CN111596060A - ***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒，属于体外检测技术领域。该试剂盒包括：校准品、磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3；所述的磁颗粒反应液R1包含链酶亲和素磁珠、缓冲液和防腐剂；所述的示踪结合物反应液R2包含吖啶酯标记的p2PSA抗体或tPSA抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；所述的捕获抗体反应液R3包含生物素标记的tPSA抗体或p2PSA抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。本发明还提供一种所述试剂盒的制备方法。本发明的***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒检测灵敏度高、可靠性好，成本低，适合推广使用。

Description

***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒及其 制备方法
技术领域
本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
***癌是危害中老年男性健康的常见恶性肿瘤，血清***特异性抗原(prostate–specific antigen，PSA)检测联合直肠指检是较早期发现***癌的初筛方法，对于筛查可疑的病例可进行***穿刺活检以助诊断。但当患者总PSA(total PSA，tPSA)在4.0～10.0μg/L，即传统观点的灰区时，难以用PSA进行明确的鉴别诊断。虽然可同时进行游离PSA(free PSA，fPSA)检测并计算fPSA与tPSA的比值(f/tPSA)加以鉴别，但收效并不明显。
血清***特异性抗原同源异构体2(isoform[-2]proprostate-specificantigen，p2PSA)是PSA前体的一种同源异构体，具有不被水解的稳定性、肿瘤特异性、组织区域特异性的特点，目前越来越多的研究表明：与传统的PSA等相比，检测及经计算得到的百分p2PSA(％，p2PSA)和***健康指数(prostate health index,PHI)能显著提高***癌(Prostate cancer,PCa)的诊断特异性，减少不必要的***穿刺活检，并且在肿瘤恶性度预测及低风险、局限性的PCa患者的主动监测中均显示出良好的应用价值。
定量检测血清中的***特异性抗原同源异构体(p2PSA)，对***癌的诊断起辅助作用。在国内，血清***特异性抗原同源异构体(p2PSA)检测临床主要以国外贝克曼公司试剂应用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在基层普及。因此，有待开发一种检测灵敏度高、可靠性好的血清***特异性抗原同源异构体检测试剂盒，以降低患者使用成本，并提高推广使用。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种检测灵敏度高、可靠性好的***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，以降低患者使用成本，并提高推广使用。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒，包括：校准品、磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3；
所述的磁颗粒反应液R1包含链酶亲和素磁珠、缓冲液和防腐剂；
所述的示踪结合物反应液R2包含吖啶酯标记的p2PSA抗体或吖啶酯标记的tPSA抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；
所述的捕获抗体反应液R3包含生物素标记的tPSA抗体或生物素标记的p2PSA抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。
在上述技术方案中，所述的磁颗粒反应液R1中链酶亲和素磁珠的质量浓度为0.03％-0.1％；所述的示踪结合物反应液R2中吖啶酯标记的p2PSA抗体或吖啶酯标记的tPSA抗体的浓度为0.1-3μg/mL；所述的捕获抗体反应液R3中生物素标记的tPSA抗体或生物素标记的p2PSA抗体的浓度为0.5-8μg/mL。
在上述技术方案中，所述的磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中防腐剂为NaN3、Proclin 300或Proclin 950，所述的防腐剂的质量浓度为0.01％-1％。
在上述技术方案中，所述的示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中的NaCl的浓度为0.15mol/L。
在上述技术方案中，所述的示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中的蛋白稳定剂为BSA、酪蛋白、及BGG中的一种或几种，所述的蛋白稳定剂的质量浓度为0.1％-10％。
在上述技术方案中，所述的示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中的表面活性剂为吐温、聚乙二醇或者曲拉通，所述的表面活性剂的质量浓度为0.01％-1％。
在上述技术方案中，所述的磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中缓冲液为2-(N-***啉)乙磺酸(MES)、哌嗪-NN-双(2-乙磺酸)(PIPES)、3-(N-码啡基)-2-羟基丙磺酸钠(MOPSO)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)或者Tris-盐酸，其pH6.0-8.0，浓度为10-600mmoL/L。
在上述技术方案中，所述的示踪结合物反应液R2中的阻断剂为IgG、罗氏、或者Scantibody，所述阻断剂的浓度范围为10-500μg/mL。
本发明还提供一种***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：磁颗粒反应液R1的制备
将缓冲液和防腐剂混合，配制成R1基础缓冲液；
取链酶亲和素磁珠，用PBS缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至R1基础缓冲液中，配成磁颗粒反应液R1；
步骤二：示踪结合物反应液R2的制备
将NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R2基础缓冲液；
取p2PSA抗体或tPSA抗体，与溶解于溶剂中的吖啶酯溶液进行标记，标记时间1-12小时，反应过程需要避光，标记反应结束后，纯化，收集纯化后的原液进行抗体定量，得到吖啶酯标记的p2PSA抗体或吖啶酯标记的tPSA抗体；
取吖啶酯标记的p2PSA抗体或吖啶酯标记的tPSA抗体置于R2基础缓冲液中，配成示踪结合物反应液R2；
步骤三：捕获抗体反应液R3的制备
将NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R3基础缓冲液；
取tPSA抗体或p2PSA抗体，与溶解于溶剂中的生物素溶液进行标记，标记时间2-24h，反应过程需要避光，标记反应结束后，纯化，收集纯化后的原液进行抗体定量，得到生物素标记的tPSA抗体或生物素标记的p2PSA抗体；
取生物素标记的tPSA抗体或生物素标记的p2PSA抗体置于R3基础缓冲液中，配制成捕获抗体反应液R3；
步骤四：配制校准品。
在上述技术方案中，步骤二中p2PSA抗体或tPSA抗体和吖啶酯溶液按照摩尔浓度1：1-20的比例进行标记；步骤三中tPSA抗体或p2PSA抗体和生物素溶液按照摩尔浓度1：1-50的比例进行标记。
本发明的有益效果是：
本发明的***特异性抗原同源异构体(p2PSA)化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒以链霉亲和素磁颗粒作为固相载体，双抗体夹心原理进行检测，结合发光强度和灵敏度都较高的化学发光物质对p2PSA抗体(或tPSA抗体)进行标记，采用硝酸/氢氧化钠化学发光体系，以双抗体夹心法实现对p2PSA的定量检测，该试剂盒选择吖啶酯为化学发光免疫分析***的标记材料，该材料有激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本；采用链霉亲和素磁珠与生物素标记的类似物可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强。本发明的***特异性抗原同源异构体(p2PSA)化学发光免疫检测试剂盒为全自动的测量样本，并直接给出数值，减少人为操作误差，并且实现无人值守，缩短了临床检测所需的时间，同时检测精度较高，试剂与仪器组成封闭***，***误差小。
本发明的***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，工艺简单，制得的试剂盒具有检测灵敏度高、可靠性好、成本低、适合推广使用的优点。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为实施例1试剂盒的定标曲线。
具体实施方式
本发明的发明思想为：化学发光免疫测定(CLIA)是继酶免技术、放免技术、荧光免疫技术和时间分辨荧光免疫技术之后发展的一项新兴免疫测定技术。由于它既具有免疫反应的高度特异性，又具有发光反应的高敏感性，近年来已被国内外临床实验室及科研单位广泛应用于各种激素、特种蛋白及药物的监测和分析。该方法具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、试剂稳定性好、操作简便、容易实现自动化的优点，是理想的临床微量生化检验分析手段。常见的化学发光体系有多种，最主要的有：HRP-鲁米诺体系、吖啶酯发光体系、电化学发光体系等。吖啶酯发光体系相对于其他体系而言具有其特殊的优点：首先吖啶酯标记工艺简单，标记物发光稳定，试剂盒有效期长，成本相对较低；且发光为闪光型，发光快速集中且强大，方便实现快速检测，检测的灵敏度和精密度都很高，对于仪器的要求简单，便于实现全自动化操作；其次，吖啶酯发光***较为简单，碱性-过氧化氢就可以直接发光，不需要增强剂或者催化剂，干扰因素少，本底极低，信噪比很高。
基于以上情况，研制开发高特异性、高灵敏度的吖啶酯类***特异性抗原同源异构体(p2PSA)化学发光免疫分析试剂盒，定量检测血清中的***特异性抗原同源异构体(p2PSA)，对***癌的诊断起辅助作用，从理论与实际意义上讲是切实可行，并有广泛市场前景。
本发明提供一种***特异性抗原同源异构体(p2PSA)化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：校准品、磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3；
所述的校准品浓度为0pg/mL，10pg/mL，20pg/mL，50pg/mL，100pg/mL，500pg/mL。校准品基质配方为pH7.4的磷酸缓冲液，0.15mol/L NaCl，质量浓度为5％的BSA。
所述的磁颗粒反应液R1包含链酶亲和素磁珠、缓冲液和防腐剂；所述的磁颗粒反应液R1中，链酶亲和素磁珠的质量浓度优选为0.03％-0.1％；所述的链酶亲和素磁珠的粒径优选为1-3μm；
所述的示踪结合物反应液R2包含吖啶酯标记的p2PSA抗体或tPSA抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；所述的示踪结合物反应液R2中，吖啶酯标记的p2PSA抗体或tPSA抗体的浓度优选为0.1-3μg/mL，NaCl的浓度优选为0.15mol/L；
所述的捕获抗体反应液R3包含生物素标记的tPSA抗体或p2PSA抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂，所述的捕获抗体反应液R3中，生物素标记的tPSA抗体或p2PSA抗体的浓度优选为0.5-8μg/mL，NaCl的浓度优选为0.15mol/L；
按照本发明，所述的磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中的缓冲液缓冲范围优选pH6.0-8.0，更优选pH6.0-7.4，作为缓冲盐可以使用2-(N-***啉)乙磺酸(MES)、哌嗪-NN-双(2-乙磺酸)(PIPES)、3-(N-码啡基)-2-羟基丙磺酸钠(MOPSO)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、或者Tris-盐酸，缓冲盐的浓度优选为10-600mmoL/L，更优选为25-400mmoL/L。
按照本发明，所述的磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中的防腐剂优选为叠氮钠(NaN3)、Proclin300或者Proclin950，防腐剂的质量浓度优选为0.01％-1％。
按照本发明，所述的示踪结合物反应液R2中的阻断剂可以使用IgG、罗氏、或者Scantibody商品化的阻断剂，阻断剂使用浓度范围优选为10-500μg/mL，更优选为50-200μg/mL。
按照本发明，所述的示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中的蛋白稳定剂优选为BSA、酪蛋白及BGG中的一种或几种，所述的蛋白稳定剂的质量浓度为0.1％-10％。
按照本发明，所述的示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中的表面活性剂优选为吐温、聚乙二醇或者曲拉通，所述的表面活性剂的质量浓度优选为0.01％-1％。
本发明还提供一种***特异性抗原同源异构体(p2PSA)化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：磁颗粒反应液R1的制备
将缓冲液和防腐剂混合，配制成R1基础缓冲液；
取商品化的链酶亲和素磁珠(选自JSR公司，型号为MS300/Streptavidin)，磁珠粒径3μm，用pH7.2的PBS(20mmol/L PB与150mmol/L NaCl)缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至R1基础缓冲液中，配成质量浓度0.03％-0.1％的磁颗粒反应液R1；
步骤二：示踪结合物反应液R2的制备
将NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R2基础缓冲液；
取p2PSA抗体(或tPSA抗体)，与溶解于溶剂中的吖啶酯溶液按照摩尔浓度1:(1-20)的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB，标记时间1-12小时，反应过程需要避光，标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，得到吖啶酯标记的p2PSA抗体(或tPSA抗体)；所述的溶剂优选为DMF，吖啶酯溶液的浓度优选为3mg/mL，标记缓冲液的浓度优选为20mmol/L；
取吖啶酯标记的p2PSA抗体(或tPSA抗体)置于R2基础缓冲液中，配成浓度为0.1-3μg/mL的示踪结合物反应液R2；
步骤三：捕获抗体反应液R3的制备
将NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R3基础缓冲液；
取tPSA抗体(或p2PSA抗体)，与溶解于溶剂中的生物素溶液按照摩尔浓度1:(1-50)的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB，标记时间2-24h，反应过程需要避光，标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，得到生物素标记的tPSA抗体(或p2PSA抗体)；所述的溶剂优选为DMF，生物素溶液的浓度优选为3mg/mL，标记缓冲液的浓度优选为20mmol/L；
取生物素标记的tPSA抗体(或p2PSA抗体)置于R3基础缓冲液中，配成浓度0.5-8μg/mL的捕获抗体反应液R3。
步骤四：校准品
将高浓度抗原定量添加至含有5％BSA的PBS缓冲液中，配成理论浓度为0pg/mL，10pg/mL，20pg/mL，50pg/mL，100pg/mL，500pg/mL的校准品，然后使用一级校准品赋值，赋值后的浓度即为校准品使用浓度。
按照本发明，所述的试剂盒的测定方法，包括以下步骤：
将待测样本、R2、R3反应液顺序加入反应杯中，孵育10分钟，在该过程中，抗体与抗原形成夹心复合物；然后在反应杯中继续加入R1反应液，孵育10分钟；加入清洗液，清洗；最后将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数，样本中p2PSA的含量与光量子数成正比。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
以下实施例所用吖啶酯的结构为：
Figure BDA0002498034420000091
所用生物素的结构为
Figure BDA0002498034420000092
实施例1
1.1试剂盒构成
Figure BDA0002498034420000093
Figure BDA0002498034420000101
1.2试剂盒的制备方法
(1)磁颗粒反应液R1的制备
取链酶亲和素磁珠，粒径3μm，用pH7.2的PBS缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至适量的R1基础缓冲液中(除磁珠之外的其它成分)，配成质量浓度0.1％的磁颗粒反应液R1。
(2)示踪结合物反应液R2的制备
a.制备吖啶酯标记的p2PSA抗体：
取适量p2PSA抗体，与溶解于DMF中的吖啶酯(3mg/mL)按照摩尔浓度1：7.5的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB(20mmol/L)，标记时间4h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为268.5μg/mL。
b.制备示踪结合物反应液R2：
取适量吖啶酯标记的p2PSA抗体原液于R2基础缓冲液中，配成p2PSA抗体浓度为0.2μg/mL的示踪结合物反应液R2。
(3)捕获抗体反应液R3的制备
a.制备生物素标记的tPSA抗体：
取适量tPSA抗体，与溶解于DMF中的生物素(3mg/mL)按照摩尔浓度1:20的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB(20mmol/L)，标记时间4h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为267.1μg/mL。
b.制备捕获抗体反应液R3：
取适量生物素标记的tPSA抗体原液于R1基础缓冲液中(除抗体外的其它成分)，配成浓度为0.7μg/mL的捕获抗体反应液R3。
1.3试剂盒的测试方法
第一步，将30μL样本、50μL R2、50μL R3反应液顺序加入反应杯中，孵育5分钟，在该过程中，抗体与抗原形成夹心复合物；第二步，在反应杯中继续加入40μL R1反应液，孵育5分钟；第三步，加入清洗液，清洗二次；第四步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。
实施例2
1.1试剂盒构成
Figure BDA0002498034420000111
Figure BDA0002498034420000121
1.2试剂盒的制备方法
(1)磁颗粒反应液R1的制备
取链酶亲和素磁珠，粒径3μm，用pH7.2的PBS缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至适量的R1基础缓冲液中(除磁珠之外的其它成分)，配成质量浓度0.1％的磁颗粒反应液R1。
(2)示踪结合物反应液R2的制备
a.制备吖啶酯标记的tPSA抗体：
取适量tPSA抗体，与溶解于DMF中的吖啶酯(3mg/mL)按照摩尔浓度1：3的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB(20mmol/L)，标记时间12h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为198.4μg/mL。
b.制备示踪结合物反应液R2：
取适量吖啶酯标记的tPSA抗体原液于R2基础缓冲液中，配成tPSA抗体浓度为1μg/mL的示踪结合物反应液R2。
(3)捕获抗体反应液R3的制备
a.制备生物素标记的p2PSA抗体：
取适量p2PSA抗体，与溶解于DMF中的生物素(3mg/mL)按照摩尔浓度1:40的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB(20mmol/L)，标记时间8h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为218.9μg/mL。
b.制备捕获抗体反应液R3：
取适量生物素标记的p2PSA抗体原液于R1基础缓冲液中(除抗体外的其它成分)，配成浓度为2μg/mL的捕获抗体反应液R3。
1.3试剂盒的测试方法
第一步，将30μL样本、60μLR3反应液、50μLR1反应液顺序加入反应杯中，孵育18分钟，在该过程中，形成抗原-抗体-链霉素-磁珠复合物；第二部，在反应杯中加入清洗液，清洗一次；第三步在反应杯中继续加入60μLR2反应液，形成抗原抗体复合物，孵育5分钟；第四步，加入清洗液，清洗一次；第五步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。
实施例3
1.1试剂盒构成
Figure BDA0002498034420000131
Figure BDA0002498034420000141
1.2试剂盒的制备方法
(1)磁颗粒反应液R1的制备
取链酶亲和素磁珠，粒径1μm，用pH7.2的PBS缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至适量的R1基础缓冲液中(除磁珠之外的其它成分)，配成质量浓度0.03％的磁颗粒反应液R1。
(2)示踪结合物反应液R2的制备
a.制备吖啶酯标记的p2PSA抗体：
取适量p2PSA抗体，与溶解于DMF中的吖啶酯(3mg/mL)按照摩尔浓度1：20的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB(20mmol/L)，标记时间1h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为247.2μg/mL。
b.制备示踪结合物反应液R2：
取适量吖啶酯标记的p2PSA抗体原液于R2基础缓冲液中，配成p2PSA抗体浓度为1μg/mL的示踪结合物反应液R2。
(3)捕获抗体反应液R3的制备
a.制备生物素标记的tPSA抗体：
取适量tPSA抗体，与溶解于DMF中的生物素(3mg/mL)按照摩尔浓度1:50的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB(20mmol/L)，标记时间2h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为3mL/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为227.6μg/mL。
b.制备捕获抗体反应液R3：
取适量生物素标记的tPSA抗体原液于R1基础缓冲液中(除抗体外的其它成分)，配成浓度为2μg/mL的捕获抗体反应液R3。
1.3试剂盒的测试方法
第一步，将30μL样本及270μL清洗液混合均匀，取50μL稀释后样本、60μLR2、60μLR3反应液按顺序加入反应杯中，孵育10分钟，在该过程中，抗体与抗原形成夹心复合物；第二步，在反应杯中继续加入50μL R1反应液，孵育10分钟；第三步，加入清洗液，清洗一次；第四步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。
根据实施例1-3，可以将其中所用试剂替换为前述限定范围内的任意物质，并对试剂浓度限定为前述限定范围内的任意值，即可制备得到不同的***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒，这里不再一一举例。
以下为实施例1的***特异性抗原同源异构体(p2PSA)化学发光免疫检测试剂盒的评价数据，实施例2～3在样本不变的情况下，检测效果接近，不再赘述。
图1和表1为实施例1试剂盒的定标曲线和校准数据，用5P拟合方法将校准品的浓度对光量子数作图，即得到试剂盒的定标曲线。将临床样本的光量子数带入定标曲线，即可得到临床样本的浓度值。
表2为本发明实施例1的空白限的测试数据；
表3为本发明实施例1的线性的测试数据；
表4为本发明实施例1的重复性的测试数据；
表5为本发明实施例1的批间差的测试数据；
表1 p2PSA校准测试数据
理论浓度(pg/mL) 光量子数
0.00 129
10.00 2677
20.00 4972
50.00 11905
100.00 23526
500.00 116801
5000.00 1090286
(1)空白限
平行测定零值一级校准品A或样本稀释液20次，记录其信号值，计算均数M和标准差SD，并计算M+2SD的值，测定相邻浓度一级校准品B3次，记录其信号值，取平均值。根据零值一级校准品(A)和相邻浓度一级校准品(B)之间的浓度—信号值结果进行两点线性回归拟合出一次方程，M+2SD所对应的信号值带入方程，所得浓度即为空白限，结果应小于0.50pg/mL。
表2 p2PSA空白限测试数据
Figure BDA0002498034420000161
Figure BDA0002498034420000171
(2)线性
将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度样本须接近线性范围的下限。对每一浓度的样本均重复检测3次，计算平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，计算线性相关系数r，结果应符合要求(线性范围为0.5pg/mL～5000pg/mL，线性相关系数r≥0.9900)。
表3 p2PSA线性测试数据
Figure BDA0002498034420000172
(3)重复性
用低、高两种不同浓度的样本各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值(M)和标准差(SD)，按公式(2)计算变异系数(CV)，变异系数(CV)应≤8.0％。
CV＝SD/M×100％…………………………………(2)
式中：CV—变异系数；
SD—测量结果的标准差；
M—测量结果的平均值。
表4 p2PSA重复性测试数据
Figure BDA0002498034420000181
(4)批间差
用3个批号试剂盒分别检测同一份低、高两种不同浓度样本，则3个批号试剂盒之间的批间变异系数(CV)≤15.0％。
表5 p2PSA批间差测试数据
Figure BDA0002498034420000182
Figure BDA0002498034420000191
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：校准品、磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2和捕获抗体反应液R3；
所述的磁颗粒反应液R1包含链酶亲和素磁珠、缓冲液和防腐剂；
所述的示踪结合物反应液R2包含吖啶酯标记的p2PSA抗体或吖啶酯标记的tPSA抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；
所述的捕获抗体反应液R3包含生物素标记的tPSA抗体或生物素标记的p2PSA抗体、NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的磁颗粒反应液R1中链酶亲和素磁珠的质量浓度为0.03％-0.1％；所述的示踪结合物反应液R2中吖啶酯标记的p2PSA抗体或吖啶酯标记的tPSA抗体的浓度为0.1-3μg/mL；所述的捕获抗体反应液R3中生物素标记的tPSA抗体或生物素标记的p2PSA抗体的浓度为0.5-8μg/mL。
3.根据权利要求1所述的***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中防腐剂为NaN3、Proclin 300或Proclin 950，所述的防腐剂的质量浓度为0.01％-1％。
4.根据权利要求1所述的***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中的NaCl的浓度为0.15mol/L。
5.根据权利要求1所述的***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中的蛋白稳定剂为BSA、酪蛋白、及BGG中的一种或几种，所述的蛋白稳定剂的质量浓度为0.1％-10％。
6.根据权利要求1所述的***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中的表面活性剂为吐温、聚乙二醇或者曲拉通，所述的表面活性剂的质量浓度为0.01％-1％。
7.根据权利要求1所述的***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的磁颗粒反应液R1、示踪结合物反应液R2、及捕获抗体反应液R3中缓冲液为2-(N-***啉)乙磺酸(MES)、哌嗪-NN-双(2-乙磺酸)(PIPES)、3-(N-码啡基)-2-羟基丙磺酸钠(MOPSO)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)或者Tris-盐酸，其pH6.0-8.0，浓度为10-600mmoL/L。
8.根据权利要求1所述的***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的示踪结合物反应液R2中的阻断剂为IgG、罗氏、或者Scantibody，所述阻断剂的浓度范围为10-500μg/mL。
9.一种***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：磁颗粒反应液R1的制备
将缓冲液和防腐剂混合，配制成R1基础缓冲液；
取链酶亲和素磁珠，用PBS缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至R1基础缓冲液中，配成磁颗粒反应液R1；
步骤二：示踪结合物反应液R2的制备
将NaCl、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R2基础缓冲液；
取p2PSA抗体或tPSA抗体，与溶解于溶剂中的吖啶酯溶液进行标记，标记时间1-12小时，反应过程需要避光，标记反应结束后，纯化，收集纯化后的原液进行抗体定量，得到吖啶酯标记的p2PSA抗体或吖啶酯标记的tPSA抗体；
取吖啶酯标记的p2PSA抗体或吖啶酯标记的tPSA抗体置于R2基础缓冲液中，配成示踪结合物反应液R2；
步骤三：捕获抗体反应液R3的制备
将NaCl、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成R3基础缓冲液；
取tPSA抗体或p2PSA抗体，与溶解于溶剂中的生物素溶液进行标记，标记时间2-24h，反应过程需要避光，标记反应结束后，纯化，收集纯化后的原液进行抗体定量，得到生物素标记的tPSA抗体或生物素标记的p2PSA抗体；
取生物素标记的tPSA抗体或生物素标记的p2PSA抗体置于R3基础缓冲液中，配制成捕获抗体反应液R3；
步骤四：配制校准品。
10.根据权利要求9所述的***特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤二中p2PSA抗体或tPSA抗体和吖啶酯溶液按照摩尔浓度1：1-20的比例进行标记；步骤三中tPSA抗体或p2PSA抗体和生物素溶液按照摩尔浓度1：1-50的比例进行标记。
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