CN107397042A - 一种复合型动物肠道调节制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合型动物肠道调节制剂及其制备方法，主要由益生菌和益生元复配组成，所述益生菌包括丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌，益生元包括荔枝多酚和谷氨酰胺。本发明所述的复合微生态制剂，利用荔枝多酚和谷氨酰胺促进丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌在肠道内增殖，从而发挥双向调节肠道菌群的功效。所述复合微生态制剂其稳定性良好，可调节动物肠道菌群，提高动物抗病能力，降低腹泻率和死亡率，并且能够保持较高的存活率，适合饲料工业和畜牧养殖业的需求。
Description
技术领域
本发明属于微生物饲料添加剂技术领域，具体涉及一种复合型动物肠道调节制剂及其制备方法。
背景技术
长期以来，抗生素的滥用给畜牧业和人类的健康带来了严重威胁。微生态制剂作为一种新兴的饲料添加剂和抗生素替代品，具有直接补入外源性有益菌，调节动物自身肠道微生态平衡，抑制有害菌，增强机体免疫力，从而能够促进动物的健康成长等作用。国内外学者对其进行了大量的研究，并运用到动物养殖中，许多研究和临床应用发现，益生菌在调节动物肠道微生物菌群平衡，预防疾病、提高饲料转化，提高动物免疫力，提高动物生产性能和保护生态环境等方面有着其他添加剂不可替代的作用。因此加快开发、推广新型无公害、可以有效防治疾病的微生态制剂产品可推动养殖业健康持续发展。
近年来，市场上基于改善动物肠道健康的各类饲料添加剂种类繁多，如益生菌、寡糖、酸化剂、丁酸类和谷氨酰胺等，市场是已有部分针对动物养殖的益生菌和合生素产品，然而饲料加工过程中制粒或膨化温度很高，容易导致益生菌失活，益生效果难以发挥，因此，需要筛选一些能在高温条件下存活或者灭活条件下也能发挥益生效果的菌株。丁酸梭菌作为一种新型益生菌，具有调整肠道菌落平衡，促进肠道有益菌群增殖，增强免疫功能，在肠道产生益生产物和促生长等功能，同时丁酸梭菌产生内生芽孢，稳定性好，能耐热耐酸，耐胆盐、不受胃酸、胆汁酸等影响，因而通过消化道不失活，在体外室温下可保存三年以上不失效，在饲料生产加工和贮藏中优势明显，为饲用益生菌的理想菌株，并且丁酸梭菌对部分抗生素如青霉素、氨苄西林、链霉素、庆大霉素、氯霉素等有一定的抗性，且大量实验证明它无任何毒副作用，已被广泛用于医药、功能性保健食品和动物饲料的添加剂及植物肥料。
乳酸菌作为微生物类饲料添加剂是则应用最为广泛、效果最好的一类。我国农业部公布的饲料级微生物添加剂中，大部分是乳酸菌，它是多种动物消化道主要的共生菌，能形成正常菌群。在胃肠道400多种微生物中，乳酸菌约占 10%，是肠道正常菌群的主要成员。乳酸菌已知的生理功能主要表现为：阻止病原菌对肠道的入侵和定植，抑制病原菌和抗感染，维持肠道的微生态平衡，预防和抑制肿瘤的发生，增强机体免疫力，促进消化，合成氨基酸和维生素，降低胆固醇，抑制内毒素的产生，延缓衰老和抗辐射等。其中以乳杆菌属、双歧杆菌属为代表，并已被证实在临床上能够治疗和预防人和动物的某些肠道疾病或者起保健作用。嗜酸性乳酸菌作为乳酸菌最主要的有益菌，具有良好耐受胃酸及胆汁浓度的能力并对致病性埃希氏大肠杆菌有抑制作用，是益生菌的良好备用菌株和是重要的健康促进因子，其特殊的嗜酸性能可以更好的帮助肠道抵御疾病，并维持肠道正常功能。
由于植物多酚具有独特的功能活性，已成为当今研究开发的热点，并在现实生产中得到了广泛地应用。荔枝多酚不仅具有一般多酚的特性和生理功能，如抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老、提高免疫力等，而且具有特殊的抗炎症和抗过敏及抗感染的作用，主要表现在通过提高肠道免疫能力，改善肠道功能紊乱，从而提高肠道微生物有益菌群的数量；抗氧化应激、抗过敏；荔枝多酚及其代谢物如一些特殊的酚酸具有抗炎症的效果，能显著减少动物粪便中有毒、有害及臭味物质的含量，从而改善了环境卫生。谷氨酰胺是小肠细胞代谢的主要能源。体内研究表明，谷氨酰胺对肠上皮细胞提供能量的同时，能促进肠道细胞修复，小肠绒毛恢复及维持正常的肠黏膜免疫功能，从而有助于维持肠道黏膜的完整性和有利于肠道健康及营养物质的充分吸收。虽然荔枝多酚和谷氨酰胺有益于健康的作用已被广大民众所接受，但是在预防动物疾病方面的研究还刚起步。若将益生菌、荔枝多酚和谷氨酰胺配伍优化，发挥其协调作用，具有促生长及增强内源性和外源性益生菌活性的双重作用，可以有效增强肠道免疫的作；具有显著地抗氧化应激和改善肠道功能紊乱，增加肠道有益菌群，势必能很好地改善肠道健康，减少肠道疾病发生，其使用效果或优于抗生素和单一抗生素，同时还不存在药物残留等问题。开发饲用益生菌和荔枝多酚的复合微生态制剂制剂具有重要的科研和生产应用价值，其为畜牧业的健康发展提供一条新思路和新途径。
发明内容
为解决和弥补现有技术中存在的问题与缺陷，本发明提供一种复合型动物肠道调节制剂及其制备方法，所得到的制剂可以降低小鼠腹泻率，提高机体抗氧化能力和促进肠道优势菌群的形成。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种复合型动物肠道调节制剂，由益生菌和益生元复配而成，所述益生菌包含丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，所述益生元为荔枝多酚和谷氨酰胺。
本发明的另一个目的，是提供一种复合型动物肠道调节制剂的制备方法，技术方案如下：
一种复合型动物肠道调节制剂的制备方法，具体实施步骤如下：
S1.丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌的培养：将丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌种子分别从试管斜面培养基中接种到装有液体培养基的锥形瓶，于37℃下培养48h；
S2.发酵：将S1中处于对数期的丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌分别接种到发酵培养基中进行发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为20h，发酵后冷冻离心收集菌体；
S3.原材料混合：将S2中所得的丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌菌体按质量比1:1混合，然后加入荔枝多酚和谷氨酰胺混匀，荔枝多酚和谷氨酰胺的添加量均为5wt%；
S4.冷冻干燥：向S3混合均匀后的原材料中继续添加10wt%脱脂乳、5wt%海藻糖、10wt%麦芽糊精和5wt%菊粉作为冷冻保护剂，搅拌均匀后预冻，然后将混合物迅速转移至冷冻干燥机进行冻干，制得复合制剂。
进一步地，步骤S1中丁酸梭菌液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，半胱氨酸0.5g，酵母浸粉3.0g，葡萄糖5.0g，CH3COONa·3H2O 3.0g，NaCl 5.0g，可溶性淀粉1.0g和蒸馏水1L，pH 6.5-7.0，121℃高压灭菌15-20min。
进一步地，步骤S1中嗜酸乳酸菌液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉8.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4 2.0g，Na3C6H5O7 2.0g，CH3COONa·3H2O 5.0g，MgSO4.7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐温80 1ml和蒸馏水1L，pH 5.5-6.0，121℃高压灭菌15-20min。
进一步地，步骤S2中丁酸梭菌发酵培养基配方为：葡萄糖12.0-15.0g，蛋白胨12.0-15.0g，酵母浸粉10.0-12.0g，牛肉浸粉5.0-8.0g，玉米粉5.0-7.0g，半胱氨酸0.5-1.0g，NaCl 0.5-2.0g，CH3COONa·3H2O 1.0-3.0g，MgSO4·7H2O 1.0-2.0g，(NH4)2SO4 1.0-2.0g和蒸馏水IL，pH值6.8-7.2，121℃高压灭菌15-20min。
进一步地，步骤S2中嗜酸乳酸菌发酵培养基配方为：葡萄糖16.0-20.0g，蛋白胨10.0-12.0g，酵母浸粉6.0-8.0g，玉米粉10.0-12.0g，CH3COONa·3H2O 5.0-7.0g，Na3C6H5O72.0-3.0g，MgSO4·7H2O 0.5-1.0g，MnSO4·4H2O 0.5-1.0g，吐温80 0.5-1.0ml和蒸馏水1L，pH 5.5-6.0，121℃高压灭菌15-20min。
进一步地，发酵后丁酸梭菌菌株浓度可达107CFU/ml，嗜酸乳酸菌菌株浓度可达1010CFU/ml，干燥后产品中活菌数达109/克以上。
进一步地，步骤S2中离心条件为：温度为4℃，转速为4000rpm，离心时间为5min。
进一步地，步骤S2中冷冻干燥条件为：预冻温度为-80℃，预冻时间2h；冷冻温度-82℃，压力为3pa。
本发明的第三个目的在于，提供复合型动物肠道调节制剂在动物腹泻防治方面的应用。
与现有技术相比，本发明有益效果如下：
1) 本发明中的丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌采用分开发酵后混合的方法，能最大限度的提高菌株发酵量。
2) 多种益生菌和益生元高效配伍，起到了功能性协同作用，能增强机体肠道免疫的作用，能显著地抗氧化应激和改善肠道功能紊乱，增加肠道优势菌群含量和优化肠道微生物菌群结构，提高动物抗病能力，降低腹泻率和死亡率。
附图说明
图1为小鼠十二指肠组织病理学HE染色切片图。
具体实施例
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但并不对本发明做任何形式的限定，凡在发明精神和原则之内做任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所使用试剂和材料均为市购。
实施案例1 一种复合型动物肠道调节制剂的制备
1.1 材料准备
(1)菌株
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，保藏编号为GIMCC GIM 1.676，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，保藏编号为GIMCC GIM 1.730购于广东省微生物研究所菌种保藏中心。
(2)荔枝多酚
由荔枝壳中提取，纯度为90%以上。
(3)培养基
①嗜酸乳酸菌液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉8.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4 2.0g，Na3C6H5O7 2.0g，CH3COONa·3H2O 5.0g，MgSO4.7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O0.05g，吐温80 1ml和蒸馏水1L，pH 5.5-6.0，121℃高压灭菌15-20min。
②梭菌增菌液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，半胱氨酸0.5g，酵母浸粉3.0g，葡萄糖5.0g，CH3COONa·3H2O 3.0g，NaCl 5.0g，可溶性淀粉1.0g和蒸馏水1L，pH 6.5-7.0，121℃高压灭菌15-20min。
③嗜酸乳酸菌发酵培养基：葡萄糖16.0-20.0g，蛋白胨10.0-12.0g，酵母浸粉6.0-8.0g，玉米粉10.0- 12.0g，CH3COONa·3H2O 5.0-7.0g，Na3C6H5O7 2.0-3.0g，MgSO4·7H2O0.5-1.0g，MnSO4·4H2O 0.5-1.0g，吐温-80 0.5-1.0mL和蒸馏水1L，pH 5.5-6.0，121℃高压灭菌15-20min。
④丁酸梭菌发酵培养基：葡萄糖12.0-15.0g，蛋白胨12.0-15.0g，酵母浸粉10.0-12.0g，牛肉浸粉5.0-8.0g，玉米粉5.0-7.0g，半胱氨酸0.5-1.0g，NaCI 0.5-2g，CH3COONa·3H2O 1.0-3.0g，MgSO4·7H2O 1.0-2.0g，(NH4)2SO4 1.0-2.0g和蒸馏水1L，pH值6.8-7.2，21℃高压灭菌15-20min。
1.2 制备方法
一种复合型动物肠道调节制剂的制备方法，具体实施步骤如下：
S1.丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌的培养：将丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌种子分别从试管斜面培养基中接种到装有液体培养基的锥形瓶，于37℃下培养48h；
S2.发酵：将S1中处于对数期的丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌分别接种到发酵培养基中进行发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为20h，制成嗜酸乳杆菌菌落数为1010～1011 cfu/mL的菌液，丁酸梭菌菌落总数为106～107 cfu/mL的菌液，发酵后冷冻离心收集菌体，其中离心条件为：温度为4℃，转速为4000rpm，离心时间为5min，冷冻干燥条件为：预冻温度为-80℃，预冻时间2h；冷冻温度-82℃，压力为3pa；
S3.原材料混合：将S2中所得的丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌菌体按质量比1:1混合，然后加入荔枝多酚和谷氨酰胺混匀，荔枝多酚和谷氨酰胺的添加量均为5wt%；
S4.冷冻干燥：向S3混合均匀后的原材料中继续添加10wt%脱脂乳、5wt%海藻糖、10wt%麦芽糊精和5wt%菊粉作为冷冻保护剂，搅拌均匀后预冻，然后将混合物迅速转移至冷冻干燥机进行冻干，制得复合制剂。
测得复合微生态制剂的活菌数为1.52×109/克。
实施案例2复合微生态制剂在动物腹泻防治方面的应用
2.1 小鼠腹泻实验
（1）实验处理
SPF级昆明小鼠，静养7天后，随机分为4个实验处理组：模型组、丁酸梭菌组、嗜酸乳酸菌调节制剂组。实验周期为14 d，于实验第1 d至第14 d按400mg/kg.bw给予受试样品，作为对比，模型组给予等量的生理盐水。在实验的第10 d利用蓖麻油药物灌胃小鼠，建立小鼠腹泻模型，测定腹泻指标。第14 d，采集血液分离血清，采集回肠和无菌采集粪便。血清用于抗氧化指标（SOD、GSH-Px及CAT）测定，回肠用于制作HE染色切片，进行肠道组织形态学观察，粪便用于肠道菌群聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction，denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)检测，肠道微生物多样性观察。
（2）实验数据的处理
所有实验数据均使用SPSS17.0统计软件分析。多组间比较采用单因素方差分析(One-way Anova)，两两比较采用Duncan法。结果以均数±标准差表示，p<0.05为差异有显著性意义。
（3）实验结果
小鼠实验结果如下表1、表2、表3和表4所示，表中同一列不同字母表示显著性差异(p<0.05)：
表1 腹泻指标
| 组别 | 开始腹泻时间(min) | 稀便重量(g) | 腹泻平均次数 | 稀便率(%) | 腹泻抑制率(%) |
| 模型组 | 75.42±8.62a | 0.58±0.06b | 8.62±1.40c | 0.58±0.06b | - |
| 丁酸梭菌组 | 84.50±5.03a | 0.53±0.08b | 7.50±1.58 bc | 0.54±0.03b | 13 |
| 嗜酸乳杆菌组 | 96.37±8.10b | 0.53±0.03b | 6.55±1.81ab | 0.53±0.09ab | 24 |
| 调节制剂组 | 117.33±15.06c | 0.42±0.42a | 5.55±1.01a | 0.43±0.04a | 36 |
表2：抗氧化指标
表3：肠道组织形态指标
表4肠道微生物多样性指数分析
| 组别 | 丰富度（n） | 均匀度 | Shannon指数 |
| 模型组 | 17.00±2.19a | 0.88±0.02a | 2.59±0.09a |
| 丁酸梭菌组 | 21.50±2.43ab | 0.88±0.02ab | 2.68±0.05ab |
| 嗜酸乳杆菌组 | 23.67±3.21b | 0.90±0.05 ab | 2.85±0.02 ab |
| 调节制剂组 | 丰富度（n） | 均匀度 | Shannon指数 |
由上表可见，调节制剂对小鼠蓖麻油腹泻模型体现出明显的抗腹泻、抗氧化效果，且效果优于单一使用益生菌；可以增加十二指肠的V/C指数，见表3所示，在一定程度上能增进肠道的消化吸收能力；如表4所示，可以增加肠道中菌群丰富度、均匀度、Shannon指数，能够增加肠道菌群的数量，增大菌群的多样性，增强微生态的稳定性。
由上述结果可见，本发明通过特定的益生元配伍益生菌，获得了在肠道菌群双向调节方面具有显著防治腹泻功效的肠道调剂制剂。
本发明的肠道调节制剂在小鼠腹泻实验中具体表现为：可有效抑制小鼠腹泻率，腹泻抑制率达36%，效果优于单一使用益生菌；可有效提高机体抗氧化能力，如血清中SOD、GSH-Px及CAT活力；提高十二指肠的V/C指数，在一定程度上能增进肠道的消化吸收能力；增加肠道优势菌群含量和优化小鼠肠道微生物菌群结构。
Claims (10)
1.一种复合型动物肠道调节制剂，其特征在于，由益生菌和益生元复配而成，所述益生菌包含丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌，所述益生元为荔枝多酚和谷氨酰胺。
2.权利要求1所述肠道调节制剂的制备方法，其特征在于，具体实施步骤如下：
S1.丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌的培养：将丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌种子分别从试管斜面培养基中接种到装有液体培养基的锥形瓶，于37℃下培养48h；
S2.发酵：将S1中处于对数期的丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌分别接种到发酵培养基中进行发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为20h，发酵后冷冻离心收集菌体；
S3.原材料混合：将S2中所得的丁酸梭菌和嗜酸乳酸菌菌体按质量比1:1混合，然后加入荔枝多酚和谷氨酰胺混匀，荔枝多酚和谷氨酰胺的添加量均为5wt%；
S4.冷冻干燥：向S3混合均匀后的原材料中继续添加10wt%脱脂乳、5wt%海藻糖、10wt%麦芽糊精和5wt%菊粉作为冷冻保护剂，搅拌均匀后预冻，然后将混合物迅速转移至冷冻干燥机进行冻干，制得复合制剂。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S1中丁酸梭菌液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，半胱氨酸0.5g，酵母浸粉3.0g，葡萄糖5.0g，CH3COONa·3H2O3.0g，NaCl 5.0g，可溶性淀粉1.0g和蒸馏水1L，pH 6.5-7.0，121℃高压灭菌15-20min。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S1中嗜酸乳酸菌液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉8.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4 2.0g，Na3C6H5O72.0g，CH3COONa·3H2O 5.0g，MgSO4.7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐温80 1ml和蒸馏水1L，pH 5.5-6.0，121℃高压灭菌15-20min。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S2中丁酸梭菌发酵培养基配方为：葡萄糖12.0-15.0g，蛋白胨12.0-15.0g，酵母浸粉10.0-12.0g，牛肉浸粉5.0-8.0g，玉米粉5.0-7.0g，半胱氨酸0.5-1.0g，NaCl 0.5-2.0g，CH3COONa·3H2O 1.0-3.0g，MgSO4·7H2O1.0-2.0g，(NH4)2SO4 1.0-2.0g和蒸馏水IL，pH值6.8-7.2，121℃高压灭菌15-20min。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S2中嗜酸乳酸菌发酵培养基配方为：葡萄糖16.0-20.0g，蛋白胨10.0-12.0g，酵母浸粉6.0-8.0g，玉米粉10.0-12.0g，CH3COONa·3H2O 5.0-7.0g，Na3C6H5O7 2.0-3.0g，MgSO4·7H2O 0.5-1.0g，MnSO4·4H2O 0.5-1.0g，吐温80 0.5-1.0ml和蒸馏水1L，pH 5.5-6.0，121℃高压灭菌15-20min。
7.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，发酵后丁酸梭菌菌株浓度可达107CFU/ml，嗜酸乳酸菌菌株浓度可达1010CFU/ml，干燥后产品中活菌数达109/克以上。
8.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S2中离心条件为：温度为4℃，转速为4000rpm，离心时间为5min。
9.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S2中冷冻干燥条件为：预冻温度为-80℃，预冻时间2h；冷冻温度-82℃，压力为3pa。
10.权利要求1所述复合型动物肠道调节制剂在动物腹泻防治方面的应用。
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