CN113699248A - 一种与猪背膘厚相关的snp分子标记及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了提供了一种与猪背膘厚相关的SNP分子标记及其用途，所述SNP分子标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第38161769个核苷酸位点，该位点的碱基是A或G。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，降低种猪背膘厚，选育上述性状的优良种猪，加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

Description

一种与猪背膘厚相关的SNP分子标记及其用途

技术领域

本发明涉及一种与猪背膘厚相关的SNP分子标记及其用途。

背景技术

猪肉是人类重要的肉类来源，大约占世界人口消费肉类的40％。受中国人肉食消费习惯影响，我国对猪肉的需求更甚。自八十年代以来，猪肉一直是城乡居民餐桌上的主打肉类，城乡居民猪肉消费始终占到肉类消费的60％以上，占据主导地位。2020年，我国生猪年出栏总数为5.27亿头，占世界生猪出栏数的一半；猪肉产量为4113万吨，占全球猪肉产量的42.02％，同样稳居头号交椅。对猪肉的巨大需求主要是其可提供大量的人类必须的蛋白质需求，而蛋白质主要来源于猪肉中的瘦肉。因此，优质瘦肉型猪的选育成为猪育种工作中的重点，影响猪生长的相关性状是重要的育种目标。猪的瘦肉率是指猪含有的瘦肉重量占整个胴体重量的百分比，是衡量猪生长性能的一个重要指标。由于瘦肉率需要屠宰后方能测定，这极大的增加了该性状的测定成本。针对瘦肉率性状的遗传改良主要依靠与瘦肉率正相关的背膘厚、眼肌面积和眼肌厚等性状的遗传改良而间接提升。

猪的背膘厚指的是猪的皮下脂肪厚度，皮下脂肪是位于真皮层以下、筋膜层以上的皮下脂肪组织。养殖企业通常在种猪达100kg体重时进行背膘厚测定，测定位置位于倒数第3-4肋间、左侧距背中线5cm处，通过A型、B型等超声仪形成声像图，再通过计算机测算背膘厚度，其测定成本低廉且方便。背膘厚是反映瘦肉率的间接指标，背膘越厚瘦肉率越低，反之越高。近年来由于消费水平的提高，消费者对高瘦肉率的不断追求，对猪薄背膘的选择被广泛应用于遗传改良。回顾近现代全世界的种猪遗传改良历史，以杜洛克为代表的瘦肉型种猪大多以提高瘦肉率和降低背膘厚度为重要的育种目标。然而，背膘厚是典型数量性状，由多基因控制，难以鉴别到主效基因。而分子标记辅助育种成为改良这一性状的不错选择。

目前，利用候选基因法和QTL定位两种方法已经确定了不少与背膘厚度相关的候选基因和QTL。候选基因有DGAT1、FTO、MC4R和ADD1等。但是，候选基因法的由于候选基因的选择具有一定的随机性，可能是主效基因，也可能是与实际QTL处于紧密连锁不平衡状态中间接对性状起作用的基因，这给家畜育种带来了部分风险，此外候选基因法的选择还具有群体异质性；而QTL定位获得的QTL遗传距离跨度很大，往往包含上百个基因，这极大地限制了QTL定位方法在家畜重要经济性状的遗传改良中的应用。如今，全基因组关联分析(Genome-wide Association Study,GWAS)已经逐步在复杂性状的遗传改良方面显示出独特的优势。如提高奶牛产奶量等。相对候选基因法和QTL定位，GWAS可以更准确的定位和识别新基因，且能直接运用到家畜动物的遗传改良中，打破了猪重要经济性状分子标记鉴别的瓶颈。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足和缺点而提供了一种与猪背膘厚相关的SNP分子标记及其用途，本发明还提供了一种用于检测所述的SNP分子标记的引物对和试剂盒，本发明还提供了一种筛选低背膘厚性状的猪品种的方法，本发明还提供了一种猪的遗传改良的方法。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种与猪背膘厚相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第38161769个核苷酸位点，该位点的碱基是A或G。该位点碱基的多态性导致猪背膘厚的差异。

优选地，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示，所述SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第135位碱基是G或A。所述SNP分子标记的位点为SEQ IDNO:1序列标注位置为135位的A135-G135的核苷酸突变。

优选地，所述猪包括杜洛克及其合成系。更优选地，所述猪为美系杜洛克及其合成系。

本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的引物对，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的试剂盒，包括上述所述的引物对。

本发明提供了一种筛选低背膘厚性状的猪品种的方法，所述方法包括以下步骤：

检测猪的国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第38161769个核苷酸位点的基因型，选择第38161769个核苷酸位点的AA型个体作为种猪。

优选地，所述检测猪的国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第38161769个核苷酸位点的基因型的方法包括以下步骤：

(1)提取待测猪的基因组DNA；

(2)采用上述所述的引物对或者上述所述的试剂盒，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

(4)基于所述测序结果，确定所述待测猪的上述所述的SNP标记的基因型。

本发明提供了一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的上述所述的SNP分子标记的位点，并根据所述SNP分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第38161769位点为AG、AA基因型的种猪个体，淘汰在第38161769位点为GG基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而降低后代猪的背膘厚。

优选地，所述种猪包括杜洛克及其合成系。更优选地，所述种猪为美系杜洛克及其合成系。

本发明还提供了上述所述的SNP分子标记、上述所述的引物对或上述所述的试剂盒在鉴定猪背膘厚相关性状、筛选低背膘厚性状的猪品种、猪遗传育种或降低猪背膘厚，提高猪瘦肉率中的用途。

有益效果：

(1)本发明研究并确定影响猪背膘厚相关的分子标记位于猪的1号染色体上的核苷酸序列上，验证其对背膘厚性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪降低背膘厚的遗传改良中，从而减少后代猪对饲料的采食，提高企业经济利润，增加核心竞争力。通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，降低种猪背膘厚，选育上述性状的优良种猪，加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

(2)本发明提供一种鉴定上述猪1号染色体上与背膘厚相关的SNP分子标记的引物对，通过该引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确地对背膘厚性状进行选育，加快育种进程。

附图说明

图1是美系杜洛克猪在1号染色体上关于背膘厚性状的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图2是不同基因型猪的背膘厚的表型差异结果分析图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

(1)实验动物

本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种美系杜洛克头，为种猪分公司核心群。

本实验共选取该资源群体中3769头杜洛克猪，本实验猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

杜洛克猪产仔数较少，大群平均仅为9～10头，但生长快，饲料转化率高，胴体瘦肉率高，肌内脂肪含量较高，抗逆性强。国内商品猪生产已建立起较为成熟的杂交配套体系。其中杜长大的杂交组合在我国的内销和外销市场中持续保持绝对优势地位，作为终端父本的杜洛克种猪，对商品猪的遗传贡献率占50％。因此，提高杜洛克种公猪的生产性能的研究显得尤为重要。

(2)表型测定

所有杜洛克猪在体重100kg左右(100±5kg)测定猪的体重数据，并利用活体B超仪(Aloka 500V SSD B ultrasound)在猪的第10根到11根肋骨之间的位置测定背膘厚，随后根据温氏自有的背膘厚校正公式将背膘厚统一校正100kg体重背膘厚(BFT)，校正公式如下：

这里当公猪时A＝13.468，B＝0.111528；当为母猪时A＝15.654和B＝0.156646。

(3)猪组织样本采集和全基因组50K SNP判型

收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。

从上述资源群体中选取的3769头杜洛克种猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。)。检测结果OD260/280比值在1.8-2.0之间、OD260/230比值介于1.5-2.3之间则判定合格。检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μL已提取好的待测DNA样品与2μL LoadingBuffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。每一个样品电泳结果须有一条单一的大于50Kb的明亮条带，无RNA无蛋白污染。

DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina,美国)基因型判定。利用软件PLINKv1.9对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的SNP。

(7)全基因组关联(GWAS)分析

选择来自美国密歇根大学的Xiang Zhou和芝加哥大学的Matthew Stephens共同研发的GEMMA软件进行全基因组关联分析。考虑到亲缘关系以及群体分层效应对关联分析造成的假阳性结果的可能性，需提前利用GEMMA软件构建n×n亲缘关系矩阵，n表示个体数。亲缘关系矩阵由SNPs芯片基因型填充后所有SNPs进行构建。

本研究采用单变量混合线性模型进行变异位点与性状之间的GWAS，其中显著性检验采用Wald检验。单变量混合线性模型如下：

y＝Wα+Xβ+u+ε

y为所有个体的表型构建的n×1向量；W表示协变量(固定效应)的指示矩阵，包括场年季，测定批次性别，α为包括截距在内的协变量对应的相关系数；X为SNPs的基因型构成的n×1向量，β为每个标记对应的效应值；u为随机效应，ε为残差。

针对基于SNPs芯片的全基因组关联分析结果，往往会采用严格的Bonferroni多重校正法来设定显著性阈值，从而减低关联分析结果的假阳性率。

(8)不同基因型与背膘厚表型的关联性分析

通过GWAS分析，如图1所示，我们发现在1号染色体存在一个显著影响背膘厚性状的主效QTL，其最显著关联位点g.135A>G位于基因NKAIN2的内含子区域，因此被重点关注。进一步根据表1分析可知，分子标记的SNP位点g.135A>G与背膘厚性状极显著相关(P<0.001)，说明此分子标记显著影响猪背膘厚性状，可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择，从而降低该群体背膘厚，进而加快育种进程。

另外根据表1还可知，GG型比AG和AA型的平均背膘厚高，说明纯合子GG对平均背膘厚是最不利的。通过图2进一步得知，纯合子GG与AG和AA基因型显著差异，而GG与AA基因型更是差异极显著，这进一步说明纯合子CC对背膘厚最不利。背膘厚是衡量猪瘦肉率性状的重要指标，背膘厚低意味着猪只的脂肪沉积能力低，说明该猪的瘦肉率低。因此，GG基因型的猪的背膘厚性能是最差的，我们在进行育种的过程中需要淘汰GG型的种猪，保留AG和AA型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因A的频率。目前，该群体的优势等位基因频率仅为33.6％，说明具有重大的遗传改良空间。

表1分子标记的SNP位点g.135A>G与背膘厚的相关性分析

实施例2目的DNA序列扩增及测序

(1)引物设计

通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的1号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。设计的引物的DNA序列如下所示：

P001-F：5’-ATTGGTGCTTTTCCTTAGAAGTCTTTC-3’，

P002-R：5’-GTCTACACATCCAGGCTTCTCC-3’；

(2)PCR扩增

10μL的反应体系中加入DNA模板1μL，双蒸水3.4μL，2×Tag PCR StanMix withLoading Dye 5μL，引物P001-F和P002-R各0.3μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、64.5℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。

(3)DNA序列测定

DNA序列测序鉴定：在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。测序结果如下所示：

注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。

实施例3分子标记的SNP位点g.135A>G效应分析

根据表1和图2可知，对于背膘厚，SNP位点g.135A>G优势等位基因型(AA)的效应比GG型表型平均显著降低背膘厚1.16mm。在对生长速度和背膘厚性状表型相关分析结果显示,达100kg体重日龄与背膘厚呈正相关,达到极显著水平，也就是说，猪生长至100kg体重日龄越小，背膘越薄，瘦肉率越高，这将极大的提升猪肉经济价值，为企业创造财富。本SNP分子标记个体中，通过优选美系杜洛克该SNP的优势等位基因(A)，可最终实现提高商品猪的经济效益，从而增加企业的收益。

本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第135位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与猪的背膘厚性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种与猪背膘厚相关的SNP分子标记及其用途

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 368

<212> DNA

<213> （人工序列）Artificial

<400> 1

attggtgctt ttccttagaa gtctttcata aaagttatac ttccatacca aagagaaatt 60

aaaacttgat tggcagtttg taatgcatta gtgggctggt cagctagtat acttgccttt 120

taaatgctag atctmtagag actgatagga ctttgttctg ggtcttccag tttacctatg 180

gggtagacac tagaccacaa cctccttggg ctgaactaga aaggtgctga tggtcttgct 240

acaaaatatt caggctgttt ttcaggatgc aatcttgaat ttaatgctca ggtgttcaga 300

aacttagctc atgcctactt gtacttcaag aatcttatgc atcagcggag aagcctggat 360

gtgtagac 368

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）Artificial

<400> 2

attggtgctt ttccttagaa gtctttc 27

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）Artificial

<400> 3

gtctacacat ccaggcttct cc 22

Claims (10)

1.一种与猪背膘厚相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第38161769个核苷酸位点，该位点的碱基是A或G。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的序列如SEQ IDNO：1所示，所述SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第135位碱基是G或A。

3.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述猪包括杜洛克及其合成系。

4.一种用于检测如权利要求1-3任一所述的SNP分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

5.一种用于检测如权利要求1-3任一所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4所述的引物对。

6.一种筛选低背膘厚性状的猪品种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

检测猪的国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第38161769个核苷酸位点的基因型，选择第38161769个核苷酸位点的AA型个体作为种猪。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测猪的国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第38161769个核苷酸位点的基因型的方法包括以下步骤：

(1)提取待测猪的基因组DNA；

(2)采用如权利要求4所述的引物对或者如权利要求5所述的试剂盒，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

(4)基于所述测序结果，确定所述待测猪的如权利要求1或2所述的SNP标记的基因型。

8.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于，包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的如权利要求1-3任一所述的SNP分子标记的位点，并根据所述SNP分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第38161769位点为AG、AA基因型的种猪个体，淘汰在第38161769位点为GG基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而降低后代猪的背膘厚。

9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，所述种猪包括杜洛克及其合成系。

10.如权利要求1-3任一所述的SNP分子标记、如权利要求4所述的引物对或如权利要求5所述的试剂盒在鉴定猪背膘厚相关性状、筛选低背膘厚性状的猪品种、猪遗传育种或降低猪背膘厚，提高猪瘦肉率中的用途。

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