CN113736890B - 一种与健仔数和活仔率相关的snp分子标记及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记及其用途，所述SNP分子标记的位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列15号染色体上第10518551位G>A突变。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，提高核心群母猪的健仔数和活仔率，加快母猪相关繁殖性状的改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

Description

一种与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记及其用途
技术领域
本发明涉及一种与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记及其用途。
背景技术
在猪业生产中，母猪的繁殖能力是影响猪场生产能力的重要因素之一。繁殖能力的高低直接影响着整个猪业的经济效益。借助常规的育种技术，猪的重要经济性状如生长性状取得了一定的遗传进展，然而，繁殖性状遗传进展缓慢，一方面原因在于繁殖性状表型获取的滞后性，另一方面主要原因是繁殖性状属于低遗传力性状，纯种猪的遗传力在0.1左右，且受品种、胎次和环境因素影响较大。尽管提高母猪繁殖性状遗传进展有很大困难，但其仍是遗传育种工作者的重要育种目标。在繁殖性状中，母猪的健仔数和活仔率是衡量母猪繁殖能力的重要标准，健仔数多、活仔率高则在一定程度上表明母猪具有优良的繁殖性能。此外，母猪的健仔数多、活仔率高往往也意味着能创造出更大的经济和育种价值，因此，在猪场的育种方案中往往重点选留这类优秀母猪并让其持续“高产出”。然而，传统上基于表型的育种选育往往在母猪性成熟后期才能收集到表型数据，难以实现对繁殖性状的早期选择。为了加快母猪繁殖性状中健仔数和活仔率的遗传进展，在猪基因组上鉴别影响母猪活仔率和健仔数的主效基因和关键突变位点显得极为重要。
随着高通量测序技术的发展，通过检测猪全基因组上的单核苷酸多态(Singlenucleotide polymorphisms,SNP)，结合全基因组关联分析(Genome-wide associationstudy,GWAS)技术，可鉴别到影响猪健仔数和活仔率的主效基因和关键分子标记，将有助于揭示影响猪繁殖性能的遗传机制，进而把提高健仔数和活仔率的基因和分子标记应用到标记辅助选择和基因组选择育种技术中，将极大的加快母猪健仔数和活仔率的遗传进展，并对母猪的繁殖能力带来极大提升，从而提高养猪业的经济效益。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足和缺点而提供一种与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记及其用途，本发明还提供了一种用于检测所述的SNP分子标记的引物对和试剂盒，本发明还提供了一种鉴定与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记基因型的方法，一种筛选高健仔数和活仔率的猪品种的方法，以及一种猪的遗传改良的方法。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列15号染色体上第10518551位G>A突变。该位点碱基的多态性导致猪健仔数和活仔率的差异。
优选地，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中序列中的M是G或A。所述SNP分子标记的位点为SEQ IDNO:1序列标注位置为118位的G118-A118的核苷酸突变。
优选地，所述猪包括杜洛克猪及其合成系。
本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的引物对，包含引物P001-F和引物P002-R，其核苷酸序列如下所示：
P001-F：5’-CCTGTGGTAGACCATGCTCCAA-3’，
P002-R：5’-GGGACACAGGACAAAGGGATG-3’。
本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的试剂盒，包含上述所述的引物对。
本发明提供了一种检测与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记基因型的方法，包含如下步骤：
(1)提取待测猪的基因组DNA；
(2)采用上述所述的引物对或上述所述的试剂盒中的引物对对步骤(1)获得的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；
(4)基于所述测序结果，确定待测猪的位于猪15号染色体上与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记的基因型。
本发明提供了一种筛选高健仔数和活仔率的猪品种的方法，包含如下步骤：
检测上述所述的SNP分子标记，淘汰所述SNP分子标记的5’端第118位单核苷酸是G的个体，保留所述SNP分子标记的5’端第118位单核苷酸是A的个体为种猪。
本发明提供了一种猪的遗传改良的方法，其特征在于：所述方法包括：确定种猪核心群中的种猪的上述所述的SNP分子标记的位点，并根据所述SNP分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本15号染色体上第10518551位点为AA基因型的种猪个体，淘汰在第10518551位点为GA基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而提高后代猪的健仔数和活仔率。
优选地，所述猪或种猪包括杜洛克及其合成系。
本发明还提供了上述所述的SNP分子标记、上述所述的引物对或上述所述的试剂盒在鉴定猪健仔数和活仔率、筛选高健仔数和活仔率的猪品种、猪遗传育种或提高猪健仔数和活仔率中的用途。
有益效果：
(1)本发明研究并确定影响猪健仔数和活仔率相关的分子标记位于猪的15号染色体上的核苷酸序列上，验证其对健仔数和活仔率性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于提高种猪健仔数和活仔率的遗传改良中，从而提高母猪群体的繁殖能力，提高企业经济利润，增加核心竞争力。通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，提高核心群母猪的健仔数和活仔率，加快母猪相关繁殖性状的改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。
(2)本发明提供一种鉴定上述猪15号染色体上与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记的引物对，通过该引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确地对种猪高健仔数和活仔率进行提高性选育改良，加快育种进展。
附图说明
图1是杜洛克猪在15号染色体上关于健仔数和活仔率性状的全基因组关联分析曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)实验动物
本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种杜洛克猪413头，为种猪分公司核心群。
本实验共选取该资源群体中杜洛克猪，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。
(2)样本采集
收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。
(3)猪全基因组50K SNP判型
对上述资源群体413头杜洛克猪中的每个个体采集耳组织或断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μL已提取好的待测DNA样品与2μL Loading Buffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。
DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina，美国)基因型判定。利用R语言GenABEL包中checkmarker对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10-6的SNP，最终得到39368个SNP的有效基因型数据。
(4)全基因组关联(GWAS)分析
为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合R语言GenABEL软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferrini法确定SNP与健仔数和活仔率性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即基因组显著水平阈值为1.27E-06，即0.05/39368(有效SNP数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为2.54E-05，即1/39368(有效SNP数量)。
GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在杜洛克猪15号染色体上存在显著影响健仔数和活仔率的位点，显著关联的SNP为SEQ NO.1中第118位核苷酸g.118G>A(P值分别为1.48e-05、3.08e-08)。
5)不同基因型与健仔数和活仔率表型的关联性分析
根据表1可知，分子标记的SNP位点g.118TG>A(SEQ NO.1中第118位核苷酸，即对应于国际猪基因组11.1版本参考序列15号染色体上第10518551位G>A突变)与健仔数性状极显著相关(P<0.001)，说明此分子标记显著影响猪的健仔数，可以通过对猪的此SNP位点的选择，从而提高该群体的健仔数，进而加快育种进程。
另外根据表1还可知，AA型比GA型的健仔数和活仔率高，并且两个性状间协同变化。对于健仔数性状，AA型个体表型平均值比GA型个体表型平均值大3.07；对于活仔率性状，AA型个体表型平均值比GA型个体表型平均值高20％。因此，在育种中逐步保留AA基因型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，可以显著提高母猪的健仔数和活仔率，为养殖企业带来更多的经济效益。
表1分子标记的rs81453552 SNP位点g.118G>A与健仔数的相关性分析
Figure BDA0003189766110000061
实施例2目的DNA序列扩增及测序
(1)引物设计
通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的15号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列，并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物。设计的引物的DNA序列如下所示：
P001-F：5’-CCTGTGGTAGACCATGCTCCAA-3’，
P002-R：5’-GGGACACAGGACAAAGGGATG-3’；
(2)PCR扩增
10μL的反应体系中加入DNA模板1μL，双蒸水3.4μL，2×Tag PCR StanMix withLoading Dye 5μL，引物P001-F和P002-R各0.3μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。
(3)DNA序列测定
DNA序列测序鉴定：在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。测序结果如下所示：
Figure BDA0003189766110000062
Figure BDA0003189766110000063
注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线+加粗显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾下划线+斜体显示为设计引物序列位置。
实施例3分子标记的SNP位点g.118G>A效应分析
根据表1可知，SNP位点g.118G>A优势等位基因型AA的表型效应能够增加3.07头健仔数和提高20％的活仔率，若以每头仔猪利润200元计，则仅仅针对健仔数性状每头母猪便能增加超过600元的利润，对于规模化猪场万头母猪群而言，则能增加经济效益600万元以上。因此，通过分子标记辅助选择或基因组选择，逐步对群体内基因型为AA的猪进行选种保留，则能显著提高等位基因A的等位基因频率，提高母猪的健仔数和活仔率，加快猪的改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。
本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第118位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与母猪的健仔数和活仔率之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择和基因组选择提供了一个新的分子标记。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记及其用途
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
cctgtggtag accatgctcc aaaatactaa ataaaaaatt tcagaagtaa acaatgtaca 60
agttttaaat ggctcactat tctgagtagt gtattgctat ccagctccat tgaacccmgt 120
gtgtgaatca tccctttgtc ctgtgtccc 149
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
cctgtggtag accatgctcc aa 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
gggacacagg acaaagggat g 21

Claims (5)

1.一种筛选高健仔数和活仔率的猪品种的方法，其特征在于，包含如下步骤：检测猪的国际猪基因组11.1版本参考序列15号染色体上第10518551位G>A突变的基因型，淘汰所述第10518551位G>A突变的基因型是GG和GA的个体，保留所述第10518551位G>A突变的基因型是AA的个体为种猪；所述猪为纯种加系杜洛克猪。
2.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于，所述方法包括：确定种猪核心群中的种猪与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记的基因型，并根据所述SNP分子标记的基因型做出选择：在所述种猪核心群中选择所述SNP分子标记的基因型为AA基因型的种猪个体，淘汰所述SNP分子标记的基因型为GA和GG基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而提高后代猪的健仔数和活仔率；所述SNP分子标记的位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列15号染色体上第10518551位G>A突变，所述种猪为纯种加系杜洛克猪。
3.用于检测一种与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记的引物对在制备鉴定猪健仔数和活仔率的试剂盒中的用途；所述猪为纯种加系杜洛克猪,所述SNP分子标记的位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列15号染色体上第10518551位G>A突变，所述SNP分子标记的基因型为AA型比GA型的健仔数和活仔率高。
4.用于检测一种与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记的引物对在筛选高健仔数和活仔率的猪品种中的用途；所述猪为纯种加系杜洛克猪,所述SNP分子标记的位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列15号染色体上第10518551位G>A突变，所述SNP分子标记的基因型为AA型比GA型的健仔数和活仔率高。
5.用于检测一种与健仔数和活仔率相关的SNP分子标记的引物对在提高猪健仔数和活仔率中的猪育种的用途；所述猪为纯种加系杜洛克猪,所述SNP分子标记的位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列15号染色体上第10518551位G>A突变，所述SNP分子标记的基因型为AA型比GA型的健仔数和活仔率高。
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