。
一些实施例中,本发明提供的捕获探针或捕获探针复合物或试剂盒可以制备成如下尿路上皮癌的检测产品中的至少一种:试剂、试剂盒、芯片和测序文库。可选地,上述产品可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。
基于本发明公开的内容,本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述目标核酸的甲基化水平进行检测,对尿路上皮癌进行诊断,无论采用何种技术,其都是属于本发明的保护范围。
在可选的实施方案中,上述甲基化水平通过如下至少一种的方法进行检测:甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
以下结合具体实施例,对上述技术方案详细说明。本申请所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用,但不能限制本申请的内容。除非另有说明,以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品,或者可以通过本领域已知方法制备。
实施例1设计基因特异性捕获探针
以GRCh38.p13为参考基因组,分别以区域1:Chr10:101140073-101140523正链(SEQ ID NO.9)为模板设计捕获探针1;以区域2:Chr6:27495288-27495605正链(SEQ IDNO.12)为模板设计捕获探针2;以区域3:Chr10:17229155-17229455正链(SEQ ID NO.15)为模板来设计捕获探针3。
本实施例提供了能形成二聚体的捕获探针组合A,捕获探针组合A由捕获探针1、2、3联用组成。还针对区域1-3分别设计了三条特异性的线性捕获探针4、5、6,组合为捕获探针组合B,作为对照。上述线性捕获探针自身不会形成二级结构。上述捕获探针1~3的序列及各自形成二级结构所需的自由能如表1所示,捕获探针1~3形成的二级结构分别如图1、图2、图3所示。线性捕获探针4~6的序列及各自形成二级结构所需的自由能如表2所示。分析各个捕获探针形成二级结构所用的软件为Primer Premier 5.0。
表1捕获探针1~3
表2线性捕获探针4~6
实施例2分析捕获探针的捕获灵敏性
合成表1-2中的6条捕获探针的核酸部分,且在每条核酸序列的5’端的第一个碱基上进行生物素修饰。购买Dynabeads的商品化链霉亲和素包被的磁珠,将生物素修饰的捕获探针用TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH=8.0)稀释至10ng/μL,得到生物素-探针液,将含有磁珠的磁珠液与生物素-探针液混合,得到磁珠-生物素-探针混合液,混匀磁珠-生物素-探针混合液,然后静置孵育40min使捕获探针与磁珠偶联,再将上述磁珠-生物素-探针混合液置于磁力架上进行吸附,弃上清后,加入与磁珠-生物素-探针混合液同体积的缓冲液(200mM Tris-HCl和100mM NaCl)重悬磁珠,即得到捕获探针溶液备用。
合成目标核酸SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15的DNA片段并等体积混合,使用TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH=8.0)重悬作为捕获模板备用。将捕获模板依次稀释,使每管(600μL)中分别含有102、103、104、105拷贝的靶标DNA片段。每个浓度共制备两组。
用捕获探针组A和捕获探针组B(捕获探针组A、B同实施例1)分别对捕获模板进行捕获。向一组含有0、102、103、104、105拷贝的目标基因片段的捕获模板中加入100μL充分混匀的磁珠偶联的生物素化的捕获探针A的溶液,向另一组捕获模板中加入100μL充分混匀的磁珠偶联的生物素化的捕获探针B的溶液,充分混匀后,室温静置孵育45mim。随后将上述孵育处理后的离心管置于磁力架上吸磁10mim,弃上清,获得磁珠沉淀。向上一步获得的磁珠沉淀中加入1mL漂洗液(5mM EDTA、20mM Tris-HCl、80%v/v无水乙醇,pH=8.0),震荡混匀5s后瞬时离心2~4s,置于磁力架上吸磁2min,弃上清。重复洗涤一次,将残留液体吸干净。最后向含磁珠的离心管中加入40μL洗脱液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH=8.0),轻轻震荡混匀,置于55℃孵育10mim,再吸磁2min,将上清转移至一洁净离心管中,即得所需靶标DNA样本。
用荧光定量PCR法检测两组捕获探针组合富集含不同拷贝数的靶标DNA片段后的回收效果。对于每一条捕获探针,设计引物扩增捕获探针识别的靶标DNA片段,控制扩增子的长度在200bp左右。用于定量分析捕获探针组合A、捕获探针组合B富集回收的靶标DNA片段的扩增引物如表3所示。
表3用于检测捕获探针捕获效果的引物对及其对应的扩增子序列
合成上述引物对并稀释至合适的浓度备用。以合成的SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.15的正链DNA片段为模板,分别使用表3中提供的引物对进行普通PCR反应,以得到含各个扩增子的PCR产物。得到的6种PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后进行胶回收,随后使用Nano Drop 2000超微量分光光度计测定回收产物的浓度,并计算拷贝数。将上述准确定量的各个扩增子进行梯度稀释,作为qPCR反应的标准品备用。
对于捕获探针组合A富集回收的DNA片段,使用qPCR法对其定量。具体地,取捕获探针组合A富集回收的DNA片段10μL作为模板,以引物对1作为扩增引物,使用Fast SYBRTM预混液配置qPCR反应体系,如表4所示,每个样本设置3个复孔。同时,设置标准品反应管,即使用引物对1扩增不同梯度的标准品(0copy/管、10copies/管、102copies/管、103copies/管、104copies/管、105copies/管),用以绘制标准曲线。上述待测管和标准品管的反应体系配置完成后,按照表5所示的反应程序进行PCR扩增,扩增结束后,导出Ct值。根据标准品的拷贝数和对应的Ct值绘制标准曲线,根据待测管的Ct值计算其DNA的拷贝数,并计算使用捕获探针组合A富集回收的区域1(SEQ ID NO.9)总拷贝数。捕获探针组合A富集回收的区域2(SEQID NO.12)、区域3(SEQ ID NO.15)的总拷贝数的检测方法同区域1。
捕获探针组合B富集回收的DNA片段的定量方法同捕获探针组合A。
使用上述6条磁珠偶联的捕获探针分别回收到的目标DNA的拷贝数如表6所示。
表4 qPCR反应体系
组分 | 体积(μL) |
Fast SYBRTM预混液(2×) | 10 |
上游引物(10μM) | 1 |
下游引物(10μM) | 1 |
模板DNA | 5 |
超纯水 | 补至20 |
表5 qPCR反应程序
表6捕获探针富集回收区域1~3基因的拷贝数
由表6可以看出,上述引物对均有拷贝数,所以捕获探针组合A和捕获探针组合B都可以对三个目标DNA实现富集。此外,当目标基因的投入量为102拷贝时,组合A的捕获目标基因的效率在52%到64%之间,组合B的捕获目标基因的效率在26%到42%之间。当目标基因的投入量为103拷贝时,组合A的捕获目标基因的效率在65.9%到76.5%之间,组合B的捕获目标基因的效率在36.3%到58.4%之间。当目标基因的投入量为104拷贝时,组合A的捕获目标基因的效率在75.2%到76.6%之间,组合B的捕获目标基因的效率在59.8%到63.5%之间。当目标基因的投入量为105拷贝时,组合A的捕获目标基因的效率在75.5%到76.8%之间,组合B的捕获目标基因的效率在54.8%到70.1%之间。上述结果表明,具有二聚体结构的捕获探针组合A可以对人工合成的基因模板进行高效率捕获,且捕获效率优于普通线性捕获探针(捕获探针组合B)。
实施例3分析捕获探针靶向捕获基因的捕获特异性
考虑到尿液样本中含有大量的细菌来源的DNA,本实施例使用靶向捕获探针富集回收尿液样本中区域1~3目标DNA片段,并分析表1中列举的捕获探针靶向捕获基因的捕获特异性。
1.尿液样本DNA的收集
收集约50mL健康人尿液样本,利用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)进行尿液样本DNA的提取,具体操作参考试剂盒说明书完成。
2.qPCR分析捕获探针靶向富集尿液样本中目标DNA的灵敏度和特异性
1)捕获探针靶向富集尿液样本中目标DNA的灵敏度检测方法:
以表3中提供的核苷酸序列作为引物对,使用qPCR法分别扩增不同捕获探针富集提取的尿液DNA样本,同时制作标准曲线,对样本中区域1~3进行定量分析。具体的检测方法同实施例2,检测结果如表7所示。
表7捕获探针组合富集提取相同尿液样本中区域1~3基因的拷贝数
由表7可以看出,使用自身能形成二聚体的捕获探针组合A从复杂的尿液样本中富集提取区域1~3人源基因的效果良好,能够实现高效率捕获。对于相同的尿液样本,捕获探针组合A捕获基因的拷贝数与线性捕获探针(捕获探针组合B)相比,无统计学差异,捕获探针形成的二聚体不会影响捕获探针的捕获灵敏度。
2)捕获探针靶向富集尿液样本中目标DNA的特异性检测方法:
细菌16S rRNA基因保守性极强,其保守区为所有细菌共有,且细菌之间无差别,因而被称为分子化石。若在使用靶向富集提取的DNA产物中检测到细菌16S rRNA则表明样本中存在细菌DNA污染。对于使用不同捕获探针组合富集提取的尿液DNA样本,分别加入扩增细菌16S rRNA基因保守区的引物对(上游引物为:5’-GCAACGCGAAGAACCTTACC-3’,下游引物为:5’-ACGTCATCCCCACCTTCCT-3’),反应液中其它成分按照表5配置,再按照表6提供的反应程序进行扩增,每个样本设置3个复孔。由于在实验过程中细菌污染十分容易出现,因此要设置不加模板的阴性对照孔,以保证实验结果准确、可靠。按照上述方法扩增不同捕获探针组合富集提取的尿液样本中16SrRNA基因的拷贝数如表8所示。
表8捕获探针组合富集提取相同尿液样本中16S rRNA的拷贝数
由表8可以看出,使用本发明设计的捕获探针组合A靶向提取尿液样本中的目标核酸,样本中不存在细菌DNA污染,而使用传统的线性捕获探针组合B,提取的样本中含有微量的细菌DNA。与传统的线性捕获探针相比,捕获探针从尿液样本中富集提取目标基因的特异性更佳,所得的目标基因纯度更高,能有效提高检测的准确性。
实施例4捕获探针在尿液样本DNA检测尿路上皮癌中的应用
1)甲基化特异性荧光定量法(qMSP)检测甲基化水平
以GRCh38.p13为参考基因组,以所述3个目标区域中的正链DNA分子为模板设计适用于荧光定量PCR扩增的引物对和检测探针。具体实验步骤包括:
样本收集:样本为尿液样本,收集了43例确诊为尿路上皮癌患者的尿液样本,收集52例健康人尿液样本,收集到的每份尿液样本的体积大于50mL,在采样后48h内进行DNA提取。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
DNA样本的提取同实施例3,将提取的DNA进行亚硫酸氢钠化学修饰,将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶同时保持甲基化胞嘧啶不变。DNA转化及纯化步骤采用ZYMO公司提供的EZ DNAMethylation-Gold Kit,具体操作参考试剂盒说明书完成。
2)甲基化特异性荧光定量PCR
甲基化检测引物对和检测探针设计:
分别以区域1~3经亚硫酸氢盐转化后的序列为模板,设计甲基化检测引物对和检测探针用以扩增目标区域,检测引物对、检测探针的序列如表9所示。
表9检测引物对、检测探针的核苷酸序列
qMSP扩增:
在对样本进行qMSP分析之前,需验证甲基化检测引物对的扩增性能。具体地,102拷贝/uL、103拷贝/uL、104拷贝/uL、105拷贝/uL、106拷贝/uL含亚硫酸氢盐转化后的各个目标区域的质粒,以及按上述梯度稀释的含转化后的内参基因ACTB质粒(上游引物为:AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.25),下游引物为:AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ IDNO.26),检测探针为:GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.27))被扩增以构建标准曲线,并计算各个目标区域的扩增效率,表9提供的检测引物对的扩增效率均处于90%~110%之间。
进行qPCR反应检测样本时,需要同时设置阴性对照和阳性对照,以保证实验体系是可靠的。阴性对照管:按照表10的配方配置PCR反应体系,模板为TE缓冲液。阳性对照管:按照表10的配方配置PCR反应体系,模板为含ACTB(转化后序列)和各目标区域(转化后序列)的人工合成的质粒。阳性对照模板的制备方法:将ACTB基因经亚硫酸氢盐转化后的序列和各目标区域经亚硫酸氢盐转化后的序列分别克隆至pUC57上,形成人工合成质粒,将各个质粒均稀释到103拷贝/微升。例如区域1的阳性对照模板为:103拷贝/微升的含转化后ACTB基因的质粒和103拷贝/微升的含区域1转化后序列的质粒1:1混合而成。
表10qMSP反应体系
组分 | 规格 | 体积(μL) |
Platinum IIPCR缓冲液 | 5× | 5 |
区域1、2、3上游引物 | 10μM | 分别添加0.5 |
区域1、2、3下游引物 | 10μM | 分别添加0.5 |
区域1、2、3检测探针 | 10μM | 分别添加0.5 |
ACTB上游引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB下游引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB检测探针 | 10μM | 0.5 |
PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase | / | 0.5 |
待测样本DNA | / | 5 |
超纯水 | / | 补至25 |
表11 qMSP反应程序
检测探针均为TaqMan探针,目标区域1、2、3的检测探针5’端的荧光报告基团分别为ROX、FAM、CY3;3’端的荧光淬灭基团均为MGB,ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC,3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶(Invitrogen,Cat:14966005)进行PCR扩增,PCR反应体系的配置如表10所示,按照表11展示的扩增程序进行PCR扩增。
Ct值读取:PCR完成后,调整基线,将一次PCR中样本最小Ct值提前1~2个循环前的荧光值设置为基线值,将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处,得到样本各个基因的Ct值。
质量控制:阴性对照要无扩增,阳性对照要有明显的指数增长期,且阳性对照各基因的Ct值应在26~30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35,阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后,表明本次实验有效,可进行下一步样本结果的判定。否则,当次实验无效,须重新进行检测。
PCR结果分析和判读方法:对于尿液脱落细胞样本,若待测样本在某一检测区域的Ct值≤38,即认为该样本在此区域为甲基化阳性,若待测样本在某一检测区域的Ct值>38,则认为该样本在此区域为甲基化阴性。在多区域联合检测时,若待测样本在多区域中至少一个区域为甲基化阳性,则该样本为尿路上皮癌阳性样本,仅当待测样本在多区域中的三个区域都为甲基化阴性,则该样本为尿路上皮癌阴性样本。捕获探针组合A、B捕获的区域1+2+3的甲基化状态及检测灵敏度和特异性如表12所示。
表12捕获探针组合捕获的区域1+2+3的甲基化状态及检测灵敏度和特异性
由表12可以看出,通过qMSP法检测捕获探针组合B捕获的区域1+2+3的甲基化状态,其检测尿路上皮癌患者尿液样本的灵敏度为93.02%,检测健康人尿液样本的特异性为96.15%。由实施例3可知,捕获探针组合A能够从尿液样本中高效率捕获目标基因,且捕获特异性高于捕获探针组合B,捕获得到的目标基因纯度更高,能有效提高检测的准确性,因此检测捕获探针组合A捕获的区域1+2+3的甲基化水平的灵敏度及特异性更高。具体地,本实施例中,通过qMSP法检测捕获探针组合A捕获的区域1+2+3的甲基化水平,检测尿路上皮癌患者尿液样本的灵敏度高达97.67%,检测健康人尿液样本的特异性高达98.08%,具有优异的检测性能,能够有效区分尿路上皮癌患者和健康人。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的捕获探针,其特征在于,所述捕获探针包括核酸部分,所述核酸部分包括SEQ ID NO.1~3所示核苷酸序列中的一者或多者。
2.根据权利要求1所述的捕获探针,其特征在于,所述捕获探针还包括修饰基团,所述修饰基团选自生物素、荧光素、氨基修饰基团、羧基修饰基团、巯基修饰基团、间臂修饰基团和磷酸化修饰基团中的一种或多种。
3.一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的捕获探针复合物,其特征在于,所述捕获探针复合物包括权利要求1或2所述的捕获探针,还包括固相载体,所述捕获探针的核酸部分偶联于所述固相载体表面。
4.一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1或2所述的捕获探针,或包括权利要求3所述的捕获探针复合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括裂解结合液、蛋白酶K、洗涤液、漂洗液、洗脱液中的一种或多种。
6.一种靶向捕获尿液样本中目标核酸的方法,其特征在于,采用权利要求4或5所述的试剂盒对尿液样本中目标核酸进行特异性捕获,得到富集的目标核酸。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、对尿液样本进行裂解处理,然后与所述捕获探针或所述捕获探针复合物混合,使捕获探针与尿液样本中目标核酸进行特异性结合,形成捕获探针-目标核酸复合体;
S2、将所述捕获探针-目标核酸复合体经洗涤、漂洗、洗脱,得到富集的目标核酸。
8.权利要求1或2所述的捕获探针或权利要求3所述的捕获探针复合物或权利要求4或5所述的试剂盒,在制备尿液样本中目标核酸文库或尿路上皮癌检测产品中的应用。
9.一种尿路上皮癌检测产品,其特征在于,其包括权利要求4或5所述的试剂盒,还包括DNA甲基化转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品、阴性对照品、内参基因的检测引物对和检测探针中的一种或多种;
所述PCR反应试剂包括用于检测目标核酸甲基化水平的引物对和检测探针,所述目标核酸选自SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.15中至少一种。
10.根据权利要求9所述的检测产品,其特征在于,所述引物对包括SEQ ID NO.16~17、SEQ ID NO.19~20或SEQ ID NO.22~23中至少一组;所述检测探针包括SEQ ID NO.18、SEQID NO.21或SEQ ID NO.24中至少一种;所述DNA甲基化转化试剂包括亚硫酸氢盐。
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