CN112010973B - 一种抗4-1bb抗体、含有其的组合物及其应用 - Google Patents

一种抗4-1bb抗体、含有其的组合物及其应用 Download PDF

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    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Abstract

本发明提供一种特异性结合人4‑1BB的抗体或抗原结合片段、含有其的组合物及其在制备抗肿瘤药物中的用途，该抗体或抗原结合片段包含含有特定互补决定区序列的VL结构域和VH结构域。该抗体或抗原结合片段在药代动力学检测中显示出至少30h的T1/2和至少9000.00μg/mL*h的AUC0‑t，并且含有该抗体或抗原结合片段的抗肿瘤药物具有更好的肿瘤生长抑制活性以及更低的肝脏毒性。

Description

一种抗4-1BB抗体、含有其的组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗4-1BB抗体、含有其的组合物及其应用。
背景技术
4-1BB因子属于肿瘤坏死因子受体超家族，是一种具有255个氨基酸的跨膜蛋白。4-1BB表达于NK和NKT细胞、调节性T细胞、树突状细胞(DC)、刺激的肥大细胞、分化中的髓样细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞中。4-1BB的配体是4-1BBL，是属于TNF超家族的糖蛋白，表达于激活的抗原呈递细胞(APC)、髓样祖细胞及造血干细胞。4-1BB与配体结合，为4-1BB表达细胞提供共刺激信号，共刺激信号可促进T细胞的增殖和活化，并抑制活化诱导的细胞凋亡，进而增强T细胞的免疫杀伤功能。同时，诱导单核细胞等活化，促进细胞因子的分泌，使单核细胞、树突状细胞等在免疫调节中发挥作用。
在目前嵌合抗原工程化T细胞的开发过程中，4-1BB作为胞内信号共刺激分子具有重要作用，被应用于不同靶点细胞治疗研究以及临床。目前，已有多个4-1BB相关药物研究项目正在进行中。已报道的4-1BB抗体序列在蛋白结合灵敏度、蛋白亲和度等方面并不理想，而且大多没有很好的肿瘤生长抑制活性或者毒副作用明显。因此，亟需开发活性更好、毒副作用更低的新型4-1BB抗体药物。
发明内容
本发明所述抗体或抗原结合片段是指脱离人体或动物体的抗体或抗原结合片段，即分离的抗体或抗原结合片段。所述抗体包括单克隆制备的抗体、以及嵌合或人源化形式的抗体。
本发明所述英文缩写词含义如下，VL表示轻链可变区，VH表示重链可变区，L-CDR表示轻链互补决定区，H-CDR表示重链互补决定区。
本发明全文中关于VL结构域、VH结构域、L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的各个实施方式可以各自单独实施，也可以任意组合实施。
本发明所述“至少70％同源”是指氨基酸序列中至少70％氨基酸的组成和顺序是相同的。同理，“至少75％同源”、“至少80％同源”、“至少85％同源”、“至少90％同源”、“至少93％同源”、“至少95％同源”、“至少98％同源”及“至少99％同源”是指氨基酸序列中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％、至少99％氨基酸的组成和顺序是相同的，“100％同源”是指氨基酸序列完全相同。
根据本发明的一方面，提供一种特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段包含：
含有选自SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63所示氨基酸序列的互补决定区的VH结构域。
在一些实施方式中，本发明提供的特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段还包含含有选自SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的互补决定区的VL结构域。
在一些实施方式中，本发明提供的特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段的VL结构域含有互补决定区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中：
L-CDR1选自SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示氨基酸序列；
L-CDR2选自SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示氨基酸序列；
L-CDR3选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40所示氨基酸序列。
在另一些实施方式中，本发明提供的特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段的VH结构域含有互补决定区H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，其中：
H-CDR1选自SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48所示氨基酸序列；
H-CDR2选自SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55所示氨基酸序列；
H-CDR3选自SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段的VL结构域含有如下(1)-(8)中任意一种互补决定区的组合：
(1)SEQ ID NO:29所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:35所示L-CDR3氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO:30所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:34所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:36所示L-CDR3氨基酸序列；
(3)SEQ ID NO:29所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:37所示L-CDR3氨基酸序列；
(4)SEQ ID NO:31所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:38所示L-CDR3氨基酸序列；
(5)SEQ ID NO:29所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:39所示L-CDR3氨基酸序列；
(6)SEQ ID NO:29所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:38所示L-CDR3氨基酸序列；
(7)SEQ ID NO:30所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:34所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:40所示L-CDR3氨基酸序列；或
(8)SEQ ID NO:32所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:39所示L-CDR3氨基酸序列。
在另一些实施方式中，所述特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段的VH结构域含有如下(1)-(8)中任意一种互补决定区的组合：
(1)SEQ ID NO:41所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:49所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:56所示H-CDR3氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO:42所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:50所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:57所示H-CDR3氨基酸序列；
(3)SEQ ID NO:43所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:51所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:58所示H-CDR3氨基酸序列；
(4)SEQ ID NO:44所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:52所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:59所示H-CDR3氨基酸序列；
(5)SEQ ID NO:45所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:52所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:60所示H-CDR3氨基酸序列；
(6)SEQ ID NO:46所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:53所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:61所示H-CDR3氨基酸序列；
(7)SEQ ID NO:47所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:54所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:62所示H-CDR3氨基酸序列；或
(8)SEQ ID NO:48所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:55所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:63所示H-CDR3氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段包含如下(1)-(10)中VL结构域和VH结构域的任意一种组合：
(1)含有SEQ ID NO:29所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:35所示L-CDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:41所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:49所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:56所示H-CDR3氨基酸序列的VH结构域；
(2)含有SEQ ID NO:30所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:34所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:36所示L-CDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:42所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:50所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:57所示H-CDR3氨基酸序列的VH结构域；
(3)含有SEQ ID NO:29所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:37所示L-CDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:43所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:51所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:58所示H-CDR3氨基酸序列的VH结构域；
(4)含有SEQ ID NO:31所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:38所示L-CDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:44所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:52所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:59所示H-CDR3氨基酸序列的VH结构域；
(5)含有SEQ ID NO:29所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:35所示L-CDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:45所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:52所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:60所示H-CDR3氨基酸序列的VH结构域；
(6)含有SEQ ID NO:29所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:39所示L-CDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:46所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:53所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:61所示H-CDR3氨基酸序列的VH结构域；
(7)含有SEQ ID NO:29所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:38所示L-CDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:44所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:52所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:59所示H-CDR3氨基酸序列的VH结构域；
(8)含有SEQ ID NO:30所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:34所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:40所示L-CDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:47所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:54所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:62所示H-CDR3氨基酸序列的VH结构域；
(9)含有SEQ ID NO:32所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:39所示L-CDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:48所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:55所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:63所示H-CDR3氨基酸序列的VH结构域；或
(10)含有SEQ ID NO:29所示L-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:33所示L-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:35所示L-CDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:44所示H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:52所示H-CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:59所示H-CDR3氨基酸序列的VH结构域。
在一些更具体的实施方式中，VL结构域具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、或SEQ ID NO:27中任一者至少70％同源的氨基酸序列。在其他实施方式中，本发明提供的特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段的轻链氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、或SEQ ID NO:27中任一者至少70％同源。
在一些更具体的实施方式中，VH结构域具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、或SEQ ID NO:28中任一者至少70％同源的氨基酸序列。在其他实施方式中，本发明提供的特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段的重链氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、或SEQ ID NO:28中任一者至少70％同源。
在一些更具体的实施方式中，所述特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段包含如下(1)-(14)中VL结构域和VH结构域的任意一种组合：
(1)与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域；
(2)与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域；
(3)与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域；
(4)与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域；
(5)与SEQ ID NO:9所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域；
(6)与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ IDNO:12所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域；
(7)与SEQ ID NO:13所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ IDNO:14所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域；
(8)与SEQ ID NO:15所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ IDNO:16所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域；
(9)与SEQ ID NO:17所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ IDNO:18所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域；
(10)与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ IDNO:20所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域；
(11)与SEQ ID NO:21所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ IDNO:22所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域；
(12)与SEQ ID NO:23所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ IDNO:24所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域；
(13)与SEQ ID NO:25所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ IDNO:26所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域；或
(14)与SEQ ID NO:27所示氨基酸序列至少90％同源的VL结构域，以及与SEQ IDNO:28所示氨基酸序列至少70％同源的VH结构域。
在一些实施方式中，上述VL结构域和VH结构域的组合可以表示轻链序列和重链序列的组合，即所述特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段包含如下(1)-(14)中轻链序列和重链序列的任意一种组合：
(1)与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列；
(2)与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列；
(3)与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列；
(4)与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列；
(5)与SEQ ID NO:9所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列；
(6)与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ IDNO:12所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列；
(7)与SEQ ID NO:13所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ IDNO:14所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列；
(8)与SEQ ID NO:15所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ IDNO:16所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列；
(9)与SEQ ID NO:17所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ IDNO:18所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列；
(10)与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ IDNO:20所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列；
(11)与SEQ ID NO:21所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ IDNO:22所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列；
(12)与SEQ ID NO:23所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ IDNO:24所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列；
(13)与SEQ ID NO:25所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ IDNO:26所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列；或
(14)与SEQ ID NO:27所示氨基酸序列至少70％同源的轻链序列，以及与SEQ IDNO:28所示氨基酸序列至少70％同源的重链序列。
本发明上文所述“至少70％同源”包括至少75％同源、至少80％同源、至少85％同源、至少90％同源、至少93％同源、至少95％同源、至少98％同源、至少99％同源、以及100％同源。本发明所述至少70％同源、至少75％同源、至少80％同源、至少85％同源、至少90％同源、至少93％同源、至少95％同源、至少98％同源、至少99％同源、以及100％同源的序列是生物特异性及生物活性基本相同的序列。
在一些实施方式中，所述特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段包含如下(1)-(14)中VL结构域和VH结构域的任意一种组合：
(1)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的VH结构域；
(2)SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的VH结构域；
(3)SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的VH结构域；
(4)SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的VH结构域；
(5)SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的VH结构域；
(6)SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的VH结构域；
(7)SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的VH结构域；
(8)SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的VH结构域；
(9)SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的VH结构域；
(10)SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的VH结构域；
(11)SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的VH结构域；
(12)SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的VH结构域；
(13)SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的VH结构域；或
(14)SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的VH结构域。
本发明提供的特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段的体内代谢速率更慢，具有更高的末端消除半衰期(T1/2)，且具有更大的药时曲线下面积(AUC)。在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段在药代动力学检测中显示出至少30h的T1/2和至少9000.00μg/mL*h的AUC0-t。在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段在药代动力学检测中显示出至少35h、至少38h、至少39h、至少40h、至少45h、至少50h、至少55h、至少60h、至少65h或至少70h的T1/2。在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段在药代动力学检测中显示出35-70h，优选为50-70h，更优选为55-70h，最优选为60-70h的T1/2。在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段在药代动力学检测中显示出至少9500.00μg/mL*h、至少10000.00μg/mL*h、至少10500.00μg/mL*h、至少11000.00μg/mL*h、至少12000.00μg/mL*h、至少13000.00μg/mL*h、至少14000.00μg/mL*h、至少15000.00μg/mL*h或至少16000.00μg/mL*h的AUC0-t。在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段在药代动力学检测中显示出(9500.00-16000.00)μg/mL*h，优选为(10000.00-16000.00)μg/mL*h，更优选为(11000.00-16000.00)μg/mL*h，最优选为(15000.00-16000.00)μg/mL*h的AUC0-t。
根据本发明的另一方面，还提供一种组合物，其包含上文所述的抗体或抗原结合片段、以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括以下中的一种或多种：药学上可接受的溶剂、分散剂、附加剂、塑形剂、药物辅料。
根据本发明的另一方面，还提供上文所述的特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段在抑制肿瘤细胞生长中的用途以及在制备抗肿瘤药物中的用途，其中，所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于7.000E-7的平衡解离常数KD。在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于6.000E-7的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于5.000E-7的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于4.000E-7的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于3.000E-7的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于2.000E-7的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于1.000E-7的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于9.000E-8的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于8.000E-8的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于7.000E-8的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于6.000E-8的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于5.000E-8的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于4.000E-8的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于3.000E-8的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于2.000E-8的平衡解离常数KD。所述抗体或抗原结合片段在体外与人4-1BB蛋白的结合中表现出不高于1.000E-8的平衡解离常数KD。
根据本发明的另一方面，还提供上文所述的特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段在抑制肿瘤细胞生长中的用途以及在制备抗肿瘤药物中的用途，其中，所述抗肿瘤药物包含所述抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的载体，并且对接种结肠癌细胞的B-h4-1BB人源化小鼠施用3mg/kg所述抗肿瘤药物20天后肿瘤体积为空白对照组的1/2或更低。在一些实施方式中，对接种结肠癌细胞的B-h4-1BB人源化小鼠施用3mg/kg所述抗肿瘤药物20天后肿瘤体积为空白对照组的1/3或更低。在一些实施方式中，对接种结肠癌细胞的B-h4-1BB人源化小鼠施用3mg/kg所述抗肿瘤药物20天后肿瘤体积为空白对照组的1/4或更低。在一些实施方式中，对接种结肠癌细胞的B-h4-1BB人源化小鼠施用3mg/kg所述抗肿瘤药物20天后肿瘤体积为空白对照组的1/5或更低。在一些实施方式中，对接种结肠癌细胞的B-h4-1BB人源化小鼠施用3mg/kg所述抗肿瘤药物20天后肿瘤体积为空白对照组的1/10或更低。在一些实施方式中，对接种结肠癌细胞的B-h4-1BB人源化小鼠施用3mg/kg所述抗肿瘤药物24天后肿瘤体积为空白对照组的1/5或更低。在一些实施方式中，对接种结肠癌细胞的B-h4-1BB人源化小鼠施用3mg/kg所述抗肿瘤药物24天后肿瘤体积为空白对照组的1/10或更低。在一些实施方式中，对接种结肠癌细胞的B-h4-1BB人源化小鼠施用3mg/kg所述抗肿瘤药物24天后肿瘤体积为空白对照组的1/20或更低。在一些实施方式中，对接种结肠癌细胞的B-h4-1BB人源化小鼠施用0.75mg/kg、1.5mg/kg所述抗肿瘤药物21天后肿瘤体积比施用3mg/kgUtomilumab对照组更低。
在上述实施方式中，施用方式为注射，优选腹腔注射，施用频率为每三天一次。
在一些实施方式中，所述抗肿瘤药物的施用不引起ALT和AST指标的明显波动，因而具有更低的肝毒性。在一些实施方式中，本发明提供的如上文所述的特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段的体内施用不引起ALT和AST指标的明显波动。本文所述“不引起ALT和AST指标的明显波动”是指使受试者ALT和AST的浓度水平相对于给药前，维持在上、下波动不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％的水平。在一些实施方式中，本发明所述抗体或抗原结合片段体内施用1-30天内引起受试者ALT和AST的浓度水平波动不超过±30％、优选不超过±20％、更优选不超过±10％。在一些实施方式中，本发明所述抗体或抗原结合片段体内施用1-30天内引起受试者ALT和AST的浓度水平波动不超过±30％、优选不超过±20％、更优选不超过±10％。在一些实施方式中，本发明所述抗体或抗原结合片段体内施用1-15天内引起受试者ALT和AST的浓度水平波动不超过±30％、优选不超过±20％、更优选不超过±10％。在一些实施方式中，本发明所述抗体或抗原结合片段体内施用1-10天内引起受试者ALT和AST的浓度水平波动不超过±30％、优选不超过±20％、更优选不超过±10％。在一些实施方式中，本发明所述抗体或抗原结合片段体内施用1-8天内引起受试者ALT和AST的浓度水平波动不超过±30％、优选不超过±20％、更优选不超过±10％。在一些实施方式中，本发明所述抗体或抗原结合片段体内施用1-5天内引起受试者ALT和AST的浓度水平波动不超过±30％、优选不超过±20％、更优选不超过±10％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出实施例1中免疫方案的转基因小鼠血清滴度，其中，1A示出四免后转基因小鼠血清滴度，1B示出六免后转基因小鼠血清滴度；
图2A-图2C示出实施例3中ELSIA检测anti-4-1BB抗体对4-1BB蛋白的结合灵敏度；
图3A-图3D示出实施例3中流式细胞术检测anti-4-1BB抗体对GS-H2/4-1BB功能细胞的结合灵敏度；
图4A-图4C示出实施例3中GS-H2/4-1BB功能细胞系检测anti-4-1BB抗体的活性；
图5A-图5C示出实施例3中T细胞激活实验检测anti-4-1BB抗体的活性；
图6A-图6H示出实施例3中Biacore检测anti-4-1BB抗体对4-1BB蛋白的亲和力，其中图6A表示4BQ8-CA505-IgG2，图6B表示4BQ16-CA630-IgG2，图6C表示4BQ8-BA702-IgG2，图6D表示4BQ10-BA1093-IgG2，图6E表示4BQ33-CA1401-IgG2，图6F表示4BQ37-CA1488-IgG2，图6G表示Utomilumab，图6H表示Urelumab；
图7示出实施例4中anti-4-1BB抗体在B-h4-1BB人源化小鼠MC38结肠癌动物模型中药效实验(给药后肿瘤体积变化)；
图8示出实施例4中anti-4-1BB抗体在B-h4-1BB人源化小鼠MC38结肠癌动物模型中药效学实验(20天后肿瘤体积)；
图9示出实施例4中anti-4-1BB抗体在B-h4-1BB人源化小鼠MC38结肠癌动物模型中药效实验(给药后肿瘤体积变化)；
图10示出实施例4中anti-4-1BB抗体在B-h4-1BB人源化小鼠MC38结肠癌动物模型中药效学实验(24天后肿瘤体积)；
图11示出实施例4中anti-4-1BB抗体在B-h4-1BB人源化小鼠MC38结肠癌动物模型中药效学实验(给药后肿瘤体积变化)；
图12示出实施例5中anti-4-1BB抗体在食蟹猴中药代动力学实验(一)；
图13示出实施例5中anti-4-1BB抗体在食蟹猴中药代动力学实验(二)；
图14A-图14B示出实施例6中anti-4-1BB抗体引起食蟹猴ALT和AST的水平变化曲线。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明全文所描述的不同实施方式中所涉及的技术特征均可以相互组合实施。
实施例1抗4-1BB单克隆抗体的产生
1.1免疫方案
用蛋白4-1BB(义翘神州，10041-H08H)与弗氏佐剂乳化后免疫博安生物全人抗体转基因小鼠BoAn-hMab。首免使用弗氏完全佐剂，后续免疫使用弗氏不完全佐剂，两批分别免疫10只小鼠和5只小鼠。分别选取8只和4只血清滴度较高的小鼠加强免疫，3至4天后处死小鼠并取出脾脏用于后续实验。小鼠血清滴度见图1。
1.2噬菌体库的建立
取免疫小鼠的脾脏细胞，加入Trizol(Thermo Scientific，目录货号15596-026)，待裂解充分后加入1/5体积的氯仿，充分混匀，室温放置20min后4℃12000rpm离心20min，取上层水溶液，并加入等体积的异丙醇，室温放置20min，4℃12000rpm离心20min，弃去上清水溶液，加入75％乙醇洗涤两次，4℃12000rpm离心5min，弃去水溶液，保留沉淀，室温风干后加入DEPC水重悬沉淀获得RNA，获得的RNA使用罗氏反转录试剂盒Transcriptor FirstStrand cDNASynthesis Kit(Roche Applied Science，目录货号4897030001)按照其说明书将RNA反转录成cDNA。噬菌体库的建立步骤参照Carlos F.Barbas III，Phage display：Alaboratory manual中记载的方法进行，首先用PCR的方法从cDNA中获得重链和轻链的可变区，再将重链和轻链的可变区通过重叠延伸PCR的方法获得ScFv，用SfiI(NEB,目录货号R0123L)对ScFv进行酶切50℃5h，酶切后的ScFv(单链Fv)与质粒pCOMB3x连接，然后将连接产物电转染至大肠杆菌TG1感受态细胞中，37℃200rpm培养1h后，加入75mL 2YT培养基(添加了氨苄抗生素和葡萄糖)，37℃200rpm培养1.5h，取2mL进行OD600的测定，按照1:20的比例加入提前制备的phage，37℃静置30min，4000rpm离心取细菌沉淀，用100mL 2YT(添加氨苄抗生素和卡那抗生素)的培养基重悬后30℃200rpm培养过夜，次日，12000rpm离心10min取上清，加入4％PEG8000和3％NaCl，冰浴1h，4℃12000rpm离心30min，取沉淀加入2YT培养基重悬，加入7％DMSO后冻存备用。以编号为4-1BB Q33的小鼠建立的噬菌体库4-1BB Q33，库容1.4×108；以编号为4-1BB Q37的小鼠建立的噬菌体库4-1BB Q37，库容1.76×108。
1.3噬菌体库筛选
1.平板筛选用4-1BB-His蛋白(义翘神州，10041-H08H)以1μg/孔包被平板，4℃放置过夜，第二天通过3％脱脂奶粉封闭平板1h，加入噬菌体库(2×1012)孵育2h，洗涤4-10次后用Elution Buffer(pH 2.2)洗脱4-1BB特异性结合的噬菌体。
2.磁珠筛选，将4-1BB-Fc蛋白(义翘神州，10041-H02H)按照常规步骤进行生物素化(投入的4-1BB蛋白与生物素摩尔比1:2)，再与Thermo的磁珠(Invitrogen Dynabeads M-280 Streptavidin，00355871)结合后与噬菌体库孵育，洗涤4-10次后用Elution Buffer(pH 2.2)洗脱4-1BB特异性结合的噬菌体。筛选获得克隆及来源见表1。
表1.筛选得到anti-4-1BB抗体来源表
克隆 来源库 来源小鼠 淘洗方法
4BQ8-CA505-IgG2 PLQ8 4-1BBQ08 平板筛选
4BQ16-CA630-IgG2 PLQ16 4-1BBQ16 平板筛选
4BQ8-BA702-IgG2 PLQ8 4-1BBQ08 磁珠筛选
4BQ9-BA912-IgG2 PLQ19 4-1BBQ19 磁珠筛选
4BQ13-BA959-IgG2 PLQ19 4-1BBQ19 磁珠筛选
4BQ10-BA1093-IgG2 PLQ22 4-1BBQ22 磁珠筛选
4BQ11-BA1109-IgG2 PLQ29 4-1BBQ29 磁珠筛选
4BQ11-BA1142-IgG2 PLQ30 4-1BBQ30 磁珠筛选
4BQ11-BA1145-IgG2 PLQ30 4-1BBQ30 磁珠筛选
4BQ33-CA1401-IgG2 PLQ33 4-1BBQ33 平板筛选
4BQ33-CA1412-IgG2 PLQ33 4-1BBQ33 平板筛选
4BQ34-CA1455-IgG2 PLQ34 4-1BBQ34 平板筛选
4BQ37-CA1488-IgG2 PLQ37 4-1BBQ37 平板筛选
4BQ37-CA1491-IgG2 PLQ37 4-1BBQ37 平板筛选
实施例2候选抗体的分子构建与生产
将克隆4BQ8-CA505/BA702、4BQ16-CA630、4BQ9-BA912、4BQ13-BA959、4BQ10-BA1093、4BQ11-BA1109/BA1142/BA1145、4BQ33-CA1401/CA1412、4BQ34-CA1455、4BQ37-CA1488/CA1491送Invitrogen生物技术有限公司测序，CA1401克隆经序列分析重链属于胚系基因IGHV3-30家族，轻链属于胚系基因IGKV1-5家族。各克隆氨基酸序列如下表2。
表2.筛选克隆氨基酸序列
Figure BDA0002249859860000151
Figure BDA0002249859860000161
Figure BDA0002249859860000171
Figure BDA0002249859860000181
将抗体VH基因与IgG2重链恒定区序列SEQ ID NO:64融合、VL基因与Kappa轻链恒定区SEQ ID NO:65融合后，通过常规的分子生物学技术：可变区扩增(
Figure BDA0002249859860000182
DNAPolymerase厂家：TAKARA货号：R010A批号：#N5901BA)、信号肽与可变区重叠延伸、同源重组(ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit厂家：Vazyme货号：C112-01批号：7E151F7)连接入载体pCDNA3.4(Life Technology)，转染进入HEK293细胞在37℃\8％CO2\125rpm摇床中培养，6-7天后的瞬时表达上清通过ProteinA亲和层析，纯化获得4-1BB抗体，并通过UV280结合消光系数确定抗体浓度。
SEQ ID NO:64(IgG2重链恒定区序列)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK-
SEQ ID NO:65(Kappa轻链恒定区序列)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
对照抗体生产：通过IMGT数据及专利CN201180054004确定辉瑞4-1BB抗体Utomilumab的氨基酸序列，全基因合成后***载体pCDNA3.4通过HEK293细胞表达，生产的抗体命名为Utomilumab。用同样的表达方法表达Urelumab抗体作为另一个阳性对照。
Utomilumab重链
EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK-(SEQID NO:66)
Utomilumab轻链
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS-(SEQID NO:67)
Urelumab重链
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK-(SEQ ID NO:68)
Urelumab轻链
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:69)
实施例3候选抗体的表征
3.1 Elisa检测候选抗体与4-1BB蛋白的结合
包被不同浓度(0.2μg/mL、0.05μg/mL、0.0125μg/mL、0.003125μg/mL和0.0009766μg/mL)的抗原4-1BB(10041-H08H，义翘神州)，100μL/孔4℃过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入1μg/mL候选抗体各100μL，37℃孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果见图2A-2C。
3.2流式检测候选抗体与4-1BB细胞的结合
96孔圆底板中，加入50μL4-1BB功能细胞(金斯瑞，M00609)，细胞数为5E4/孔，用FACS buffer(无菌PBS，0.2％BSA)梯度稀释各候选抗体，按50μL/孔加入96孔圆底板中，4℃孵育1h。2000rpm离心3min后弃上清，用FACS buffer洗2次，加入100μL/孔荧光二抗(Southern Biotech，2040-09)，终浓度1μg/mL，4℃孵育1h，2000rpm离心3min后弃上清，用FACS buffer洗2次后用100μL/孔FACS buffer重悬，用流式细胞仪(艾森，NovoCyte 2060)进行检测。结果见表3-6和图3A-3D。
如表3-6和图3A-3D所示，在0.66μg/mL、0.22μg/mL、0.07μg/mL和0.02μg/mL时，候选抗体CA1401、CA1412、CA1455和CA1491与4-1BB功能细胞结合能力显著高于对照组Utomilumab或Urelumab。4-1BB功能细胞表面的4-1BB更加接近天然构象，暗示这些候选抗体在体内结合天然抗原的能力会很强。
表3.图3A对应的浓度-平均荧光强度数据
Figure BDA0002249859860000201
Figure BDA0002249859860000211
表4.图3B对应的浓度-平均荧光强度数据
Figure BDA0002249859860000214
表5.图3C对应的浓度-平均荧光强度数据
Figure BDA0002249859860000212
表6.图3D对应的浓度-平均荧光强度数据
Figure BDA0002249859860000213
3.3抗体的体外功能检测
3.3.1 GS-H2/4-1BB功能细胞系检测抗体细胞学活性
向MEM培养基(Gibco，41090-036)中加入终浓度2％的FBS(Gibco，10091-148)即为工作培养基，用工作培养基重悬GS-H2/4-1BB细胞至1E5个/mL，50μL/孔接种细胞于384孔细胞培养板，置于37℃，5％CO2培养箱18-20h。向抗体样品中加入或不加入交联二抗(义翘神州，SA015)，交联二抗与抗体样品的摩尔比为1:2，工作培养基梯度稀释各抗体样品，将抗体每个孔50μL加入到384孔细胞培养板中。37℃，5％CO2培养箱培养24-26h。用IL8试剂盒(cisbio，62IL8PEB)检测上清IL8浓度，结果见图4A-4C。
对于4-1BB抗体而言，肝毒性是治疗过程中的一大挑战。从I期临床结果来看，Utomilumab的肝毒性低于Urelumab。本实验中Utomilumab在无交联二抗的情况下对4-1BB功能细胞的活性低于有交联二抗的情况，而Urelumab在有无交联二抗的情况下均显示了较强的4-1BB功能细胞活性，这种差别行为很有可能与两种对照药物肝毒性的差别相关。因此对于候选抗体来说，无交联二抗时对4-1BB功能细胞活性较低，有可能产生的肝毒性也较低。
如图4A-4C所示，候选抗体CA505、CA630、BA702.1、BA1093、CA1401、CA1412、CA1455、CA1488和CA1491在无交联二抗时的4-1BB功能细胞活性低于有交联二抗时的细胞活性，与低肝毒性的Utomilumab的行为类似，预示着这些候选抗体也极有可能具有较低的肝毒性。
3.3.2 T细胞激活实验检测抗体细胞活性
向1640培养基(Gibco，11875-119)中加入终浓度10％的FBS(Gibco，10091-148)，即为完全培养基，用DPBS(Gibco，14190-144)稀释OKT3(百普赛斯，CDE-M120a)至20μg/mL，每个孔50μL加入到96孔细胞培养板中；DPBS梯度稀释抗体样品，将配制好抗体每个孔50μL加入到96孔细胞培养板中，将细胞培养板置于4℃冰箱孵育过夜。复苏CD3+T细胞，1000rpm离心5min，完全培养基重悬并调整细胞密度至1E5个/mL。将细胞培养板中的抗体样品及OKT3吸出，每孔加入200μL细胞悬液，37℃，5％CO2培养箱培养3-5天，收集细胞上清，用IL-2检测试剂盒(Biolegend，431805)检测IL-2的浓度，用IFN-γ检测试剂盒(Biolegend，430105)检测IFN-γ的浓度。实验结果见图5A-5C。
如图5A-5C所示，候选抗体CA1401、BA1093和BA702在相同浓度条件下刺激T细胞分泌细胞因子IFN-γ的能力优于对照抗体，说明候选抗体的细胞学活性优于对照抗体。
3.4 SPR检测抗体与4-1BB蛋白的亲和力
抗体结合动力学使用基于表面等离振子共振(surface plasmon resonance，SRP)技术的BIAcoreX100仪器测量。通过GE anti Human IgG FC氨基偶联试剂盒(GE，cat#BR-1008-39)，将anti-human IgG抗体氨基偶联到CM5生物传感器芯片上以获得大约1000应答单位(response units，RU)。对于动力学测量，将4-1BB蛋白(义翘神州，10041-H08H)用HBS-EP+1×(GE，BR-1006-69)缓冲液2倍连续稀释，50nM起始，2倍稀释4个浓度梯度，并设置0浓度。抗体：1μg/ml，进样时间60s，流速5μL/min，稳定5s；4-1BB蛋白：结合60s，流速30μL/min，解离300s；再生：用3M MgCl2 buffer再生30s，Startup 2次。使用简单一对一Languir结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)计算结合常数(ka)和解离常数(kd)，平衡解离常数(KD)以比率kd/ka计算。各抗体亲和力数据见表7，亲和力测量曲线见图6A-6H。
表7.BiAcore检测候选抗体结合动力学
抗体ID Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
4BQ8-CA505-IgG2 4.19E+05 0.01841 4.39E-08
4BQ16-CA630-IgG2 1.76E+05 2.57E-04 1.46E-09
4BQ8-BA702-IgG2 9.00E+05 0.02342 2.60E-08
4BQ10-BA1093-IgG2 2.42E+04 4.23E-04 1.75E-08
4BQ33-CA1401-IgG2 4.11E+05 0.02306 5.61E-08
4BQ37-CA1488-IgG2 3.79E+04 3.80E-04 1.01E-08
Utomilumab 2.57E+06 0.01778 6.92E-09
Urelumab 5.16E+05 0.002513 4.87E-09
实施例4 anti-4-1BB抗体在B-h4-1BB人源化小鼠MC38结肠癌皮下移植瘤模型中的药效学研究
通过北京百奥赛图的B-h4-1BB人源化小鼠接种小鼠结肠癌MC38细胞建立小鼠结肠癌动物模型进行anti-4-1BB抗体的功能研究。将PBS重悬的MC38细胞以5×105个/0.1mL浓度，0.1mL/只体积接种于B-h4-1BB人源化小鼠的右侧皮下。当平均肿瘤体积达到约114mm3时，根据小鼠肿瘤体积和体重选择合适的小鼠入组。平均分配到各实验组中，每组6只，分组当天开始给药。给药途径为i.p.，给药频率为Q3D(每三天一次)，给药次数为6次。分组后每周测量肿瘤体积及体重2次，记录小鼠体重和肿瘤体积。抗体对小鼠肿瘤体积增长的抑制结果见表8-10和图7-11。4BQ33-CA1401-IgG2在相同剂量条件下，对肿瘤生长的抑制作用最明显，优于Utomilumab(图9-10)。并且相比于Utomilumab 3mg/kg的剂量，4BQ33-CA1401-IgG2在0.75mg/kg和1.5mg/kg时，也能得到优于Utomilumab的肿瘤抑制效果(图11)。
表8.图7-8中给药20天后各组与Tanezumab之间肿瘤体积平均值的比较分析(Dunnett检验)
Figure BDA0002249859860000231
Figure BDA0002249859860000241
表9.图9-10中给药24天后各组与溶媒之间肿瘤体积平均值的比较分析(Dunnett检验)
P P
4BQ33-CA1401-IgG2 Vehicle <0.05 7.1823E-08
4BQ37-CA1488-IgG2 Vehicle <0.05 2.9076E-07
Utomilumab Vehicle <0.05 4.3271E-07
表10.图11中给药21天后各组与溶媒之间肿瘤体积平均值的比较分析(Dunnett检验)
P P
Utomilumab 3mg/kg Vehicle <0.05 0.000152
4BQ33-CA1401 0.75mg/kg Vehicle <0.05 3.149E-05
4BQ33-CA1401 1.5mg/kg Vehicle <0.05 9.731E-06
4BQ33-CA1401 3mg/kg Vehicle <0.05 2.221E-05
实施例5 anti-4-1BB抗体在食蟹猴中的药代动力学研究
雄性食蟹猴于给药前(0点)及给药后5min，30min，6h，第1、3、7、10、14、17、21、24和28天头静脉或隐静脉(避免给药静脉)采集1.5mL全血到血清促凝管中，室温放置30min后，开始离心。离心条件为室温，3500rpm离心10min。然后分装约0.5mL血清到准备好的EP管中。血清分装完毕，立即放入-80℃冰箱冻存，直至做PK分析。
检测血药浓度方法为：4-1BB蛋白包被，5℃冰箱过夜放置。洗板后用含1％BSA的PBS于37.5℃封闭1h，洗板后加入100μL/孔标曲品、质控品以及待测样品，37.5℃孵育1h。洗板后加入100μL/孔HRP标记抗人IgG二抗，37.5℃孵育1h。洗板后加入100μL/孔TMB显色液，37.5℃避光放置25min，终止反应后酶标仪上读取OD450与OD650。药代动力学曲线见图12、13。药代动力学参数见表11、12。
从代谢曲线来看，4BQ33-CA1401-IgG2和4BQ37-CA1488-IgG2在食蟹猴体内代谢速率都明显慢于Utomilumab，4BQ33-CA1401-IgG2的代谢速率最慢(图12、13)。4BQ33-CA1401-IgG2和4BQ37-CA1488-IgG2的AUC0-t分别为11180.70和10791.81μg/mL*h，远高于Utomilumab的4025.20μg/mL*h(表11、12)，表示可以有更低的使用剂量以及更好的肿瘤抑制效果。
表11.anti-4-1BB抗体在食蟹猴中药代动力学实验参数汇总(一)
Figure BDA0002249859860000251
表12.anti-4-1BB抗体在食蟹猴中药代动力学实验参数汇总(二)
Figure BDA0002249859860000252
实施例6 anti-4-1BB抗体在食蟹猴中的肝毒性研究
雄性食蟹猴于给药后约24、48、96小时及试验第8、13、15、17、22、29天自猴上肢静脉或其它适宜部位采血约3mL，不抗凝。血液样品15～25℃以离心力1800g离心10min，分离血清以IFCC P-5’-P法检测天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)。检测结果见图14A-14B。
如图所示，给药后第1-8天，Utomilumab的ALT和AST指标均有明显的上升和回落，说明该药物对肝脏细胞有一定的影响，而4BQ33-CA1401-IgG2相同剂量条件下，ALT和AST指标均没有明显波动(第13天ALT略有波动)，说明4BQ33-CA1401-IgG2的肝毒性应弱于Utomilumab。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 山东博安生物技术有限公司
<120> 一种抗4-1BB抗体、含有其的组合物及其应用
<150> 201910459133.8
<151> 2019-05-30
<150> 201910459134.2
<151> 2019-05-30
<160> 69
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Val Asn His Ile Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Asn Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Ile Ile Thr Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Ala Lys Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 6
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Val Asn His Ile Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ser Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Ile Ile Thr Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Gly Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Asp Ser Asn Tyr Val Pro Gln Tyr Phe Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Asn Arg Ser Ile Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile His Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Arg Ala Ile Gly Ser Gly Thr Tyr Pro Tyr Ser Phe Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 12
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile His Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Ala Ile Gly Ser Gly Ile Tyr Pro Tyr Ser Phe Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 14
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly His
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Val Ile His Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Leu Gly Glu Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Tyr Gly Asp
100 105 110
Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 15
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 16
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile His Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Arg Ala Ile Gly Ser Gly Thr Tyr Pro Tyr Ser Phe Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Ile Pro Ile His Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Thr Glu Arg Ala Ile Gly Ser Gly Thr Tyr Pro Tyr Ser Phe Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ala Ser Lys Gly Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Gln Tyr His Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ala Ser Lys Gly Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 24
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Val Asn His Ile Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ser Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Ile Ile Thr Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 26
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Ser Tyr Asp Glu Asn Tyr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Glu Leu Gln Leu Pro Arg Pro Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 28
<211> 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile His Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Arg Ala Ile Gly Ser Gly Thr Tyr Pro Tyr Ser Phe Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Gln Ser Ile Ser Ser Trp
1 5
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Arg Ser Ile Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Asn Asn Tyr
1 5 10
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Gln Ser Ile Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 33
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Trp Ala Ser
1
<210> 34
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Lys Ala Ser
1
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Gln Gln Tyr Tyr Gly Thr Pro Thr
1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Thr
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Leu Thr
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Val
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Gly Ile Thr Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Gly Val Thr Leu Ser Asn Tyr Ala
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Gly Gly Thr Phe Ser His Tyr Thr
1 5
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Gly Gly Ser Phe Ser Gly His Tyr
1 5
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Val
1 5
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser
1 5
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Val Asn His Ile Gly Gly Thr
1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Ile Ser Phe Asp Gly Ser Ser Lys
1 5
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Lys
1 5
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Ile Ile Pro Ile His Gly Ile Ala
1 5
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Val Ile His Ser Gly Thr Thr
1 5
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Val Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Gln
1 5
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Ile Ser Tyr Asp Glu Asn Tyr Glu
1 5
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Ala Arg Gly Gly Ile Ile Thr Tyr Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Ala Arg Asp Val Ala Lys Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Ala Arg Asp Gly Asp Ser Asn Tyr Val Pro Gln Tyr Phe Asn Tyr
1 5 10 15
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Ala Thr Glu Arg Ala Ile Gly Ser Gly Thr Tyr Pro Tyr Ser Phe Asn
1 5 10 15
Tyr
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Ala Arg Glu Arg Ala Ile Gly Ser Gly Ile Tyr Pro Tyr Ser Phe Asn
1 5 10 15
Tyr
<210> 61
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Ala Arg Gly Leu Leu Gly Glu Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Asp Ala Phe Asp Ile
20
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Ala Arg Asp Ala Ser Lys Gly Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 63
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Ala Arg Gly Gly Glu Leu Gln Leu Pro Arg Pro Phe Asp Val
1 5 10
<210> 64
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 66
<211> 442
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 67
<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 68
<211> 448
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 69
<211> 216
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (5)

1.一种特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段，其包含VL结构域和VH结构域，所述VL结构域含有互补决定区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，所述VH结构域含有互补决定区H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，其中，
所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:30所示的L-CDR1，如SEQ ID NO:34所示的L-CDR2，如SEQ ID NO:40所示的L-CDR3，如SEQ ID NO:47所示的H-CDR1，如SEQ ID NO:54所示的H-CDR2，如SEQ ID NO:62所示的H-CDR3；
所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:32所示的L-CDR1，如SEQ ID NO:33所示的L-CDR2，如SEQ ID NO:39所示的L-CDR3，如SEQ ID NO:48所示的H-CDR1，如SEQ ID NO:55所示的H-CDR2，如SEQ ID NO:63所示的H-CDR3；
所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:30所示的L-CDR1，如SEQ ID NO:34所示的L-CDR2，如SEQ ID NO:36所示的L-CDR3，如SEQ ID NO:42所示的H-CDR1，如SEQ ID NO:50所示的H-CDR2，如SEQ ID NO:57所示的H-CDR3；
所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:29所示的L-CDR1，如SEQ ID NO:33所示的L-CDR2，如SEQ ID NO:37所示的L-CDR3，如SEQ ID NO:43所示的H-CDR1，如SEQ ID NO:51所示的H-CDR2，如SEQ ID NO:58所示的H-CDR3；
所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:31所示的L-CDR1，如SEQ ID NO:33所示的L-CDR2，如SEQ ID NO:38所示的L-CDR3，如SEQ ID NO:44所示的H-CDR1，如SEQ ID NO:52所示的H-CDR2，如SEQ ID NO:59所示的H-CDR3；
所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:29所示的L-CDR1，如SEQ ID NO:33所示的L-CDR2，如SEQ ID NO:35所示的L-CDR3，如SEQ ID NO:45所示的H-CDR1，如SEQ ID NO:52所示的H-CDR2，如SEQ ID NO:60所示的H-CDR3；
所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:29所示的L-CDR1，如SEQ ID NO:33所示的L-CDR2，如SEQ ID NO:39所示的L-CDR3，如SEQ ID NO:46所示的H-CDR1，如SEQ ID NO:53所示的H-CDR2，如SEQ ID NO:61所示的H-CDR3；
所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:29所示的L-CDR1，如SEQ ID NO:33所示的L-CDR2，如SEQ ID NO:38所示的L-CDR3，如SEQ ID NO:44所示的H-CDR1，如SEQ ID NO:52所示的H-CDR2，如SEQ ID NO:59所示的H-CDR3；或者，
所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:29所示的L-CDR1，如SEQ ID NO:33所示的L-CDR2，如SEQ ID NO:35所示的L-CDR3，如SEQ ID NO:44所示的H-CDR1，如SEQ ID NO:52所示的H-CDR2，如SEQ ID NO:59所示的H-CDR3。
2.一种组合物，其包含权利要求1所述的抗体或抗原结合片段、以及药学上可接受的载体。
3.权利要求1所述的特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途，其中，所述抗体或抗原结合片段在药代动力学检测中显示出至少30h的T1/2和至少9000.00μg/mL*h的AUC0-t。
4.权利要求1所述的特异性结合人4-1BB的抗体或抗原结合片段在制备抗肿瘤药物中的用途，其中，所述抗肿瘤药物包含所述抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的载体，并且对接种结肠癌细胞的B-h4-1BB人源化小鼠施用3mg/kg所述抗肿瘤药物20天后肿瘤体积为空白对照组的1/2或更低。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述抗肿瘤药物的施用不引起ALT和AST指标的明显波动。
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