CN111500743B - 一种提高中国和牛里脊重量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高中国和牛里脊重量的方法，采用的SNP标记的位点为国际牛参考基因组UMD3.1版本22号染色体上第54648801个核苷酸位点，该位点的碱基是C或A。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，提高中国和牛的里脊重量，加快牛遗传改良进展从而有效提高肉牛育种的经济效益。

Description

一种提高中国和牛里脊重量的方法

技术领域

本发明涉及中国和牛染色体基因位点与相关性状分析，具体涉及中国和牛染色体上与里脊重量相关的SNP位点及其应用。

背景技术

肉牛业是我国畜牧业的重要组成部分，其发展水平是国家农业发展水平的重要标志，对我国菜篮子工程建设、增加农民收入、保障人民肉食消费安全和社会稳定具有重大意义。生产效率方面，美国及加拿大等肉牛业发达国家的肉牛平均胴体重达340千克以上，多在15-18月龄屠宰，而我国只有154千克，屠宰时间为18-24月龄，可见我国肉牛生产效率远远低于发达国家。中国和牛是和牛与复州牛的杂交后代，复州牛是中国辽宁省的当代品种，旨在生产高档牛肉，生产定位为高档收入群体。为加速我国肉牛分子育种进程，采用全基因组关联分析鉴定影响中国和牛的里脊重量性状的显著位点。有研究表明，里脊重量属于中等遗传力性状，约0.39，因此，利用遗传手段对资源群体中国和牛里脊重量进行改良是可行的。里脊重量是受多个基因控制的数量性状，牛基因组上存在大量影响里脊重量的数量性状基因座(quantitative trait loci,QTLs)。目前，利用全基因组关联分析(genome-wideassociation study,GWAS)的方法已在牛基因组上鉴别到超过诸多与里脊重量相关的QTLs和大量单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphisms,SNPs)，将其中具有显著效应的SNP加入到分子标记辅助选择(marker assisted selection,MAS)、基因组选择(Genomic selection，GS)中则能显著提高里脊重量的遗传改良进展，进而提高后代肉牛里脊重量，提高牛肉产量，增强养殖企业商品牛肉生产的市场竞争力。

发明内容

本发明本发明的目的在于提供一种牛的遗传改良的方法。通过GWAS分析策略鉴别到了影响中国和牛里脊重量的显著SNP，将其用于分子标记辅助选择和基因组选择中，选择对提高里脊重量有利的基因型进行留种，从而逐代提高优势等位基因的基因频率，则能加快种牛育种改良的进程，为肉牛养殖带来巨大经济效益。

本发明是这样实现的：

所述方法包括：确定种牛资源群体中的种牛的上述的影响牛里脊重量的分子标记的位点，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述种牛资源群体中选择国际牛参考基因组UMD3.1版本22号染色体上第54648801位点为CC和CA、AA基因型的种牛个体，淘汰在第54648801该位点为CC基因型的牛个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而提高后代牛的里脊重量。

具体包括以下步骤：

(1)提取待测牛的基因组DNA；

(2)采用权利要求3所述的引物对，将所述待测牛的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

(4)基于所述测序结果，确定所述待测牛的如权利要求1或2所述的SNP标记的基因型。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明研究并确定与牛里脊重量相关的分子标记，验证其对里脊重量的影响效应，最终建立高效准确的基因组选择育种技术，将其应用于种牛提高里脊重量的遗传改良中，从而提高后代牛的里脊重量，提高产肉量，进而增加养殖企业市场竞争力。

附图说明

图1为中国和牛在22号染色体上关于里脊重量的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示牛的染色体编号(bp)；纵坐标表示-logP值。

图2为不同基因型中国和牛的里脊重量。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明的上述发明目的具体是这样实现的：

实施例1

1、实验动物

本发明所使用的实验牛群群体均来自辽宁省大连雪龙股份有限公司的中国和牛462头，为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牛遗传育种创新团队组建的中国和牛资源群体。

本试验共选取该资源群体中462头中国和牛。中国和牛资源群体每年进行扩群，新增个体一般经历出生、育肥和屠宰3个阶段。每年3-5月出生的犊牛经过一段时间的放养管理后，在同年7月份由牛遗传育种创新团队进行统一初生重和体尺测量，并同时对基础母牛进行测量。同年10月份将5～9月龄的青年牛进行统一集中育肥，并收集生长发育性状的表型数据，同时左右用于Illumina BovineHD芯片基因分型获得基因型数据。当所有个体育肥期达24-30个月时，即第三年的11月份左右，对所有中国和牛进行分批屠宰。屠宰过程严格按照《肉类采购规范》执行，屠宰数据、胴体数据和肉质数据严格按照GB/T 27643-2011《屠宰后胴体性状和肉质性状测定指南》的要求进行测定。

2、样本采集

用采血管收集上述牛群体所有个体静脉血50ml，置于-80℃冰箱保存备用。

3、牛全基因组770K高密度芯片SNP判型

从上述资源群体中选取的462头肉用西门塔尔牛中的每个个体采集静脉血50ml，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μl已提取好的待测DNA样品与2μl Loading Buffer混合，上样到1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。

DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，根据公司标准流程进行牛全基因组Illumina BovineHD芯片770K SNP芯片(Illumina,美国)基因型判定。利用PLINK v1.90软件对所有样本770K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的SNP，最终得到507,812个SNP的有效基因型数据。

4、全基因组关联(GWAS)分析

为了消除群体层化效应，本发明采用压缩线性混合模型单点回归分析并结合R语言GAPIT软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用错误发现率法(false discovery rate,FDR)确定SNP与里脊重量关联程度的显著性阈值：

P＝FDR×n/m

FDR设为0.01，n是P值<0.01的SNP数量，m是总SNP的数量。

GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在肉用西门塔尔牛22号染色体中存在显著影响里脊重量的位点，最强关联的SNP为g.97C>A(P＝7.24E-6)。

5、不同基因型与里脊重量表型的关联性分析

根据表1可知，分子标记的SNP位点g.97C>A与里脊重量极显著相关(P<0.001)，说明此分子标记显著影响牛的里脊重量，可以通过对牛的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体的里脊重量，进而加快该性状的育种进程。

另外根据表1可知，AA型、CA型比CC型的里脊重量高，说明CC型牛个体对筛选里脊重量不利，故优先保留AA、CA型的种牛。里脊重量是衡量牛肉产量的重要指标，提高牛的里脊重量有利于提高牛肉产量，进而增加市场竞争力。因此，在育种过程中需要逐步淘汰CC型的种牛，优先保留AA、CA型的种牛，以逐代提高该位点的等位基因A的频率。

表1分子标记的SNP位点g.97C>A与里脊重量的相关性

6、目的DNA序列扩增及测序

(1)引物设计

通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载牛的22号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 5.0设计引物。

设计的引物的DNA序列如下所示：

P001正向：5’-TGAAGATCAAGGACCCCACG-3’，

P002反向：5’-GGTTACATACTTAGCCTCAG-3’；

(2)PCR扩增

10uL的反应体系中加入DNA模板1uL，双蒸水3.4uL，2×Tag PCR StanMix withLoading Dye 5uL，引物P001和P002各0.3ul。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。

(3)DNA序列测定

DNA序列测序鉴定：在北京生工科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。

测序结果如下所示：

TGAAGATCAAGGACCCCACGGGGCGCAACTAGGACCCTCGTAGGCAAATCAACTAATTTTAAAAAGTGATAACCAAGCAAAATGCTTACTTCCTCTM(C>A)CACACCCTTCCAGGAACACTGATTCCAACTGGGACATGGCTCTGCCTTGTACTCCCTTGGGTTACATACTTAGCCTCAG

注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。

7、分子标记的SNP位点g.97C>A效应分析

通过对分子标记辅助选择，对群体内基因型为CC的牛进行淘汰,可显著提高群体的里脊重量，从而提高产肉量，为企业带来更多经济效益。

本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第97个碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与牛的里脊重量之间的关联分析的应用，为牛的分子标记辅助选择及基因组选择提供了一个新的分子标记。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一 种提高中国和牛里脊重量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

检测牛的国际参考基因组UMD3.1版本22号染色体上第54648801个核苷酸位点的基因型，选择第54648801个核苷酸位点的AA、CA型个体作为种牛。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测牛的国际牛参考基因组UMD3.1版本22号染色体上第54648801个核苷酸位点的基因型的方法包括以下步骤：

（1）提取待测牛的基因组DNA；

（2）采用引物对，将所述待测牛的基因组DNA进行PCR 扩增，以便获得PCR扩增产物；

（3）对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

（4）基于所述测序结果，确定所述待测牛的如权利要求1所述的SNP 标记的基因型。

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