CN113564264B - 一种位于猪14号染色体上与母猪死胎数和健仔率相关的snp分子标记及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种位于猪14号染色体上与母猪死胎数和健仔率相关的SNP分子标记及其用途，所述SNP分子标记的位点对应于国际猪参考基因组11.1版本14号染色体上第109497913bp处的T>C突变。该分子标记是通过全基因组关联分析得到，可显著影响母猪死胎数和健仔率的性状。本发明还提供了一种用于检测该分子标记的引物对，利用该分子标记和引物对可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于母猪死胎数和健仔率性状遗传改良中，从而降低母猪死胎数并提高健仔率，进而提高能繁母猪的繁殖性能。

Description

一种位于猪14号染色体上与母猪死胎数和健仔率相关的SNP 分子标记及其用途

技术领域

本发明涉及一种位于猪14号染色体上与母猪死胎数和健仔率相关的SNP分子标记及其用途。

背景技术

母猪的繁殖性能直接影响养殖企业经济效益，而死胎数和健仔率作为母猪的重要经济性状，是衡量母猪繁殖性能的重要指标。众所周知，死胎数与健仔率成负相关，死胎数越低，健仔率就越高。因此，减低母猪死胎数和提高母猪健仔率一直是育种工作者的主要目标。然而，死胎数和健仔率属于低遗传力性状，易受环境因素影响，故通过传统选育对死胎数和健仔率进行遗传改良效果甚微。分子育种为母猪死胎数和健仔率性状遗传改良提供一个新策略，通过在分子水平上进行育种，降低环境因素对目的性状在遗传改良上的影响。分子标记辅助选择(marker assisted selection，MAS)是分子育种的重要技术，通过分子标记对筛选优良品种。如若能利用MAS技术对母猪死胎数和健仔率进行遗传改良，将进一步加快这两个性状的育种进程，提高母猪繁殖性能。目前，普遍采用全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)筛选出与目的性状显著关联的分子标记。

杜长大(杜洛克猪×长白猪×大白猪)是我国主要商品猪之一，杜洛克作为杜长大商品猪的亲本，其繁殖性能直接影响到养殖场的经济效益。因此，对核心群杜洛克母猪的死胎数和健仔率进行遗传改良，提高母猪繁殖性能，进而提高养殖企业的经济效益。本申请拟对杜洛克母猪的死胎数和健仔率进行GWAS分析，以期筛选出有遗传改良价值的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足和缺点而提供一种位于猪14号染色体上与母猪死胎数和健仔率相关的SNP分子标记，该分子标记是通过全基因组关联分析得到，可显著影响母猪死胎数和健仔率的性状。本发明还提供了一种用于检测所述的SNP分子标记的引物对和试剂盒，利用该分子标记和引物对可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于母猪死胎数和健仔率性状遗传改良中，从而降低母猪死胎数并提高健仔率，进而提高能繁母猪的繁殖性能。本发明还提供了一种筛选低母猪死胎数和高健仔率性状的猪品种的方法，本发明还提供了一种猪的遗传改良的方法。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种位于猪14号染色体上与母猪死胎数和健仔率相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的位点对应于国际猪参考基因组11.1版本14号染色体上第109497913bp处的T>C突变。该位点碱基的多态性导致母猪死胎数和健仔率性状的不同。

优选地，所述SNP分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其中序列中的M是T或C。所述SNP分子标记的位点为SEQ IDNO:1序列标注位置为756位的T756-C756的核苷酸突变(位于该序列片段第756核酸单碱基突变，命名为：g.756T>C)。

优选地，所述母猪包括S22系杜洛克及其合成系。

本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的引物对，其特征在于，包含上游引物primer-F和下游引物primer-R，核苷酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-GTTACTTGGGTGACATTG-3’；

下游引物primer-R：5’-CTAAAGGGTTAGTAGTGGT-3’。

本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，包括上述所述的引物对。

本发明提供了一种鉴定母猪死胎数和健仔率性状的方法，包含如下步骤：

检测母猪14号染色体上上述所述的SNP分子标记，根据所述SNP分子标记的5’端第756位单核苷酸是T还是C，判断猪死胎数和健仔率性状，当所述SNP分子标记的5’端第756位单核苷酸是C时，猪死胎数高，健仔率低；当所述SNP分子标记的5’端第756位单核苷酸是T时，猪死胎数低，健仔率高。

本发明提供了一种筛选母猪低死胎数和高健仔率性状的猪品种的方法，包括以下步骤：

检测猪14号染色体上上述所述的SNP分子标记，淘汰所述SNP分子标记的5’端第756位单核苷酸是C的个体，保留所述SNP分子标记的5’端第756位单核苷酸是T的个体为种猪。

本发明提供了一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：

确定种猪核心群中种猪的上述所述的SNP分子标记，并根据所述分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组11.1版本14号染色体上第109497913bp处的TT基因型和CT基因型的种猪个体，淘汰该点的CC基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而降低后代母猪死胎数并提高后代母猪的健仔率。

优选地，所述母猪或种猪包括S22系杜洛克及其合成系。

本发明提供了上述所述的SNP分子标记、上述所述的引物对或上述所述的试剂盒在鉴定母猪死胎数和健仔率性状、筛选母猪低死胎数和高健仔率性状的猪品种、猪遗传育种或降低母猪死胎数并增加健仔率中的用途。

有益效果：

(1)本发明研究并确定影响猪死胎数和健仔率相关的分子标记位于猪的14号染色体的核苷酸序列上，验证其对猪死胎数和健仔率性状的影响效应，最终建立对猪死胎数和健仔率性状进行快速改良的分子标记辅助选择育种技术，极大地改善了杜洛克及其合成系的选育进程，适应活猪市场的需求，提高了肉猪的价格，为企业增加了销售利润，提高核心竞争力。

(2)本发明提供一种用于位于猪14号染色体上与母猪死胎数和健仔率相关的SNP分子标记的引物对，通过该引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确的对性状进行选育，加快育种进程，将其应用于种猪死胎数和健仔率性状遗传改良中，从而降低母猪的死胎数和提高猪的健仔率，进而提高企业利润，增加核心竞争力。

(3)本发明通过优选该分子标记的优势等位基因，提供了一种猪选育的方法，能够加快杜洛克猪的遗传进展，缩短了杜洛克改良的时间，从而有效提高种猪育种的经济效益，其中，若本发明将影响母猪死胎数和健仔率性状的分子标记的CC型个体全部选育成TT型个体，则每头母猪每胎产死胎数降低2.54头，健仔率从51.1％提高至85.46％。根据国家***公布的数据，2020年1月份，我国能繁母猪存栏1774万头，按母猪每年2窝，平均窝产仔猪15头计算，每年可降低死胎数约9011.92万头，增加健仔数18,286.39万头。由此可见，降低死胎数和提高健仔率为养猪产业提供收益的潜力是巨大的，可最终实现提高养殖企业的经济效益。

附图说明

图1是加系杜洛克母猪在14号染色体上关于死胎数性状全基因组关联(GWAS)分析图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值；

图2是加系杜洛克母猪在14号染色体上关于健仔率性状的全基因组关联(GWAS)分析图。

图3是不同基因型母猪的死胎数结果分析图。

图4是不同基因型母猪的健仔率结果分析图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1死胎数和健仔率的测定

本发明所使用的实验猪群群体为广东温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种S22系杜洛克猪，为种猪分公司核心群，群体系谱记录详细。

本实验共选取该资源群体中S22系杜洛克怀孕母猪536头，猪群在统一饲养标准下，自由采食、饮水。母猪分娩当天记录其总产仔数、死胎数和健仔数。健仔率计算公式：健仔率(％)＝健仔数/总产仔数*100％

实施例2

(1)S22系杜洛克母猪耳样组织DNA的提取方法参照标注苯酚-氯仿法提取全基因组DNA。用Nanodrop-ND1000分光光度计对纯种加系杜洛克群体的DNA进行质量检测和浓度测定。A260/280比值在1.8～2.0，A260/230比值在1.7～1.9判定为合格。最后将合格的DNA样品统一稀释成50纳克/微升。

(2)猪全基因组50K SNP基因型检测：GeneSeek Genomic Profiler Porcine 50KSNP分型平台，采用Illumina Infinium的使用说明和标准流程进行芯片杂交与结果扫描。最后通过GenomeStudio软件读取基因型数据。用PLINK v1.07对获得的基因型数据进行质量控制，剔除检出率<99％，次等位基因频率(mimor allel frequency，MAF)<1％或偏离哈代温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE)检验P≤10^-6的SNP标记，排除检出率<90％，家系孟德尔错误率高于0.1的个体，排除位于未知位置和性染色体上的SNP。100kg体重瘦肉率质控剩余的35845个SNP标记和2113个样本用于后续数据分析；100kg体重眼肌面积质控剩余35845个SNP和2121个样本用于后续数据分析。

(3)全基因组关联(GWAS)分析：为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合R语言GenABEL软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferrini法确定SNP与眼肌面积和瘦肉率性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即基因组水平显著阈值为1.27×10^-6，即0.05/39367(有效SNP数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为2.54×10^-5，即1/39367(有效SNP数量)。

GWAS分析结果如图1和图2所示。从图1和图2可知，在杜洛克母猪中，在14号染色体中存在在一个显著影响死胎数和健仔率的位点，最强关联的SNP为g.756T>C(P＝2.44×10^-8；P＝8.50×10^-6)(SEQ NO.1中第756位核苷酸，即对应于国际猪参考基因组11.1版本14号染色体上第109497913bp处的T>C突变)。

(4)不同基因型与母猪的死胎数和健仔率表型的关联性分析：根据表1可知，分子标记的SNP位点g.756T>C与死胎数和健仔率性状极显著相关(P<0.01)，说明此分子标记显著影响母猪的死胎数和健仔率性状，可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择，从而降低该群体母猪死胎数并提高健仔率，进而提高该群体能繁母猪的繁殖性能。另外根据表1、图3和图4还可知，TT型比CT和CC型猪的死胎数少，健仔率高，说明等位基因C是母猪的死胎数和健仔率的不利等位基因。死胎数和健仔率是衡量母猪繁殖性能的重要指标，死胎数低且健仔率高说明母猪的繁殖性能好。因此，CC基因型的母猪的繁殖性能是最差的，我们在进行育种的过程中需要逐步淘汰CC型和CT型的种猪，保留TT型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因T的频率。

表1分子标记的SNP位点g.756T>C与性状的相关性

实施例3检测SNP标记

(1)含有与S22杜洛克母猪的死胎数和健仔率性状显著相关SNP位点的目的片段为14号染色体中的一段1499bp的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物为上游引物primer-F和下游引物primer-R，其核苷酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-GTTACTTGGGTGACATTG-3’；

下游引物primer-R：5’-CTAAAGGGTTAGTAGTGGT-3’。

(2)PCR扩增的体系与条件设置

配置10μL体系，其中DNA样品1μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL，PCR mix 5μL，ddH₂O 3.4μL，PCR条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1.5min，共35个循环，最后延伸为72℃5min。

(3)DNA序列测序鉴定：序列测序在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变，测序结果如下所示：

注：序列中标注的M为突变位点，用加粗且标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为引物序列结合位置。

实施例4分子标记的SNP位点g.756T>C效应分析

本发明提供一个能显著降低杜洛克母猪死胎数并提高健仔率的SNP分子标记，使用该SNP分子标记进行标记辅助选择，能够极大地提高S22系杜洛克母猪繁殖性能。若本发明将影响母猪死胎数和健仔率性状的分子标记的CC型个体全部选育成TT型个体，则每头母猪每胎产死胎数降低2.54头，健仔率可以提高34.36％。根据国家***公布的数据，2020年1月份，我国能繁母猪存栏1774万头，按母猪每年2窝，平均窝产仔猪15头计算，每年可降低死胎数约9,011.92万头，增加健仔数18,286.39万头。由此可见，降低母猪死胎数和提高健仔率为养猪产业提供收益的潜力是巨大的。本SNP分子标记个体中，通过优选S22系杜洛克该SNP的优势等位基因(T)，可最终实现提高能繁母猪的繁殖性能，从而增加企业的收益。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种位于猪14号染色体上与母猪死胎数和健仔率相关的SNP分子标记及其用途

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1499

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

gttacttggg tgacattgtt gattggttgg tacttgtgct tattggaatg cgtttgtccc 60

tgattggttg gtttataaaa gaatgcctgc tggggtaaat catccttgtt atttgactgg 120

atttaaaact ggttcttctg aaaacatttt atttatcttg gctacaggta atcgtttttt 180

tcctaaattt gtaagaagtt taaattctca atcctgtagt agttctctaa gaaagactac 240

atgacaggta gtttttagag cctttccatg tcaaaatgtc ttttctctct gtcctcatat 300

gtgattacta tagtctgggt aagtgaaatt ctagattggg aatctttttc ttcagaattg 360

tgagggaata gtttttttca acttgtcctc tgttgctgtt tggaagttct aaactcacat 420

gaatcttttg tttggacctt ctctttggaa atttgttgga tctcttcttt gtcttggtat 480

tctgaaattt tagtgatgtg ccttgatgtg ggtctgtgtc tgttttcata ctgtgctgga 540

tatttgtaga tacttggagg actcttagcc tagaacagtt cacatagttc caggagctcc 600

tgtgtggcga ttggggtggg gtaatagatc ttagcattca gtatgcttgc ttaatcaccc 660

ggttttaaag acctctgcac ttggagacgt caccaaacca gagataatct gttttacatt 720

ctgcagagct aaactcaagt cttttttcaa gaaggmgaag gtgatctaag aatctaactg 780

ctcttcaaac agcttttacc cagtgctcct tccccacttc acttccaatt ccagaggtag 840

tgccagcagt cctgaccctt ctctgaattt ctggttgtaa attggcgagg gtctcaggtt 900

tctctactgc tggattagaa tttgactctc agggagctgc tatacagtta ctattcatct 960

gtatatgttc caacttccaa agttttgtta cttttttctc cttctcctgc tctttccatt 1020

cttactgatt tacatcttaa aaaaaacttt actgctgttt ttgtaggatt ttaagaagca 1080

aaattgtaca cgcacacaca tatatacatg tgcacacata cataaatatg tgtgtgtgtg 1140

tatccattct gttaacttat aagtctgaag tgatttgtga tttgctaaga gtgactggtt 1200

tatgtgaaat ggtactacat gatcattata attttaatac atgaaagcca aagtaacccc 1260

aggatatggc tcaaatacaa tgaccaaata caggcctgca gagaggacac tcctttagaa 1320

aatgtcatgt cttccttcat catgggctat ccctttaact tctaaagata attttcagaa 1380

aaaaacataa aaatatacat cttcctcata agagagctag caaatactga taagtaggag 1440

aaagaaaata agaatacttt aattccacca cccagagtta accactacta accctttag 1499

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gttacttggg tgacattg 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ctaaagggtt agtagtggt 19

Claims (2)

1.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于，包含如下步骤：

确定种猪核心群中种猪的SNP分子标记，并根据所述分子标记做出相应的选择，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中序列中的M是T或C：种猪的继代选育TT基因型或CT基因型的种猪个体，淘汰CC基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而降低后代母猪死胎数并提高后代母猪的健仔率；

所述种猪为S22系杜洛克。

2.检测SNP分子标记的引物对在制备鉴定母猪死胎数和健仔率性状的试剂盒或猪遗传育种中的用途；

所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中序列中的M是T或C；

所述引物对包含上游引物primer-F和下游引物primer-R，核苷酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-GTTACTTGGGTGACATTG-3’；

下游引物primer-R：5’-CTAAAGGGTTAGTAGTGGT-3’；

所述母猪或猪为S22系杜洛克。

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