CN111491640A

CN111491640A - 包含葡聚糖或泊咯沙姆的用于治疗关节疾病或***病的组合物

Info

Publication number: CN111491640A
Application number: CN201880078373.7A
Authority: CN
Inventors: 朴宥信; 李日薰
Original assignee: Pharmaceutical Industrial Park Co ltd
Current assignee: Pharmaceutical Industrial Park Co ltd
Priority date: 2017-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2020-08-04
Also published as: US11801260B2; US20200368269A1; JP2021505680A; US20220233581A1; JP2023089978A; EP3725318A4; US20240075056A1; US11278565B2; EP3725318A1; KR102075596B1; WO2019112291A1; KR20190065771A

Abstract

本发明涉及包含葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物的用于治疗关节疾病或***病的组合物或葡聚糖、包含泊咯沙姆或其混合物的用于再生软骨的组合物。本发明的组合物因缓冲效果、涂敷效果或抗炎效果而长时间停留在关节或***的受损部位中，可以缓解冲击并以受损部位特异性地包裹受损部位，或者减轻黏连的部位的炎症，因此可有效地用在治疗关节疾病、***病的治疗或软骨再生。

Description

包含葡聚糖或泊咯沙姆的用于治疗关节疾病或***病的组合物

技术领域

本发明涉及包含葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物的用于治疗关节疾病或***病的组合物、用于再生软骨的组合物或用于治疗炎性疾病的组合物。

背景技术

关节是骨与骨相遇的部位，由软骨、关节囊、滑膜、韧带、筋、肌肉等组成，以使骨与骨能够平滑地运动，并起到吸收运动产生的冲击的作用。关节炎是指由于各种原因引起的关节功能障碍常，如伴随炎症等。***(connective tissue)还被称为结绨组织，通过结合动物中的组织而形成器官的组织，例如，可列举软骨、椎间盘、筋、韧带、骨、皮肤、脂肪组织、血管、肠组织等。

可以根据作为减轻炎症、延缓疾病的进展、降低尿酸等代谢性产物浓度的主要作用机理对用于治疗关节炎的药物进行大致分类，许多关节炎治疗药物具有减轻炎症的作用。炎症是引起疼痛、水肿、发烧、发红、僵硬等的病理过程，快速缓解炎症的药物包括阿司匹林在内的非甾体性抗炎剂和包括可的松在内的甾体性抗炎剂。但是，这些消炎及抗炎剂等的主要作用是缓解疼痛，在长时间服用药物时会引起各种并发症。尤其，甾体性抗炎剂与疾病原因的治疗无关，由于具有很强的暂时性的消炎作用，存在通过简单地暂时减轻疼痛来诱导过度使用关节的可能性，这将成为破坏关节并加剧残疾的因素，因此需要谨慎使用。

因此，使用于关节炎等关节受损的现有治疗法的有效性受限，伴随明显的毒副作用，由于不能长时间持续使用，其有效性受限，因此急需一种克服现有的治疗法所具有的缺点的新型治疗法或治疗剂。

另一方面，葡聚糖为多糖类之一，是指D-葡萄糖的聚合物，具有类似于淀粉或糖原的结构，D-葡萄糖由α-1，6键的直链形状连接而成且多处分支有α-1，4或α-1，3键。已知常用的高分子量的葡聚糖在体内经常引起过敏反应。葡聚糖已被用作血浆增量剂、血液抗凝剂(抗粘连剂)、使用交联葡聚糖(cross linked dextran)的填充剂等，但是，尚未报道将其用作关节疾病或***病的治疗剂。泊咯沙姆是指非离子表面活性剂，除了表面活性剂以外，已知还被用作乳化剂、稳定剂、助溶剂等。

目前，根据作为对关节疾病或***病的现有治疗法具有的局限性，即，有限的有效性、明显的毒副作用、缺乏持久性，需要新的治疗法或治疗剂，尚无关于尤其是在给药于体内的情况下不会引起过敏反应的葡聚糖或泊咯沙姆，尤其是利用低分子量的葡聚糖或泊咯沙姆有关关节疾病或***病的治疗的研究。

发明内容

为此，本发明人进行了用于治疗关节或***的研究，结果确认，葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物不会引起过敏反应，并通过对关节及***受损部位的缓冲效果、保存效果或抗炎效果来保护关及***，从而完成了本发明。

本发明的目的在于，提供包含葡聚糖(dextran)、泊咯沙姆 (poloxamer)或其混合物的用于治疗关节疾病或***病的药学组合物、用于再生软骨的组合物或用于治疗炎性疾病的药学组合物。

为了实现上述目的，本发明提供包含葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物的用于治疗关节疾病或***病的药学组合物。

并且，本发明提供包含选自由葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188 组成的组中的两种混合物的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物。

并且，本发明提供包含葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物作为有效成分的用于预防或治疗炎性疾病的药学组合物。

并且，本发明提供包含葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物作为有效成分的用于再生软骨的组合物。

并且，本发明提供包含选自由葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188 组成的组中的两种混合物的用于再生软骨的组合物。

本发明的组合物因过缓冲效果、涂敷效果或抗炎效果而长时间停留在关节或***的受损部位中，可以缓解冲击并以受损部位特异性地包裹受损部位，或者减轻黏连的部位的炎症，因此可有效地用在治疗关节疾病、***病的治疗或软骨再生。

附图说明

图1为示出对正常软骨细胞处理葡聚糖、泊咯沙姆或它们的混合物 24小时后确认软骨细胞的细胞增殖能力的结果的图(*/**/***分别表示相对于阴性对照组(nc)的p<0.05/p<0.01/p<0.001的显著性)。

图2为示出对正常软骨细胞处理葡聚糖、泊咯沙姆或它们的混合物 48小时后确认软骨细胞的细胞增殖能力的结果的图(*/**/***分别表示相对于阴性对照组(nc)的p<0.05/p<0.01/p<0.001的显著性)。

图3为示出对根据处理重组人白细胞介素-1α(rhIL-1α)的骨关节炎体外(invitro)模型的软骨细胞处理葡聚糖、泊咯沙姆或它们的混合物24小时后确认软骨细胞的细胞增殖能力的结果的图(*/**/***分别表示相对于炎症诱发阳性对照组(pc)的p<0.05/p<0.01/p<0.001的显著性)。

图4为示出对根据处理重组人白细胞介素-1α的骨关节炎体外模型的软骨细胞处理葡聚糖、泊咯沙姆或它们的混合物48小时后确认软骨细胞的细胞增殖能力的结果的图(*/**/***分别表示相对于炎症诱发阳性对照组(pc)的p<0.05/p<0.01/p<0.001的显著性)。

图5为示出对根据处理重组人白细胞介素-1α的骨关节炎体外模型的软骨细胞处理葡聚糖、泊咯沙姆或它们的混合物后确认白细胞介素 -10(IL-10)/白细胞介素-6(IL-6)基因表达比的结果的图(*/**/*** 分别表示相对于炎症诱发阳性对照组(pc)的p<0.05/p<0.01/p<0.001的显著性)。

图6为示出对根据处理重组人白细胞介素-1α的骨关节炎体外模型的软骨细胞处理葡聚糖、泊咯沙姆或它们的混合物后确认基质金属蛋白酶-3(MMP-3)基因的表达量的结果的图(*/**/***分别表示相对于炎症诱发阳性对照组(pc)的p<0.05/p<0.01/p<0.001的显著性)。

图7为示出对根据处理重组人白细胞介素-1α的骨关节炎体外模型的软骨细胞处理葡聚糖、泊咯沙姆或它们的混合物后确认基质金属蛋白酶-13(MMP-13)基因的表达量的结果的图(*/**/***分别表示相对于炎症诱发阳性对照组(pc)的p<0.05/p<0.01/p<0.001的显著性)。

图8为示出对根据处理重组人白细胞介素-1α的骨关节炎体外模型的软骨细胞处理葡聚糖、泊咯沙姆或它们的混合物后确认II型胶原蛋白的生成量的结果的图(*/**/***分别表示相对于炎症诱发阳性对照组 (pc)的p<0.05/p<0.01/p<0.001的显著性)。

图9为示出对根据重组人白细胞介素-1α的骨关节炎体外模型的软骨细胞处理葡聚糖、泊咯沙姆或它们的混合物后确认聚蛋白多糖生成量的结果的图(*/**/***分别表示相对于炎症诱发阳性对照组(pc)的 p<0.05/p<0.01/p<0.001的显著性)。

具体实施方式

最佳实施方式

下面，对本发明进行详细说明。

本发明提供包含葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物的用于治疗关节疾病或***病的药学组合物。并且，本发明提供包括将葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物给药于所需个体的步骤的关节疾病或***病的预防或治疗方法。

在本发明中，“葡聚糖”是指作为多糖类之一的D-葡萄糖的聚合物。葡聚糖具有类似于淀粉或糖原的结构，D-葡萄糖由α-1，6键的直链形状连接而成且多处分支有α-1，4或α-1，3键。葡聚糖可用作血液增量剂、血液抗凝剂，根据目的，可通过改变葡聚糖的分子量来使用。在本发明中上述葡聚糖可具有500Da至10000Da的分子量，优选地，具有500Da至8000Da，更优选地，可具有1000Da至5000Da的分子量。葡聚糖根据分子量，在其分子量为1000Da的情况下被命名为“葡聚糖1”，在其分子量为 5000Da的情况下被命名为“葡聚糖5”，在其分子量为10000Da的情况下被命名为“葡聚糖10”等。

通常，已知将8000Da以上的葡聚糖给药于人体时具有引起过敏反应的风险。尤其，作为上述过敏反应，可发生作为由抗原-抗体免疫反应导致的快速全身反应的过敏性反应(anaphylaxis)，但是这很危险。然而，根据本发明的低分子量的葡聚糖，若优选地使用1000Da至5000Da的葡聚糖，则具有可使过敏反应最小化的优点，与公知的物质(例如，透明质酸)相比，体内分解的速度很慢，因此，具有可以长时间维持关节疾病或***病的治疗效果的优点。

并且，与8000Da以上的葡聚糖相比，根据本发明的低分子量的葡聚糖具有如下特征，即，不仅不会引起过敏反应，而且租用时间开始点(onset) 很快，可以在宽范围内分布。

在本发明作为优选例提供利用葡聚糖1、葡聚糖5的实施例。它们能够以葡聚糖1及葡聚糖5的组合使用，还能够与泊咯沙姆188组合使用。

在本发明中，可以将选自由葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188组成的组中的两种以1：1的体积比混合。

在本发明中，上述葡聚糖的浓度用100cc溶剂中质量(g)浓度(w/v) 的百分比表示，例如，在葡聚糖1作为单一有效成分包含在组合物中的情况下，可包含2(w/v)％至40(w/v)％的浓度的葡聚糖1，在葡聚糖5 作为单一有效成分包含在组合物的情况下，可包含2至30(w/v)％的浓度的葡聚糖5。

并且，在葡聚糖以葡聚糖1或葡聚糖5的混合物、葡聚糖与泊咯沙姆的混合物包含在组合物的情况下，葡聚糖的浓度可根据混合对象而不同。例如，在葡聚糖5及葡聚糖1的混合物包含在组合物中的情况下，上述葡聚糖5的浓度为2(w/v)％至40(w/v)％，上述葡聚糖1的浓度为2.5 (w/v)％至40(w/v)％或葡聚糖5的浓度为4(w/v)％至40(w/v)％，葡聚糖1的浓度可以为5(w/v)％至40(w/v)％。

在葡聚糖以高浓度存在于组合物中情况下，由于包含多糖类的水分的特性，粘度过度增加而存在难以形成形状的缺点，因此，葡聚糖通常使用 5％以下的浓度。但是，本发明的组合物中的葡聚糖根据分子量包含至少 240(w/v)％至最多40(w/v)％浓度，因此可使关节疾病或***病的治疗效果最大化。为了提高或稳定这种葡聚糖的溶解度，本发明的组合物还可包含添加物，上述添加物可包括糖醇类、单糖类或包含CaCl₂的二价阳离子。

在本发明中，“泊咯沙姆”是以疏水性环氧丙烷为中心两端结合有亲水性环氧乙烷的非离子性三嵌段共聚物，由于具有温度敏感性特征，可根据浓度和温度来转变为溶胶(Sol)和凝胶(Gel)，并且泊咯沙姆的性质根据聚氧丙烯和聚氧乙烯的比例而不同。除了表面活性剂以外，泊咯沙姆还可用作乳化剂、稳定剂、助溶剂等。

在本发明中，上述泊咯沙姆可具有100Da至20000Da的平均分子量。

上述泊咯沙姆可选自由泊咯沙姆101、泊咯沙姆105、泊咯沙姆105 苯甲酸酯、泊咯沙姆108、泊咯沙姆122、泊咯沙姆123、泊咯沙姆124、泊咯沙姆181、泊咯沙姆182、泊咯沙姆182二苯甲酸酯、泊咯沙姆183、泊咯沙姆184、泊咯沙姆185、泊咯沙姆188、泊咯沙姆212、泊咯沙姆215、泊咯沙姆217、泊咯沙姆231、泊咯沙姆234、泊咯沙姆235、泊咯沙姆237、泊咯沙姆238、泊咯沙姆282、泊咯沙姆284、泊咯沙姆288、泊咯沙姆331、泊咯沙姆333、泊咯沙姆334、泊咯沙姆335、泊咯沙姆338、泊咯沙姆401、泊咯沙姆402、泊咯沙姆403及泊咯沙姆407组成的组中，优选地，包括泊咯沙姆188，但并不限定于此。

在本发明中，上述泊咯沙姆的浓度是指100cc溶剂中质量(g)浓度 (w/v)的百分比，其特征在于，能够以1(w/v)％至50(w/v)％的浓度、 2(w/v)％至30(w/v)％的浓度包含在组合物中，例如，在泊咯沙姆188 作为单独有效成分包含在组合物中的情况下，能够以1(w/v)％至15(w/v) ％或1(w/v)％至10(w/v)％的浓度包含在组合物中。

为了提高或稳定这种泊咯沙姆的溶解度，本发明的组合物还可包含糖醇类、单糖类、二价阳离子等添加物，并且灭菌水或生理食盐水也可包含在组合物中，而无需额外的添加物。

在本发明中，上述药学组合物可包含葡聚糖及泊咯沙姆的混合物。尤其，在将泊咯沙姆188与葡聚糖混合使用的情况下，可以于葡聚糖1或葡聚糖5混合使用，例如，在与葡聚糖5混合的情况下，上述葡聚糖5的浓度为2(w/v)％至40(w/v)％，上述泊咯沙姆188的浓度可以为1(w/v) ％至20(w/v)％，或者，葡聚糖5的浓度为4(w/v)％至40(w/v)％，泊咯沙姆188的浓度可以为2(w/v)％至10(w/v)％。

并且，例如，在与葡聚糖1混合的情况下，上述葡聚糖1的浓度为2.5 (w/v)％至40(w/v)％，上述泊咯沙姆的浓度可以为1(w/v)％至5(w/v) ％，或者葡聚糖1的浓度为45(w/v)％至55(w/v)％，泊咯沙姆188的浓度可以为1(w/v)％至2(w/v)％。

在泊咯沙姆188以高浓度包含在组合物中的情况下，例如大于25(w/v) ％，可具有毒性，在与葡聚糖混合的情况下，可通过适当调节浓度来使用。

作为一实施例，例如，葡聚糖：泊咯沙姆能够以5：0.05、5：0.5、5： 5、5：10、5：20、5：30、5：40、5：50、5：100、5：150、5：200、10： 0.1、10：1、10：10、10：20、10：30、10：40、10：50、10：100、10： 150、10：300、10：400、50：0.5、50：1、50：5、50：10、50：20、50： 30、50：40、50：50的(w/v)％可包含在本发明的药学组合物中，例如， 1：0.01至1：40，以例示性的组合混合1(w/v)％的泊咯沙姆188与40 (w/v)％的葡聚糖1的情况是反映1：40的比例，在混合20(w/v)％的泊咯沙姆188与2(w/v)％的葡聚糖5的情况是反映1：0.1的比例，能够以1：0.1至1：40包含在本发明的药学组合物中。其中，上述葡聚糖的平均分子量可以为1000Da或5000Da，可包含上述泊咯沙姆的平均分子量为 8500Da的泊咯沙姆188。并且，作为本发明的一实施例，在包含选自由葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188组成的组中的两种混合物的情况下，将各个成分以1：1的体积比进混合，并可包含在组合物中。

并且，作为本发明的一实施例，本发明的药学组合物包含葡聚糖1及葡聚糖5的混合物，例如，葡聚糖1：葡聚糖5能够以5：0.05，5：0.5、5： 5、5：10、5：20、5：30、5：40、5：50、5：100、10：0.1、10：1、10： 10、10：20、10：30、10：40、10：50、10：100、10：150、10：200、50： 0.5、50：1、50：5、50：10、50：20、50：30、50：40、50：50、50：1000 的(w/v)％比例包含在药学组合物中，例如，1：0.01至1：20，以例示性的组合混合2.5(w/v)％的葡聚糖1与40(w/v)％的葡聚糖5的情况是反映1：16的比例，混合40(w/v)％的葡聚糖1与2(w/v)％的葡聚糖5的情况是反映1：0.05的比例，能够以1：0.05至1：16的比例包含在药学组合物中。

在本发明的组合物包含葡聚糖及泊咯沙姆的混合物的情况下，泊咯沙姆的疏水性成分可使葡聚糖或联合药物的溶解度增加，作为泊咯沙姆的亲水性成分的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)可通过保存细胞膜并防止黏连来保存组织。但是，泊咯沙姆易于被体液稀释，并具有容易被体液吸收的缺点，因此可通过与葡聚糖混合来增加体内稳定性。因而，在葡聚糖及泊咯沙姆的混合物的情况下，与单独包含葡聚糖或单独包含泊咯沙姆的情况相比，可通过长时间保持粘性来包裹受损的关节或***部位，并通过防止组织发生病理性粘连来降低由摩擦力引起的炎性现象，从而顺利提供营养物质并具有增进组织再生的效果。上述效果可通过葡聚糖及泊咯沙姆混合物的缓冲效果(cushion effect)或涂敷效果(coating effect)或抗炎效果(anti-inflammatory effect)来诱导。

在本发明中，“缓冲效果(cushion effect)”是指通过减小关节等给药的部位的摩擦来缓解所施加的冲击的起到软垫等作用的效果，“涂敷效果(coating effect)”是指通过快速覆盖关节中的受损的软骨组织等干涩的部位来涂敷，从舒适地移动膝盖关节的效果。可通过这些效果来减少受损的关节部位的炎症反应。

所以，诱导缓冲效果和涂敷效果或抗炎效果的本发明的组合物适合改善再生或受损的组织，因此可有效地用于关节疾病或***病的治疗。本发明的组合物的如上所述的效果是类似于目前用于治疗关节疾病的干细胞治疗剂的效果，它与需要高技术力和高成本的干细胞治疗剂相比具有竞争力。

另一方面，包含本发明的葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，为了增进本发明所需的关节疾病或***病的预防或治疗效果，还可包含干细胞。可包含在本发明的干细胞包括胚胎干细胞或成体干细胞，上述成体干细胞可以为间充质干细胞、人组织来源间充质基质细胞(mesenchymal stromalcell)、人组织来源间充质干细胞、多能干细胞或羊膜上皮细胞。上述干细胞可以是来源于脐带、脐带血、骨髓、脂肪(或脂肪组织细胞)、肌肉、神经、皮肤、羊膜和胎盘(或胎盘组织细胞)、尿液等的干细胞，但并不限定于此。上述干细胞可以为干细胞或其浓缩液、干细胞培养液或其浓缩液、干细胞的培养分泌物或其浓缩液或它们的配合物。上述组合物中的葡聚糖或泊咯沙姆可起到将干细胞特异性地转运至关节或***的受损的病变部位的作用，并且，具有通过附着在转运干细胞的病变部位来提高诱导受损的组织的再生的效果。

在本发明中，“预防”是指通过给药组合物来抑制关节疾病或***病或延迟发病的所有行为。

在本发明中，“治疗”是指通过给药组合物来使关节疾病或***病的症状好转或变得有利的所有行为。

本发明的药学组合物还可包含药学上可接受的添加剂，根据药学领域找那个常规的方法，可以将其配制成适合于在患者体内给药的单位剂型制剂。并且，可通过与药学上可接受的载体或媒介，例如，灭菌水、生理食盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、赋形剂、媒介物、防腐剂或结合剂等组合，以药学上可接受的单位用量形态混合来配制上述制剂。

上述药学组合物可以为溶液状态或粉末状态，在上述药学组合物为粉末状态的情况下，在给药之前可通过溶解于溶剂来使用，但并不限定于此，考虑到制备药物时可发生的各种情况，可以以最合适的方式来制备。

对于上述药学组合物的给药形态没有特别限制，但是，可经口服给药、注射、借助输液的给药等的常规给药途径。

在口服给药的情况下，还可用作具有上述组成的组合物，或者与医药上可接受的载体、赋形剂(excipient)一起用作片剂、药丸、胶囊、凝胶、糖浆等的制剂。但是，作为片剂或散剂等固型剂吸收需要时间，因此优选为通过液剂等的口服给药。在此情况下，优选地，可与适当的添加物，例如，氯化钠等盐类、缓冲剂、螯合剂等一起作为水溶液来进行给药。

并且，可以通过涂敷有靶向关节疾病或***的特异性抗体的脂质体等靶向药物递送***来给药药物。脂质体可以选择性地从患病的组织上取得。

在将本发明的药学组合物以局部给药用制剂给药的情况下，添加适当的缓冲剂、等渗剂等并利用溶解于灭菌蒸馏水，直接注入个体的关节腔、***、静脉内、皮下、皮内、关节内或肌肉等，或者涂敷于皮肤或可以是贴剂(patch)形态。

上述个体为选自包括人、狗、猫、猪、马、羊、鼠及猴子在内的哺乳动物的一种，优选地，可以是人。

在本发明中，术语“关节内”是指在关节经皮注射本发明的药学组合物。

在本发明中，术语“局部给药”是指经皮注射具有炎症的关节内或其附近。所以，局部给药注射与表皮、真皮、肌肉或任何申城器官有关。

有关局部给药的主要优点在于，选择性地限制对受损的区域的镇痛效果。进而，局部给药允许高局部浓度水平，而很少或没有全身释放。

上述药学组合物还可包含稳定剂、润滑剂、缓冲剂、等渗性调节剂、麻醉剂或抗菌剂等。

并且，上述药学组合物还可包含广泛使用于本领域中的消炎剂。上述消炎剂可以是非甾体性、甾体性或它们的配合物。作为非甾体性消炎剂的非限定性例，包括：昔康，例如，吡罗昔康、伊索昔康、替诺昔康、舒多昔康；水杨酸盐，例如，阿司匹林、双水杨酯、贝诺酯、三水杨酸胆碱镁、萨法波林(safapryn)、搜普林(solprin)、二氟尼柳和芬度柳；醋酸衍生物，例如，双氯芬酸、芬氯酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、伊索克酸、呋罗芬酸、硫平酸、齐多美辛、阿西美辛、芬替酸、佐美酸、环氯茚酸、奥昔平酸、联苯乙酸和酮咯酸；灭酸酯类；灭酸酯，例如，甲灭酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、尼氟灭酸和托芬那酸；丙酸衍生物，例如布洛芬、萘普生、苯噁洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、非诺洛芬、芬布芬、吲哚洛芬、吡洛芬、卡洛芬、奥沙普秦、普拉洛芬、咪洛芬、硫噁洛芬、舒洛芬、阿明洛芬和噻洛芬酸；吡唑，例如，保泰松、羟布宗、非普拉宗、阿扎丙宗和三甲保泰松。还可使用这些非甾体性消炎剂的萃取物。

上述甾体性消炎剂的非限定性例包括皮质类固醇，例如，氢化可的松、羟基-曲安西龙、α-甲基***、磷酸***、倍氯米松二丙酸酯、戊酸氯倍他索、***、去羟米松、醋酸去氧皮质酮、***、双氯松、双乙酸二氟拉松、戊酸二氟可龙、氣氨缩松、氟氯萘德、氟氢可的松、特戊酸氟米松、氟轻松、醋酸氟轻松、氟可丁酯、氟可龙、醋酸氟泼尼定、氟氢缩松、哈西奈德、醋酸氢化可的松、氢化可的松丁酸酯、甲泼尼龙、曲安萘德、可的松、可托多松、氟氯奈德(flucetonide)、氟氢可的松、二醋酸二氟拉、氟氢缩松、氟氢可的、醋酸双氟拉松、丙酮化氟雄诺龙 (fluradrenolone acetonide)、甲羟松、安西法尔、安西非特、倍他米及其平衡的酯(balance)、氯***、醋酸氯***、氯可托龙、克西诺龙(clescinolone)、二氯松、二氟泼尼、氟氯萘、氟尼缩松、氟米龙、氟培龙、氟泼尼龙、戊酸氢化可的松、环戊丙酸氢化可的松、氢可他酯、甲***、帕拉米松、***龙、***、二丙酸倍氯米松、曲安西龙及其萃取物。

本发明的药学组合物能够以药剂学上有效的量给药。术语“药剂学上有效的量”是指足以治疗疾病的量，有效用量水平可取决于包括疾病的严重程度、患者的年龄、体重、健康、性别、患者对药物的敏感度、给药途径及***率、治疗时间、与所使用的本发明的组合物组合使用或同时使用的药物在内的因素以及医学领域公知的其他因素。葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物的用量在很宽的范围内变化，并取决于各个特殊情况的个别要求。

本发明的药学组合物可以与用于治疗关节疾病或***病的公知的药剂联合给药，可与上述治疗剂同时给药或依次给药。

本发明的药学组合物可分为一次或几次，以优选的给药间隔，例如，可以每隔1周进行给药。

根据本发明，包含葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物的药学组合物可诱导减轻患有关节疾病或***病的个体长期疼痛。在使用根据本发明的药学组合物的情况下，避免了主要的药物副作用，能够在不使用太侵入性技术的情况下治疗和/或预防急性以及慢性关节疾病或***病。

在本发明中，“***”也被称为结绨组织，指广泛分布在动物组织中并用于结合、保护、填充细胞、脏器、器官的组织，分为纤维性***，神经胶质组织、网状组织，但是，纤维结性缔组织占多数。例如，本发明的***可以包括但不限于软骨、椎间盘、筋、韧带、骨、皮肤、血管、肠组织等。

在本发明中，发生“关节疾病”或“***病”的原因大致分为创伤性、感染性、炎性和退化性。根据本发明的组合物或治疗剂可用于由各种损伤关节的原因引起的关节疾病及***病，但是，预期可有效使用本发明的组合物的关节疾病包括骨关节炎，优选地，包括反复性摩擦和由此产生的退化性骨关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、外伤性关节炎、类风湿性关节炎、髌股疼痛综合征、慢性炎症或关节症。并且，预期有效使用本发明的组合物的***病包括软骨，椎间盘、筋、韧带、骨、皮肤、血管、肠组织等因受到物理损伤或反复性摩擦引起的退化性变化导致产生胶原蛋白或水分的损失的情况的***病。尤其，本发明的组合物具有促进抗炎效果及胶原蛋白的合成，并增加聚蛋白多糖的生成量增加的效果优秀，因此，基于这种效果，可有效地使用在***病中尤其是与炎症有关的***病，优选地，选自由炎性骨关节疾病、炎性皮炎、炎性眼病、炎性肌炎、炎性胃肠疾病、软骨病、血管炎及扭伤组成的组中的一种以上的***病的预防或治疗中。

在本发明中，提供如下优选例，从而可实现不显示细胞毒性并有效地示出抗炎效果、抑制作为破坏软骨基质的蛋白质的基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-13基因表达、作为软骨保护作用促进II型胶原蛋白的合成、增加聚蛋白多糖的生成量的效果。

在本发明中，可以以1：1的体积比混合选自由葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188组成的组中的两种。

并且，本发明涉及包含选自由葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188组成的组中的两种混合物的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物。

上述葡聚糖为葡聚糖1，作为单一有效成分包含在组合物中，葡聚糖 1的浓度可以为2(w/v)％至40(w/v)％。

上述葡聚糖为葡聚糖5，作为单一有效成分包含在组合物中，葡聚糖 5的浓度可以为2(w/v)％至30(w/v)％。

并且，上述泊咯沙姆作为单一有效成分包含在组合物中，泊咯沙姆的浓度可以为1(w/v)％至15(w/v)％。

在本发明的一例中，上述混合物为葡聚糖5及泊咯沙姆的混合物，上述葡聚糖5的浓度为2(w/v)％至40(w/v)％，上述泊咯沙姆的浓度可以为1(w/v)％至20(w/v)％。

并且，上述混合物为葡聚糖5及葡聚糖1的混合物，上述葡聚糖5的浓度为2(w/v)％至40(w/v)％，上述葡聚糖1的浓度可以为2.5(w/v) ％至40(w/v)％。

并且，上述混合物为葡聚糖1及泊咯沙姆的混合物，上述葡聚糖1的浓度为2.5(w/v)％至40(w/v)％，上述泊咯沙姆的浓度可以为1(w/v) ％至5(w/v)％。

并且，上述混合物为葡聚糖1及泊咯沙姆的混合物，上述葡聚糖1的浓度为45(w/v)％至55(w/v)％，上述泊咯沙姆的浓度可以为1(w/v) ％至2(w/v)％。

并且，本发明的一例涉及基于抗炎作用的组合物、用于预防或治疗炎性疾病的药学组合物、利用其的预防或治疗炎性疾病的方法。

为此，本发明提供包含葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物作为有效成分的用于预防或治疗炎性疾病的药学组合物。

并且，本发明提供包括将葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物给药于所需个体的步骤的炎性疾病预防或治疗方法。

为此，具体地，本发明提供包含选自由葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188组成的组中的一种以上的用于预防或治疗炎性疾病的药学组合物或炎性疾病预防或治疗方法。

在本发明中，炎性疾病可以是炎性皮肤病、炎性眼病、炎性骨关节疾病、炎性肌肉病或炎性胃肠疾病，但并不限定于此。

在给药上述葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188组成的组中的两种混合物的情况下，与每个成分的抗炎效果相比，可示出显著优秀的效果。具体地，当给药葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188时，可以在2(w/v)％至40(w/v)％的葡聚糖1、2(w/v)％至40(w/v)％的葡聚糖5、1(w/v) ％至10(w/v)％的泊咯沙姆188所有范围下均具有优秀的抗炎效果，例如，在优选实例中，通过组合5(w/v)％的葡聚糖1及2(w/v)％至10 (w/v)％的泊咯沙姆188、5(w/v)％的葡聚糖1及4(w/v)％至40(w/v) ％的葡聚糖5、50(w/v)％的葡聚糖1及2(w/v)％至10(w/v)％的泊咯沙姆188、50(w/v)％的葡聚糖1及4(w/v)％至40(w/v)％的葡聚糖5、2(w/v)％的泊咯沙姆188及5(w/v)％至50(w/v)％的葡聚糖1、 2(w/v)％的泊咯沙姆188及4(w/v)％至40(w/v)％的葡聚糖5、10 (w/v)％的泊咯沙姆188及5(w/v)％至50(w/v)％的葡聚糖1、10(w/v) ％的泊咯沙姆188及4(w/v)％至40(w/v)％的葡聚糖5、4(w/v)％的葡聚糖5及5(w/v)％至50(w/v)％的葡聚糖1、40(w/v)％的葡聚糖5及5(w/v)％至50(w/v)％的葡聚糖1、至40(w/v)％、40(w/v) ％的葡聚糖5及2(w/v)％至10(w/v)％的泊咯沙姆188，可用作为抗炎、炎性疾病的治疗用途。

因此，本发明的特征可以在于，本发明的混合物为葡聚糖1及泊咯沙姆188的混合物，上述葡聚糖1的浓度为2(w/v)％至40(w/v)％，上述泊咯沙姆188的浓度为1(w/v)％至10(w/v)％。

并且，本发明的特征可以在于，本发明的混合物为葡聚糖1及葡聚糖 5的混合物，上述葡聚糖1的浓度为2(w/v)％至40(w/v)％以及上述葡聚糖5的浓度为2(w/v)％至40(w/v)％。

并且，本发明的特征可以在于，本发明的混合物为葡聚糖5及泊咯沙姆188的混合物，上述葡聚糖5的浓度为2(w/v)％至40(w/v)％，上述泊咯沙姆188的浓度为1至10(w/v)％。

在本发明的另一例中，涉及基于软骨基质再生效果的用于再生软骨的组合物、利用其的软骨再生方法。

为此，本发明提供包含葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物作为有效成分的用于再生软骨的组合物。

并且，本发明提供包括将葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物给药于需要软骨再生个体的步骤的软骨再生方法。

在本发明中，具体地，提供包含选自由葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188组成的组中的一种以上的用于再生软骨的组合物或软骨再生方法，这些诱导胶原蛋白生成量的增加及聚蛋白多糖生成量的增加，并可减少基质金属蛋白酶-3或基质金属蛋白酶-13的表达量。

在给药选自由上述葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188组成的组中的一种的情况下，可包含2(w/v)％至40(w/v)％的葡聚糖1、1(w/v) ％至15(w/v)％的泊咯沙姆188、2(w/v)％至30(w/v)％的葡聚糖5。

并且，在给药选自由葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188组成的组中的两种以上的混合物的情况下，作为具体实例，可以组合5(w/v)％的葡聚糖1及2(w/v)％的泊咯沙姆188、5(w/v)％的葡聚糖1及4(w/v) ％至40(w/v)％的葡聚糖5、50(w/v)％的葡聚糖1及2(w/v)％的泊咯沙姆188、4(w/v)％至40％(w/v)％的葡聚糖5及2(w/v)％至10 (w/v)％的泊咯沙姆188，在以这种方式组合的情况下，可增加胶原蛋白或聚蛋白多糖的生成量并抑制基质金属蛋白酶-3或基质金属蛋白酶-13的表达，从而可实现优秀的软骨再生效果。

因此，本发明的特征可以在于，本发明的混合物为葡聚糖1及泊咯沙姆188的混合物，上述葡聚糖1的浓度为5(w/v)％至40(w/v)％，上述泊咯沙姆188的浓度为2(w/v)％。

并且，本发明的特征可以在于，本发明的混合物为葡聚糖1及葡聚糖 5的混合物，上述葡聚糖1的浓度为5(w/v)％，上述葡聚糖5的浓度为 4(w/v)％至40(w/v)％。

并且，本发明的特征可以在于，本发明的混合物为葡聚糖5及泊咯沙姆188的混合物，上述葡聚糖5的浓度为4(w/v)％至40(w/v)％，上述泊咯沙姆188的浓度为2(w/v)％至10(w/v)％。

并且，可同时实现抗炎及软骨再生效果，因此最适合关节疾病或***病的预防或治疗的实例包括但不限于，在单独使用葡聚糖1、葡聚糖5 及泊咯沙姆188的情况下，葡聚糖1可以为2.5(w/v)％、葡聚糖5可以为2(w/v)％至30(w/v)％，泊咯沙姆188可以为1(w/v)％至15(w/v) ％，在使用选自由葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188组成的组中的两种以上的混合物的情况下，组合使用5(w/v)％的葡聚糖1及4(w/v)％至 40(w/v)％的葡聚糖5、4(w/v)％至40(w/v)％的葡聚糖5及优选为 2(w/v)％至10(w/v)％、2(w/v)％的泊咯沙姆188及5(w/v)％至 40(w/v)％的葡聚糖1。

本发明中未另行定义的术语具有本发明所属技术领域中通常所使用的含义。

具体实施方式

材料及方法

在本申请中，利用葡聚糖1(Dextran 1(EP级，Pharmacosmos)、葡聚糖5(Dextran5，药品质量(pharmaceutical quality)，Pharmacosmos)，泊咯沙姆188(Poloxamer 188，细胞培养级(cell culture grade)，西格玛奥德里奇)进行实验。并且，为了诱导关节炎，重组人白细胞介素-1α (recombinant human IL-1α，Lot No.200-01A)购自派普泰(PEPROTECH)，作为阳性对照物质使用吲哚美辛(Indomethacin，西格玛奥德里奇，Lot No.53-86-1)、透明质酸钠(25mg/2.5mL的sodium hyaluronate，阿拉贡注射器(AraganInjection)，东光制药(Dongkwang Pharm)，专用药)。

实施例1.葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物的制备及实验准备

1.1细胞的分离培养

在灭菌状态下分离3周龄的雄性SD大鼠的后腿关节后，仅收集构成关节的软骨组织，对其进行单细胞化来分离使用原代大鼠软骨细胞 (Chondrocytes)。当原代培养的细胞稳定后使用于试验，为了确定稳定的软骨细胞，分离核糖核酸(RNA)后，利用实时逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)确认作为软骨细胞标记因子的II型胶原蛋白或SOX9基因的表达程度后用于试验中。

1.2细胞培养方法

将从1.1中分离的细胞培养于设定为37℃的温度、95％的湿度、5％的CO₂的培养器中，每8小时确认培养室温度及湿度。培养基使用补充有 10％的胎牛血清、2mL的L-谷氨酰胺、50U/mL的青霉素、50μg/mL的链霉素的最低必需培养基(Minimum Essential Medium，MEM)。在培养期间，当细胞数增殖到90％以上时，使用分离溶液(Detached solution)(0.25(w/v)％的胰蛋白酶(Trypsin)，0.53mM的乙二胺四乙酸溶液(EDTA solution)(3mL))分离细胞，通过在125Xg的条件下离心10分钟来分离细胞，用于以下实验中。

1.3试验组的构成及制备

试验组由对用5ng/mL的重组人白细胞介素-1α诱发骨关节炎的模型中按浓度处理正常对照组(NC)、炎症诱发对照组(PC)、试验物质(单一物质或混合物)形成，作为阳性对照组的吲哚美辛(IM)或透明质酸钠 (HN)处理组由单一浓度形成。试验组如下述表1所示。

表1

D＝葡聚糖1，T＝葡聚糖5，P＝泊咯沙姆188，NC＝正常组，PC＝炎症诱发物质(重组人白细胞介素-1α)给药组，HN＝透明质酸钠，IM＝吲哚美辛，D+P＝葡聚糖1与泊咯沙姆188混合物，D+T＝葡聚糖1与葡聚糖5 混合物，P+T＝泊咯沙姆188与葡聚糖5混合物。

在本发明中所使用的成分的浓度为按如下标记方法进行标记：D10＝葡聚糖1的10(w/v)％溶液，P10＝泊咯沙姆188的10(w/v)％溶液， T10＝葡聚糖5的10(w/v)％溶液。

在本发明中所使用的试验物质利用如下方法制备：反映溶解在细胞培养液中最大浓度，在葡聚糖1(D)为1～50(w/v)％、葡聚糖5(T)为成1～40(w/v)％、泊咯沙姆188(P)为1～35(w/v)％的范围内制备单一物质。在制备混合物的情况下，分别以1：1(v：v)体积比混合两种单一物质来制备。

在作为用于细胞培养而制备的培养基的完全培养基(complete media) (包含所有10％的胎牛血清(fetal bovine serum)、2mL的L-谷氨酰胺 (L-glutamine)、50U/mL的青霉素(penicilin)、50ug/mL的链霉素 (streptomycin)的最低必需培养基)中分解按给药浓度(w/v)完全溶解葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188。通过将试验物质完全溶解于完全培养基来用于均质化，在低温下，尤其，在泊咯沙姆188的情况下，在较低温度下，用无菌抹刀，棍棒，磁力棒(magnetic bar)等缓慢搅拌，或者通过以不会气泡的程度轻轻摇晃几次来使其溶解直到完全透明而没有悬浮物为止。试验物质完全溶解后，用0.22μm的孔径注射器过滤器(pore size syringe filter)过量后密封冷藏保管。

更具体地，单一物质的制备通过如下方法进行。

制备葡聚糖1的5％的单一物质('D5')

在制备葡聚糖1的5％的试验溶液的情况下，分别取5g的葡聚糖1并完全溶解于完全培养基并定容至100mL来制备5(w/v)％的D试验溶液。利用0.22μm的孔径注射器过滤器过滤这样以0.05g/mL的浓度溶解的试验物质，并冷藏保管后待用。

5％的葡聚糖1和10％的泊咯沙姆188的的混合物('D5+P10')制备

分别制备D5和P10，利用0.22μm的孔径注射器过滤器过滤来冷藏保管后，将每个容量以1：1(v：v)比例混合后，低速摇晃避免起泡后，待用。

比较例：制备吲哚美辛处理组(IM)

吲哚美辛以5mM的浓度完全溶解于二甲基亚砜(DMSO)后，用完全培养基稀释，并利用0.22μm的孔径注射器过滤器过滤后，处理于细胞时将最终浓度为调节至5μM。

比较例：制备透明质酸钠处理组(HN)

透明质酸钠是在阿拉贡注射器(25mg/2.5mL的透明质酸钠，装在一次性灭菌注射器中的药剂形态)中吸入完全培养基并用25mg/3mL的透明质酸钠(＝8.33mg/mL的透明质酸钠)稀释后，直接使用。

1.4设定给药方法

在从大鼠分离的原代培养软骨细胞的情况下，倍增时间(doubling time)约为24小时，因此增殖及稳定适当时处理了试验物质。在48孔(well) 或24孔板(well plate)培养软骨细胞后，将各个试验物质给药一次，在用于诱导关节炎的重组人白细胞介素-1α处理1小时前，按各个试验物质的浓度投入试验溶液，以使浓度为总培养液容量的20％(v/v)。用重组人白细胞介素-1α处理24小时后，取培养液进行分析实验。但是，当确认有关软骨细胞的试验物质的毒性或增殖能力时，未处理重组人白细胞介素-1α，而仅处理试验物质。

1.5统计学分析

所有实验结果利用t检验(student T-test)在p<0.05的水平上与正常对照组(NC)或炎症诱发阳性对照组(PC)进行比较分析，并示出显著性。

实施例2.细胞毒性分析

通过确认软骨细胞的增殖能力是否根据试验物质处理而变化，进行细胞毒性分析。细胞增殖能力评价均在未处理重组人白细胞介素-1α的未处理软骨细胞和通过处理重组人白细胞介素-1α来诱发炎症的软骨细胞中均进行，将各个试验物质处理于大鼠软骨细胞后培养24小时及48小时，然后进行噻唑基蓝四唑蓝分析(Thiazolyl Blue TetrazoliumBlue，MTT；Sigma， M5655)。在利用作为炎症诱发物质的重组人白细胞介素-1α诱导的关节炎体外模型中的试验物质的细胞增殖能力评价中，在重组人白细胞介素-1α处理1小时前，将各个试验物质处理于大鼠软骨细胞并培养24小时及48 小时后进行噻唑基蓝四唑蓝分析(Sigma，M5655)，其结果如图1至图4所示。

如图1所示，在未诱发炎症的大鼠膝盖关节软骨细胞中，观察葡聚糖 1、葡聚糖5、泊咯沙姆188或其混合物的细胞增殖率24小时的结果确认，大多数的葡聚糖1、葡聚糖5、泊咯沙姆188及其混合物对细胞没有毒性，而有助于细胞增殖。但是，在单一处理组中泊咯沙姆188处理组的情况下，将泊咯沙姆188以25(w/v)％(P25)、35(w/v)％(P35)的浓度培养 24小时时，部分细胞增殖能力的降低低于作为对照药物(市售药物)的透明质酸钠(HN)给药组，因此不适于单一给药。并且，在它们的混合物中，当培养24小时时，出现部分细胞增殖能力的降低，由此确认，在泊咯沙姆 188的情况下，在以高浓度处理的情况下，可诱发细胞毒性。并且，在混合物中，在D50+P35、P5+T40、P25+T40、P35+T40实验组中，细胞增殖能力的降低低于作为对照药物(市售药物)的透明质酸钠(HN)给药组。

如图2所示，在未诱发炎症的大鼠膝盖关节软骨细胞中观察葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物的细胞增殖率48小时的结果也确认，具有与培养24 小类似的结果。

通过这些结果确认，对正常膝盖关节软骨细胞处理时，即使将葡聚糖 1(D)的浓度增加至50％或将葡聚糖5(T)的浓度增加至40％，相对于市售药物，其软骨细胞的增殖并没有受到抑制，相反，在泊咯沙姆188的情况下，在25％以上的浓度下，可对软骨细胞具有毒性。并且，在由混合物形成的情况下，与泊咯沙姆188单独相比，细胞增殖能力部分得到改善，但是，为了不诱发毒性，优选地，以10(w/v)％以下的浓度混合泊咯沙姆188。

在图3及图4中示出在根据处理重组人白细胞介素-1α的骨关节炎体外模型中，分别观察根据处理实验组的细胞增殖率24小时和48小时的结果。

如图3所示，在骨关节炎模型中，泊咯沙姆188也在浓度变高的情况下抑制细胞增殖，而葡聚糖1及葡聚糖5，即使浓度变高也不会抑制细胞增殖。在泊咯沙姆188的情况下，在P10单独处理组中确认细胞增殖被抑制，但是，将其与D5、D50、T4、T40等混合使用的情况下，具有细胞增殖效果，当与葡聚糖混合处理时，可使用1(w/v)％至10(w/v)％的泊咯沙姆188。

在图4中可以确认与培养24小时相同的结果，确认P10处理组的细胞增殖能力通过与葡聚糖1或葡聚糖5的混合而增加。

综合以上结果确认，葡聚糖1及葡聚糖5在正常及炎症诱发细胞中不会诱导细胞毒性。相反，泊咯沙姆188随着浓度的增加，在用单一物质处理的情下，在正常细胞及炎症诱发细胞中均可以诱发细胞增殖能力抑制，在将1(w/v)％至10(w/v)％的泊咯沙姆188与葡聚糖1或葡聚糖5混合给药的情况下，可以在没有细胞毒性的情况下使用。

实施例3.通过白细胞介素-10/白细胞介素-6表达比确认抗炎效果

进行了用于确认葡聚糖1、葡聚糖5或泊咯沙姆188的抗炎效果的实验。具体地，通过将葡聚糖1改为2.5(w/v)％至50(w/v)％、葡聚糖5 改为2(w/v)％至40(w/v)％、泊咯沙姆188改为1(w/v)％至20(w/v) ％来进行单一给药或混合给药，并确认基于此的白细胞介素-10/白细胞介素 -6表达比。为了诱发炎症，处理了作为炎症诱发物质的重组人白细胞介素-1α，确认重组人白细胞介素-1α与试验物质(单一物质，它们的混合物) 一起处理时的白细胞介素-10/白细胞介素-6表达比。可以判断白细胞介素 -10/白细胞介素-6表达比越增加，抗炎效果越优秀。

使用于实验中的引物的构成如下述表2所示，作为对照组使用作为管家基因的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。其结果如表3a至表3b及图5所示

表2

混合该引物、SyBr green(SYBR Premix Ex Taq，Takara，RR420A) 和模板后，利用实时逆转录-聚合酶链反应(Real time RT-PCR)(CFX 96 touch，Bio rad，Hercules，CA，USA)进行基于嵌入(intercalating)法的实时逆转录-聚合酶链反应。通过将Ct值应用于校正曲线获得的定量结果 (基因表达量)表示为该值除以作为管家基因的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的定量结果的值。

表3a

在将重组人白细胞介素-1α处理24小时的软骨细胞中葡聚糖1(D)、葡聚糖5(T)、泊咯沙姆188(P)单一物质的白细胞介素-10/白细胞介素 -6基因表达比

表3b

在将重组人白细胞介素-1α处理24小时的软骨细胞中葡聚糖1(D)、葡聚糖5(T)或泊咯沙姆188(P)混合物的白细胞介素-10/白细胞介素-6 基因表达比

如表3a及图5所示，在单独处理作为单一组处理实验的葡聚糖1(D) 的组中，除了50(w/v)％的处理组以外，没有清楚地确认到白细胞介素-10/ 白细胞介素-6表达比的增加，但在1(w/v)％至20(w/v)％的泊咯沙姆 188(P)处理组、2(w/v)％至20(w/v)％的葡聚糖5(T)组中，确认到显著的增加效果。

如表3b及图5所示，在作为混合物处理实验的葡聚糖1(D)的混合物给药组中均具有显著的白细胞介素-10/白细胞介素-6表达比的增加效果，在泊咯沙姆188(P)及葡聚糖5(T)的混合给药组中也具有均显著的增加，因此确认到混合物中的抗炎功效优秀。

在50(w/v)％的葡聚糖1的给药组中，白细胞介素-10/白细胞介素-6 表达比的增加显著，但考虑到其增加量不显著，骨关节炎模型中的白细胞介素-10/白细胞介素-6表达比增加，即，与增加葡聚糖1(D)的浓度相比，通过与泊咯沙姆188(P)或葡聚糖5(T)尽兴混合来给药时抗炎效果更好。尤其，与5(w/v)％至50(w/v)％的葡聚糖1(D)、4(w/v)％至40 (w/v)％的葡聚糖5(T)、2(w/v)％至10(w/v)％的泊咯沙姆188(P) 的单独给药组相比，它们的混合物给药组的抗炎效果大多数为显著优秀，由此，可以确认葡聚糖1(D)、葡聚糖5(T)、泊咯沙姆188(P)混合给药的优秀性。

尤其，葡聚糖1(D)、葡聚糖5(T)、泊咯沙姆188(P)混合给药在5(w/v)％至50(w/v)％的葡聚糖1(D)、4(w/v)％至40(w/v) ％的葡聚糖5(T)、2(w/v)％至10(w/v)％的泊咯沙姆188(P)的所有范围下均具有优秀的抗炎症效果，这些所有组合均具有抗炎症效果，由此，确认对炎性疾病的治疗有效。

实施例4.通过基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-13基因表达变化确认软骨基质再生效果

通过用于评价骨关节炎的指标物质的基因表达，进行了用于确认骨关节炎治疗效果的实验。基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-13是破坏软骨基质的蛋白质，因此，若能有效地抑制可通过炎症刺激来诱导的上述基因表达量的增加，则可以评价出软骨保护效果优秀。

通过改变葡聚糖1为2.5(w/v)％至50(w/v)％、葡聚糖5为2(w/v) ％至40(w/v)％、泊咯沙姆188为1(w/v)％至20(w/v)％来进行单一给药或混合给药来确认基于此的基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-13 的表达变化。具体地，在重组人白细胞介素-1α处理1小时之前，将各个试验物质处理于大鼠软骨细胞后培养24小时。去除培养细胞的上清液红藕，利用磷酸缓冲溶液(PBS)清洗细胞。从清洗的细胞分离核糖核酸(GeneAll hybrid-R RNApurification kit；GeneAll，3033522)，利用nanodrop(Take3 Multi-Volume plate，BioTeK，Instruments，VT，USA)定量分离的核糖核酸后，按每个实验组稀释至相同浓度。通过聚合酶链式反应将稀释至等量的核糖核酸合成至并互补脱氧核糖核酸(cDNA)(ReverTraAceR qPCR RT Master Mix with gDNA Remover，Toyobo，FSQ-301)。利用合成的互补脱氧核糖核酸，通过实时逆转录-聚合酶链反应在96孔板中确认基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-13的基因表达。

使用于实验中的引物的结构如下述表4所示，作为对照组使用了作为管家基因的甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

表4

混合该引物、SyBr green(SYBR Premix Ex Taq，Takara，RR420A)和模板后，利用实时逆转录-聚合酶链反应(CFX 96touch，Bio rad，Hercules， CA，USA)进行基于嵌入法的实时逆转录-聚合酶链反应。通过将Ct值应用于校正曲线获得的定量结果(基因表达量)表示为该值除以作为管家基因的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的定量结果的值。

3.1确认基质金属蛋白酶-3表达变化

将根据葡聚糖1、葡聚糖5、泊咯沙姆188单一或其混合物处理的基质金属蛋白酶-3的表达结果示出在表5a至表5b及图6中。

表5a

将重组人白细胞介素-1α处理24小时的软骨细胞

中葡聚糖1(D)、葡聚糖5(T)、泊咯沙姆188(P)单一物质的基质金属蛋白酶-3基因表达量

表5b

重组人白细胞介素-1α处理24小时的软骨细胞中葡聚糖1(D)、葡聚糖5(T)或泊咯沙姆188(P)混合物的基质金属蛋白酶-3基因表达量

如上述表5a及图6所示，相对于炎症诱发阳性对照组，葡聚糖1(D) 在2.5(w/v)％至40(w/v)％浓度下具有显著的基质金属蛋白酶-3降低效果，而葡聚糖5(T)在2(w/v)％至20(w/v)％浓度下具有显著的基质金属蛋白酶-3降低效果。另一方面，泊咯沙姆188(P)在作为进行实验的所有组的1(w/v)％至20(w/v)％中具有降低效果。

如表5b及图6所示，在混合物实验组中确认到，在5(w/v)％的葡聚糖1(D)和2(w/v)％至10(w/v)％的泊咯沙姆188(P)、4％至40 (w/v)％的葡聚糖(T)所有实验组中具有显著效果，但是在以高达50(w/v) ％的高浓度处理葡聚糖1(D)的组中，仅在与P2混合时才确认到显著降低效果。因此，在将葡聚糖1与葡聚糖5或泊咯沙姆188混合的情况下，优选地，以小于50(w/v)％的浓度进行混合。泊咯沙姆188在单独处理及混合处理组中，大多数具有显著的基质金属蛋白酶-3降低效果，但在实施例2中确认，优选地，泊咯沙姆的浓度为10(w/v)％以下，相应的P2、 P5、P10与葡聚糖1及葡聚糖5的组合中也可诱导显著的基质金属蛋白酶 -3抑制效果。

3.2确认基质金属蛋白酶-13表达变化

将根据葡聚糖1、葡聚糖5、泊咯沙姆188单一或其混合物处理的基质金属蛋白酶-13的表达结果示出在表6a至表6b及图7中。

表6a

将重组人白细胞介素-1α处理24小时的软骨细胞中葡聚糖1(D)、葡聚糖5(T)、泊咯沙姆188(P)单一物质的基质金属蛋白酶-13基因表达量

表6b

重组人白细胞介素-1α处理24小时的软骨细胞中葡聚糖1(D)、葡聚糖5(T)或泊咯沙姆188(P)混合物的基质金属蛋白酶-13基因表达量

从上述表6a至表6b、图7中可以确认，在单一物质实验组中，葡聚糖1(D)在2.5(w/v)％至25(w/v)％浓度下具有显著的抑制基质金属蛋白酶-13基因增加的效果，D40在40(w/v)％浓度下不显著，但基质金属蛋白酶-13基因增加受到抑制，D50在50(w/v)％浓度下反而基质金属蛋白酶-13水平增加。在葡聚糖1(D)的混合物中也具有类似的这种特性。因此，确认葡聚糖1(D)的最优选的浓度范围在2.5(w/v)％至40(w/v) ％，这是与基质金属蛋白酶-3基因表达量结果一致的结果。将单独给药葡聚糖5(T)时，在2(w/v)％至40(w/v)％浓度下具有显著的抑制基质金属蛋白酶-13基因增加的效果，4(w/v)％及40(w/v)％的葡聚糖5(T)在与5(w/v)％的葡聚糖1(D)及2(w/v)％至10(w/v)％的泊咯沙姆188(P)的混合中也具有显著的抑制基质金属蛋白酶-13基因增加的效果。

在泊咯沙姆188的情况下，在单独实验组中在5(w/v)％至20(w/v) ％浓度下具有抑制基质金属蛋白酶-13基因增加的效果，但是，在与葡聚糖以混合物给药的情况下，确认到在2(w/v)％浓度下也可具有效果。考虑到实施例2中的细胞毒性实验结果，优选地，混合给药时泊咯沙姆188(P) 的浓度为2(w/v)％至10(w/v)％。除了与50(w/v)％的葡聚糖1(D)的组合以外，相应的P2、P10与葡聚糖1及葡聚糖5的组合中也均具有诱导抑制质金属蛋白酶-13基因增加的效果。

通过如上所述的结果，P2、P5、P10与葡聚糖1及葡聚糖5的组合中也诱导的显著的基质金属蛋白酶-13抑制效果。

实施例5.确认骨关节炎模型中的II型胶原蛋白(Type II Collagen)及聚蛋白多糖(Aggrecan)的生成量的增加

为了确认用于评价骨关节炎的指标物质中II型胶原蛋白和聚蛋白多糖蛋白质生成量，在重组人白细胞介素-1α处理1小时之前，将每个试验物质处理于软骨细胞后培养24小时。II型胶原蛋白和聚蛋白多糖为软骨基质组合物，因此，若其生成量增加，则可以判断出软骨基质保护效果优秀。

其中，通过回收细胞上清液(培养液)于13000rpm下离心10分钟，仅将上清液用于分析中。利用离心的细胞上清液，进行参照聚蛋白多糖酶联免疫吸附法试剂盒(AggrecanELISA Kit)(Rat Aggrecan ELISA Kit， Mybiosource，MBS261073)和II型胶原蛋白(typeII Collagen)(Type II Collagen detection Kit，Multi-Species，Chondrex，6018)产品的手册(manual) 的分析。为了进行准确的分析，利用全坡长的酶标仪(ELISA reader)(EPOCH 2microplate reader，BioTek，Instruments，VT，USA)，分别测量450nm和490nm处吸光度后，根据校正曲线定量II型胶原蛋白和聚蛋白多糖的含量(ng/mL)。

5.1确认II型胶原蛋白的生成量

将根据葡聚糖1(D)、葡聚糖5(T)、泊咯沙姆188(P)单一或其混合物的II型胶原蛋白的生成量结果示出在表7a至表7b及图8中。

表7a

将重组人白细胞介素-1α处理24小时的软骨细胞中葡聚糖1(D)、葡聚糖5(T)、泊咯沙姆188(P)单一物质的II型胶原蛋的生成量

表7b

重组人白细胞介素-1α处理24小时的软骨细胞中葡聚糖1(D)、葡聚糖5(T)或泊咯沙姆188(P)混合物的II型胶原蛋的生成量

如上述表7a至表7b及图8所示，相对于炎症诱发阳性对照组(PC)，在5(w/v)％至25(w/v)％的葡聚糖1(D)、4(w/v)％至40(w/v) ％的葡聚糖5(T)单独给药组中，观察到II型胶原蛋白合成增加。另一方面，相对于炎症诱发阳性对照组(PC)，在50(w/v)％的葡聚糖1(D)单独以及与葡聚糖5(T)、泊咯沙姆188(P)的混合给药组中均不会诱导增加II型胶原蛋白合成。这表明，如实施例4种所确认，单独的50(w/v) ％的葡聚糖1(D)不具有抑制基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-13的表达增加的效果，而考虑到只有与2(w/v)％至10(w/v)％的泊咯沙姆 188(P)混合中可以抑制基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-13的表达增加，优选地，葡聚糖1(D)以40(w/v)％以下的浓度单独使用或混合使用的结果。尤其，相对于炎症诱发阳性对照组(PC)，在混合给药5(w/v) ％的葡聚糖1(D)和4(w/v)％至40(w/v)％的葡聚糖5(T)时，II 型胶原蛋白合成显著增加。

在泊咯沙姆188(P)的情况下，除了2(w/v)％处理组，在10(w/v) ％、20(w/v)％的单独处理组中，均未观察到II型胶原蛋白合成增加的效果，确认II型胶原蛋白合成随着浓度的增加而进一步减少。但是，在混合给药2(w/v)％或10(w/v)％的泊咯沙姆188(P)与5(w/v)％的葡聚糖1(D)或40(w/v)％的葡聚糖5(T)的情况下，II型胶原蛋白合成增加效果显著。这些结果表明，在骨关节炎的II型胶原蛋白合成中，可以单独处理葡聚糖1(D)、葡聚糖5(T)，但是除了2(w/v)％的泊咯沙姆 188(P)，泊咯沙姆188(P)不适于单独处理，泊咯沙姆188(P)与葡聚糖1(D)或葡聚糖5(T)的混合给药可有效地诱导II型胶原蛋白合成。

在实施例3中确认，与单独给药相比，泊咯沙姆188与葡聚糖1或葡聚糖5的混合给药可使白细胞介素-10/白细胞介素-6的基因表达比例显著增加，综上所述，为了缓解骨关节炎中的炎症反应并时促进胶原蛋白合成，优选地，给药葡聚糖1、葡聚糖5或泊咯沙姆188的混合物。

5.2确认聚蛋白多糖含量定量结果

将根据葡聚糖1、葡聚糖5、泊咯沙姆188单一或其混合物处理的聚蛋白多糖生成量结果示出在表8a至表8b及图9中。

表8a

表8b

重组人白细胞介素-1α处理24小时的软骨细胞中葡聚糖1(D)、葡聚糖5(T)、泊咯沙姆188(P)混合物的聚蛋白多糖生成量

从上述表6a及图9中可以确认，相对于炎症诱发阳性对照组(PC)，在5(w/v)％至25(w/v)％的葡聚糖1(D)、4(w/v)％的葡聚糖5(T)、 2(w/v)％至10(w/v)％的泊咯沙姆188(P)单独处理组中，聚蛋白多糖生成量显著增加。另一方面，50(w/v)％的葡聚糖1(D)、20(w/v)％的泊咯沙姆188(P)、20(w/v)％至40(w/v)％的葡聚糖5(T)单独给药组不会诱导增加聚蛋白多糖生成。

从表8b及图9中可以确认，相对于炎症诱发阳性对照组(PC)，在混合给药组中，在5(w/v)％的葡聚糖1(D)和2(w/v)％的泊咯沙姆 188(P)、或4(w/v)％至40(w/v)％葡聚糖5(T)的混合给药组中的聚蛋白多糖生成量显著增加，仅在50(w/v)％的葡聚糖1(D)和2(w/v)％的泊咯沙姆188(P)的混合给药组中聚蛋白多糖生成量显著增加。与炎症诱发阳性对照组(PC)相比，在4(w/v)％至40(w/v)％的葡聚糖5 (T)和2(w/v)％至10(w/v)％的泊咯沙姆188(P)之间的混合给药组中聚蛋白多糖生成量也显著增加。尤其，与单独给药5(w/v)％的葡聚糖1(D)和2(w/v)％的泊咯沙姆188(P)相比，在于4(w/v)％至40 (w/v)％的葡聚糖5(T)混合给药时聚蛋白多糖生成量显著增加。

在一起考虑在实施例5.1中确认的II型胶原蛋白合成的结果的情况下，在骨关节炎模型中，为了增加II型胶原蛋白合成并增加聚蛋白多糖的生成，优选地，单独给药5(w/v)％至25(w/v)％的葡聚糖1(D)、4 (w/v)％的葡聚糖5(T)、或2(w/v)％的泊咯沙姆188(P)，或者将 5(w/v)％葡聚糖1(D)与4(w/v)％至40(w/v)％的葡聚糖5(T) 混合给药，或者将5(w/v)％的葡聚糖1(D)与2(w/v)％的泊咯沙姆 188(P)混合给药。并且，4(w/v)％至40(w/v)％的葡聚糖5(T)与 5(w/v)％的葡聚糖1(D)的组合中，尤其，在40(w/v)％的葡聚糖5 的情况下，在与2(w/v)％至10(w/v)％的泊咯沙姆188(P)的组合中，可使II型胶原蛋白合成和聚蛋白多糖的生成显著增加。

综上所述，在骨关节炎治疗中，可以使用葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188，但并非这些单独或所有组合均对骨关节炎治疗有效，根据葡聚糖1、葡聚糖5及泊咯沙姆188的浓度组合毒性及效果可能不同，因此，可以确认重要的是得到其适当的组合。

序列表

<110> 医药产业园有限公司（MEDICINE PARK CO., LTD）

<120> 包含葡聚糖或泊咯沙姆的用于治疗关节疾病或***病的组合物

<130> LIH1.1

<150> KR 10-2017-0165271

<151> 2017-12-04

<160> 10

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP-3 正向引物（MMP-3 forward primer）

<400> 1

tgggaagcca gtggaaatg 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP-3 反向引物（MMP-3 reverse primer）

<400> 2

ccatgcaatg ggtaggatga g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP-13 正向引物（MMP-13 forward primer）

<400> 3

ctgacctggg atttccaaaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP-13 反向引物（MMP-13 reverse primer）

<400> 4

acacgtggtt ccctgagaag 20

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH 正向引物（GAPDH forward primer）

<400> 5

ctcaactaca tggtctacat gttcca 26

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH 反向引物（GAPDH reverse primer）

<400> 6

cttcccattc tcagccttga ct 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-6 正向引物（IL-6 forward primer）

<400> 7

tgatggatgc ttccaaactg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-6 反向引物（IL-6 reverse primer）

<400> 8

gagcattgga agttggggta 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-10 正向引物（ IL-10 forward primer）

<400> 9

gttgccaagc cttgtcagaa a 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-10 反向引物（IL-10 reverse primer）

<400> 10

tttctgggcc atggttctct 20

Claims

1.一种用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，包含葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，上述葡聚糖具有500Da至10000Da的分子量。

3.根据权利要求1所述的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，上述泊咯沙姆具有100Da至20000Da的分子量。

4.根据权利要求1所述的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，上述葡聚糖为葡聚糖1，作为单一有效成分包含在组合物中，葡聚糖1的浓度为2(w/v)％至40(w/v)％。

5.根据权利要求1所述的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，上述葡聚糖为葡聚糖5，作为单一有效成分包含在组合物中，葡聚糖5的浓度为2(w/v)％至30(w/v)％。

6.根据权利要求1所述的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，上述泊咯沙姆作为单一有效成分包含在组合物中，泊咯沙姆的浓度为1(w/v)％至15(w/v)％。

7.根据权利要求1所述的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，上述混合物为葡聚糖5及泊咯沙姆的混合物，上述葡聚糖5的浓度为2(w/v)％至40(w/v)％，上述泊咯沙姆的浓度为1(w/v)％至20(w/v)％。

8.根据权利要求1所述的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，上述混合物为葡聚糖5及葡聚糖1的混合物，上述葡聚糖5的浓度为2(w/v)％至40(w/v)％，上述葡聚糖1的浓度为2.5(w/v)％至40(w/v)％。

9.根据权利要求1所述的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，上述混合物为葡聚糖1及泊咯沙姆的混合物，上述葡聚糖1的浓度为2.5(w/v)％至40(w/v)％，上述泊咯沙姆的浓度为1(w/v)％至5(w/v)％。

10.根据权利要求1所述的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，上述混合物为葡聚糖1及泊咯沙姆的混合物，上述葡聚糖1的浓度为45(w/v)％至55(w/v)％，上述泊咯沙姆的浓度为1(w/v)％至2(w/v)％。

11.根据权利要求1所述的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，上述组合物中葡聚糖：泊咯沙姆的浓度(w/v)％之比为1：0.01至1：40。

12.根据权利要求8所述的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，上述组合物中葡聚糖1及葡聚糖5的浓度(w/v)％之比为1：0.01至1：20。

13.根据权利要求1所述的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，上述泊咯沙姆选自由泊咯沙姆101、泊咯沙姆105、泊咯沙姆105苯甲酸酯、泊咯沙姆108、泊咯沙姆122、泊咯沙姆123、泊咯沙姆124、泊咯沙姆181、泊咯沙姆182、泊咯沙姆182二苯甲酸酯、泊咯沙姆183、泊咯沙姆184、泊咯沙姆185、泊咯沙姆188、泊咯沙姆212、泊咯沙姆215、泊咯沙姆217、泊咯沙姆231、泊咯沙姆234、泊咯沙姆235、泊咯沙姆237、泊咯沙姆238、泊咯沙姆282、泊咯沙姆284、泊咯沙姆288、泊咯沙姆331、泊咯沙姆333、泊咯沙姆334、泊咯沙姆335、泊咯沙姆338、泊咯沙姆401、泊咯沙姆402、泊咯沙姆403及泊咯沙姆407组成的组中。

14.根据权利要求1所述的用于预防或治疗关节疾病或***病的药学组合物，其特征在于，上述***病为选自由炎性骨关节疾病、炎性皮炎、炎性眼病、炎性肌炎、炎性胃肠疾病、软骨病、血管炎及扭伤组成的组中的一种以上疾病。

15.一种用于再生软骨的组合物，其特征在于，包含葡聚糖、泊咯沙姆或其混合物作为有效成分。