CN114075284A

CN114075284A - Cd47结合分子及其用途

Info

Publication number: CN114075284A
Application number: CN202010825379.5A
Authority: CN
Inventors: 谭永聪; 郎国竣; 刘新垣; 章康健; 方先龙; 顾锦法; 孔超; 刘婵娟; 张文海; 孙兴鲁; 范宝国; 曹雪萍
Original assignee: Shanghai Yuansong Biotechnology Co ltd; Sanyou Biopharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Shanghai Yuansong Biotechnology Co ltd; Sanyou Biopharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2020-08-17
Filing date: 2020-08-17
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2040-08-17
Also published as: CN114075284B

Abstract

本申请提供了一种分离的CD47结合分子、编码所述CD47结合分子的核酸以及包含所述核酸的表达载体或宿主细胞、以及包含所述CD47结合分子的药物或试剂盒。所述CD47结合分子包含SEQ ID NO：10‑12所示的重链可变区CDR1‑3和/或SEQ ID NO：13‑15所示的轻链可变区CDR1‑3，或者所述CD47结合分子包含SEQ ID NO：10‑12所示的重链可变区CDR1‑3和/或SEQ ID NO：13、14和16所示的轻链可变区CDR1‑3。

Description

CD47结合分子及其用途

技术领域

本申请属于生物技术领域，一般而言涉及分离的CD47结合分子及其用途。更具体地，本申请涉及一种分离的特异性结合CD47的抗体或其抗原结合片段、编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸以及包含所述核酸的表达载体或宿主细胞、及其相关用途。

背景技术

近年来，免疫检查点相关治疗在很多肿瘤上都体现出来惊人的效果，比如PD-1、PD-L1和CTLA-4等，目前免疫治疗已经成为炙手可热的一个领域，有望在将来使“癌症成为一种慢性病”变为现实。但随着对免疫治疗的深入研究，人们发现，除了T细胞上的免疫检查点，巨噬细胞对癌症细胞的吞噬和杀伤也受到免疫检查点的调节，如CD47-SIRPα。

作为天然免疫***的一部分，巨噬细胞负责吞噬外来细菌、病毒等病原体和快速扩增的癌细胞，其中对细胞的吞噬受到两个信号的调节，一个是“eat me”的信号，比如，癌症细胞上会表达一些异于正常细胞的钙网蛋白，帮助巨噬细胞识别癌症细胞；另一个是“don’t eat me”的信号，比如CD47，当与巨噬细胞上的SIRPα结合之后，其会激活SIRPα下游信号通路，抑制巨噬细胞对靶细胞的吞噬。对于肿瘤细胞，抗体阻断CD47与对应受体SIRPα的结合，即可促进吞噬细胞对癌症细胞的杀伤，然而对于正常细胞，由于没有“eat me”的信号，阻断CD47的抗体不会导致吞噬,因此，CD47被认为是一个充满前景的靶点，针对其开发的抗体药物具有更高的安全性，被称之为第二代免疫检查点分子。

CD47蛋白是免疫球蛋白Ig超家族的成员，最早是在20世纪80年代首次在人类卵巢癌中发现。之后发现，CD47广泛表达于各种正常组织的表面，而且在一些癌症中呈现出平均三倍于正常细胞的高表达，如急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、结直肠癌、膀胱癌、卵巢癌和其他实体瘤，临床研究表明，癌症病人中CD47的表达水平和预后以及总生存期呈现反比关系，这说明CD47不仅可以作为肿瘤患者预后的生物标志物，同时，CD47可能在此类癌症中发挥重要的促癌作用，针对其开发的抗体可能发挥非常好的疗效。

目前针对CD47靶点开发抗体的药物中，只有少数在临床阶段，进展最快的是开发FortySeven公司的抗体Hu-5F9，又名magrolimab。一期临床试验显示，通过联合利妥昔单抗在复发/难治性非霍奇淋巴瘤的治疗上展示出极好的疗效，目前处于二期临床试验中。

因此亟需研发新的CD47结合分子，例如CD47单克隆抗体，用于癌症的免疫治疗，使其具有更低的毒副作用和更佳的临床药效。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的CD47结合分子，具体而言，提供一种新的特异性识别CD47的抗体，例如，单克隆抗体，与本领域中现有的CD47抗体相比，所述新的CD47单克隆抗体具有更低的毒副作用和更佳的临床药效，能够更有效地治疗癌症。

总的来说，本发明提供一种分离的CD47结合分子，其能够特异性结合CD47，例如，与CD47特异性结合的抗体，在下文中称为抗CD47抗体或CD47抗体。本申请还提供了构建和筛选所述CD47结合分子的方法，编码所述CD47结合分子的核酸分子、用于表达CD47结合分子的载体和宿主细胞以及包含所述CD47结合分子的组合物或试剂盒。本申请进一步提供了体外和体内验证CD47结合分子功能的方法。本申请的CD47结合分子能够通过调节免疫***治疗多种癌症，因此能够用于制备治疗癌症的药剂。

具体而言，本发明提供一种分离的与CD47特异性结合的抗体，在下文中称为抗CD47抗体或CD47抗体。本申请还提供了构建和筛选所述抗CD47抗体的方法，编码所述抗CD47抗体的核酸分子、用于表达抗CD47抗体的载体和宿主细胞以及包含所述抗CD47抗体的组合物或试剂盒。本申请进一步提供了体外和体内验证抗CD47抗体功能的方法。本申请的抗CD47抗体能够通过调节免疫***治疗多种癌症，因此能够用于制备治疗癌症的药剂。所述抗CD47抗体可以是单克隆抗体。

更具体而言，本发明通过小鼠免疫库筛选到相应的鼠源抗CD47抗体，后续又经过人源化和亲和力成熟改造最终得到了候选分子,在体内外效果都优于对照抗体Hu5F9，而且血凝实验上显示更优，这表明其具有更低的毒性。

在一些方面，本发明提供一种分离的CD47结合分子，其能够特异性结合CD47，例如，人CD47，优选地特异性结合CD47的胞外结构域，所述CD47结合分子包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区包含重链CDR1、CDR2和CDR3(下文中分别称为HCDR1、HCDR2和HCDR3)，其中

HCDR1包含SEQ ID NO：10或由SEQ ID NO：10组成，

HCDR2包含SEQ ID NO：11或由SEQ ID NO：11组成，和

HCDR3包含SEQ ID NO：12或由SEQ ID NO：12组成；和/或

(2)轻链可变区，所述轻链可变区包含轻链CDR1、CDR2和CDR3(下文中分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中

LCDR1包含SEQ ID NO:13或由SEQ ID NO:13组成，

LCDR2包含SEQ ID NO:14或由SEQ ID NO:14组成，和

LCDR3包含QQGX₁X₂X₃PFT或由QQGX₁X₂X₃PFT组成,其中X₁为N或K,X₂为T或N，X₃为L或Y。

在一个优选的实施方案中，所述CD47结合分子包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区包含：

SEQ ID NO：10所示的HCDR1，

SEQ ID NO：11所示的HCDR2，和

SEQ ID NO：12所示的HCDR3；和

(2)轻链可变区，所述轻链可变区包含：

SEQ ID NO:13所示的LCDR1，

SEQ ID NO:14所示的LCDR2，和

QQGX₁X₂X₃PFT所示的LCDR3，其中X₁为N或K,X₂为T或N，X₃为L或Y。

在一个优选的实施方案中，所述CD47结合分子包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区包含：

包含SEQ ID NO：10或由SEQ ID NO：10组成的HCDR1，

包含SEQ ID NO：11或由SEQ ID NO：11组成的HCDR2，和

包含SEQ ID NO：12或由SEQ ID NO：12组成的HCDR3；和

(2)轻链可变区，所述轻链可变区包含：

包含SEQ ID NO:13或由SEQ ID NO:13组成的LCDR1，

包含SEQ ID NO:14或由SEQ ID NO:14组成的LCDR2，和

包含SEQ ID NO:15或16或由SEQ ID NO:15或16组成的LCDR3。

在一个优选的实施方案中，所述CD47结合分子包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区包含：

SEQ ID NO：10所示的HCDR1，

SEQ ID NO：11所示的HCDR2，和

SEQ ID NO：12所示的HCDR3；和

(2)轻链可变区，所述轻链可变区包含：

SEQ ID NO:13所示的LCDR1，

SEQ ID NO:14所示的LCDR2，和

SEQ ID NO:15或16所示的LCDR3。

在一些实施方案中，所述CD47结合分子包含：

(1)重链可变区(VH)，所述重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％、90％或95％或99％同一性并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比具有一个或多个(例如1－10个，1－5个，1－3个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列；和/或

(2)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％或99％同一性并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列相比具有一个或多个(例如1－10个，1－5个，1－3个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列。

在一些优选的实施方案中，所述CD47结合分子包含含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述CD47结合分子包含在SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4中含有一处或多处氨基酸取代(例如，保守性取代)、缺失或***的VH和VL，并且仍然保留充分的特异性结合CD47的能力。

在一些优选的实施方案中，所述一处或多处氨基酸取代(例如，保守性取代)、缺失或***不超过五处，优选地不超过三处。

在一些实施方案中，所述CD47结合分子包含分别与SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4具有至少85％、至少90％或至少95％或99％同一性的VH和VL，并且仍然保留充分的特异性结合CD47的能力。

在一些优选的实施方案中，本发明提供CD47结合分子，其中重链可变区如SEQ IDNO：3所示，轻链可变区如SEQ ID NO：4所示。

在一些实施方案中，所述CD47结合分子包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少85％、90％或95％或99％同一性并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列相比具有一个或多个(例如1－10个，1－5个，1－3个，例如，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列；和/或

(2)轻链可变区，所述轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％或99％同一性并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列相比具有一个或多个(例如1－10个，1－5个，1－3个，例如，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列。

在一些优选的实施方案中，所述CD47结合分子包含含有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述CD47结合分子包含在SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6中含有一处或多处氨基酸取代(例如，保守性取代)、缺失或***的VH和VL，并且仍然保留充分的特异性结合CD47的能力。

在一些实施方案中，所述CD47结合分子包含分别与SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6具有至少85％、至少90％或至少95％或99％同一性的重链可变区和轻链可变区，并且仍然保留充分的特异性结合CD47的能力。

在一些优选的实施方案中，本发明提供CD47结合分子，其中重链可变区如SEQ IDNO：5所示，轻链可变区如SEQ ID NO：6所示。

在一些优选的实施方案中，所述CD47结合分子包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％或99％同一性并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列；或

(2)轻链可变区，所述轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％或99％同一性并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列相比具有一个或多个(例如1－10个，1－5个，1－3个，例如，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列。

在一些优选的实施方案中，本发明提供的CD47结合分子为抗体，优选单克隆抗体。具体而言，本发明提供特异性结合人CD47的抗体或其抗原结合片段。

在一些优选的实施方案中，本发明提供的CD47结合分子为单克隆抗体，例如，鼠源单克隆抗体、人源化抗体或亲和力成熟的单克隆抗体。

在一些优选的实施方案中，本发明提供的CD47结合分子为鼠源单克隆抗体，其中所述鼠源单克隆抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，轻链可变区包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

在一些优选的实施方案中，所述鼠源单克隆抗体的重链可变区如SEQ ID NO：3所示，轻链可变区如SEQ ID NO：4所示。

在一些优选的实施方案中，本发明提供的CD47结合分子为人源化抗体，其中所述人源化抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，轻链可变区包含如SEQID NO：6所示的氨基酸序列。

在一些优选的实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体为人源化抗体，其中所述人源化抗体的重链可变区如SEQ ID NO：5所示，轻链可变区如SEQ ID NO：6所示。

在一些优选的实施方案中，本发明还提供亲和力成熟的抗体，其中所述亲和力成熟的抗体的重链可变区包含SEQ ID NO：5，轻链可变区包含SEQ ID NO：9。

在一些优选的实施方案中，本发明的亲和力成熟的抗体的重链可变区如SEQ IDNO：5所示，轻链可变区SEQ ID NO：9所示。

在一些优选的实施方案中，本发明的CD47结合分子融合至IgG的恒定区，例如人IgG的恒定区，优选人IgG1或人IgG4的恒定区，更优选包含S228P/L235E的人IgG4的恒定区。其中重链恒定区序列如SEQ ID NO:7，轻链恒定区序列如SEQ ID NO:8。

在一些方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的CD47结合分子的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。

在一些实施方案中，所述编码如本文所公开的CD47结合分子的重链可变区的核酸序列选自SEQ ID NO:17或19；所述编码如本文所公开的抗CD47抗体的轻链可变区的核酸序列选自SEQ ID NO:18、20或21。

在一些方面，本发明涉及包含编码如本文所公开的CD47结合分子的核酸分子的载体。

在优选的实施方案中，所述载体包含选自SEQ ID NO:17或19的编码重链可变区的核酸序列，和/或选自SEQ ID NO:18、20或21的编码轻链可变区的核酸序列。

在优选的实施方案中，所述载体为表达载体。

在优选的实施方案中，编码重链可变区的核酸序列和编码轻链可变区的核酸序列可以构建在同一个载体中，或者构建在不同的载体中。

在一些方面，本发明涉及包含如本文所公开的表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以选自，但不限于，细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。例如，细菌细胞包括大肠杆菌细胞，真菌细胞包括酵母细胞，哺乳动物细胞包括CHO或HEK293等。

在一些方面，本发明涉及药物组合物，其包含如本文所公开的CD47结合分子和药学上可接受的载体。

在一些方面，本发明涉及用于制备CD47结合分子的方法，其包括在宿主细胞中表达所述CD47结合分子并从宿主细胞分离抗体或抗原结合片段。

在一些方面，本发明涉及调节受试者的免疫应答的方法，其包括向受试者施用如本文所公开的CD47结合分子，使得受试者中的免疫应答受到调节。

在一些实施方案中，所述受试者为患有与CD47相关的疾病的患者，或对使用抗CD47抗体治疗有响应的患者，或是鉴定为抗CD47抗体治疗的良好候选者的患者。具体地，所述受试者可能患有下述疾病，但不限于此：白血病、淋巴癌、结直肠癌或卵巢癌等。所述白血病可以选自急性骨髓性白血病(AML)，慢性骨髓性白血病，急性淋巴细胞白血病(ALL)，所述淋巴癌可以是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

在一些方面，本发明涉及用于治疗或预防与CD47相关的疾病的方法，其中包括向患有与CD47相关的疾病的患者或有患有与CD47相关的疾病的倾向的受试者施用有效量的如本文所公开的CD47结合分子或施用有效量的包含如本文所公开的CD47结合分子的药物组合物。

在一些方面，本发明涉及治疗可以通过消除、抑制或降低CD47活性而被改善、减缓、抑制或预防的任何疾病或病症的方法。

在另一些方面，本发明的方法还涉及通过联合疗法治疗或预防肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的CD47结合分子和一种或多种其它药物。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括向受试者联合施用有效量的第二药物，其中本文公开的CD47结合分子是第一药物。在一个实施方案中，第二药物是用于治疗相关疾病的化疗剂、放疗剂或者生物大分子药物。在一个实施方案中，该生物大分子药物例如是通过T细胞识别攻击肿瘤细胞的各种单克隆抗体药，例如利妥昔单抗、西妥昔单抗与曲妥珠单抗。如本文所用的表述“第二药物”并不意味着它是指第一药物之外的唯一药物。因此，第二药物不必是一种药物，而可以是构成或包含多于一种这类药物。

在一些实施方案中，受试者或个体是人。

在一些方面，本发明涉及如本文所公开的CD47结合分子在制备用于治疗或预防与CD47相关的疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述与CD47相关的疾病选自，但不限于，白血病、淋巴癌、结直肠癌或卵巢癌等。所述白血病可以选自急性骨髓性白血病(AML)，慢性骨髓性白血病，急性淋巴细胞白血病(ALL)，所述淋巴癌可以是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

在一些方面，本发明涉及使用如本文所公开的CD47结合分子的试剂盒或装置和相关方法，以及如本文所公开的药物组合物，其可用于治疗与CD47相关的疾病，例如，癌症，可以选自，但不限于，白血病、淋巴癌、结直肠癌或卵巢癌等。为此，本发明优选提供可用于治疗此类病症的制品，其包含含有如本文所公开的CD47结合分子的容器以及用于使用如本文所公开的CD47结合分子来治疗、改善或预防与CD47相关的疾病或其进展或复发的说明材料。

本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有CD47结合分子、方法和用途。

附图简述

图1显示人源化抗体F4H3L3、亲和力成熟抗体F4AM4和对照抗体Hu5F9在CCRF-CEM细胞水平的结合能力比较。

图2显示人源化抗体F4H3L3、亲和力成熟抗体F4AM4和对照抗体Hu5F9在细胞水平上阻断受体蛋白SIRPα结合的比较。

图3显示人源化抗体F4H3L3、亲和力成熟抗体F4AM4和对照抗体Hu5F9促进巨噬细胞吞噬癌症细胞的生物学活性比较。

图4显示亲和力成熟抗体F4AM4和对照抗体Hu5F9在动物水平抑制异种移植肿瘤生长的活性比较。

图5显示亲和力成熟抗体F4AM4和对照抗体Hu5F9对红细胞的血凝反应比较。

序列表概述

本申请附带有包含许多核酸和氨基酸序列的序列表。下表A提供了所包含的序列的概述。

表A.本发明涉及的序列

具体实施方式

本领域技术人员应该理解，本发明不限于本文中描述的特定方法学、实施方案和试剂，因为这些是示例性说明。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限定。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。

此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一种”和“这种”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种抗体”包括多种抗体。

I.定义

为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。完整抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼中天然存在的抗体可仅包含重链。

如本文所用的术语“抗原结合部分”指与靶抗原特异性结合的部分。该术语包括能够与靶抗原特异性结合的抗体以及其他天然分子(例如受体，配体)或合成分子(例如，DARPin)。在一个优选的实施方案中，本发明抗体的抗原结合部分是抗体片段。

术语“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有单一氨基酸组成的抗体分子的制备物，而不指其产生的方法。单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR嫁接、或此类或其它本领域已知的技术的组合来产生。

如本文所用，术语“结合”和“特异性结合”指抗体或抗原结合部分在体外测定法中，优选地在采用纯化的野生型抗原的生物光干涉测量(ForteBio)中与抗原表位结合。在某些实施方案中，在抗体或抗原结合部分优选地识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中其靶抗原时，将抗体或抗原结合部分称作特异性结合抗原。

取决于其重链恒定区的氨基酸序列，将抗体以“类”划分：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。对应于不同抗体类的重链恒定区分别称作δ、ε、γ和μ。可以在全部五个抗体类中找到的轻链恒定区(CL)称作κ和λ。在全长轻链和重链内，通常可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。参见例如FundamentalImmunology，Ch.7(Paul，W.编辑，第二版，Raven Press，N.Y.(1989))(其为所有目的以其整体在此引作参考)。每一轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区。(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6^th ed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。

可变区通常表现出由三个高变区连接的相对保守的构架区(FR)的相同的一般结构，所述高变区也被称为互补决定区或CDR。通常通过构架区定位(align)来自每对的两条链的CDR，所述CDR使得可结合特异性表位。两条轻链和重链可变区从N-末端到C-末端通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分结合完整抗体结合的抗原。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括现有技术已知以及本文中所描述的那些。

“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有框架”是指这样的框架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat等，Sequences of ProteinsofImmunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，1-3卷中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型III。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。

术语“保守取代”是指一个氨基酸被同一类别内的另一氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸被另一酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸被另一碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸被另一中性氨基酸取代。示例性的取代如下表B所示：

表B.示例性的取代和保守取代

氨基酸可以按照常见侧链的性质进行分组：

(1)疏水性:正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性亲水性:Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性:Asp，Glu；

(4)碱性:His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基:Gly，Pro；

(6)芳族的:Trp，Tyr，Phe。

非保守性置换需要将这些类别中之一的成员交换为另一类。

一种类型的置换变体包括置换母体抗体(例如人源化抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，关于进一步研究所选择的得到的一种或多种变体相对于母体抗体具有某些生物学特性的改进(例如，改善)(例如，增加的亲和力、减少的免疫原性)，和/或将具有母体抗体基本上保留的特定生物学特性。一种示例性的置换变体是亲和力成熟的抗体，其可以便利地产生，例如，使用基于噬菌体的亲和力成熟技术，诸如本文所述的那些技术。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并且将变体抗体展示在噬菌体上，并针对特定的生物学活性(例如，结合亲和力)进行筛选。

相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。当在本申请中提到序列同一性的百分比时，若未另外特别指出，这些百分比相对于较长序列的全长计算。相对于较长序列的全长计算适用于核酸序列和多肽序列两者。

术语“有效量”、“治疗有效量”指本发明的抗体或抗原结合片段这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的受试者中产生预期效果，这包括受试者病症的改善(例如，一个或多个症状的改善)和/或症状进展的延迟等。“有效量”、“治疗有效量”也可以指足够降低CD47信号的量(参见例如Yamauchi等，2013Blood，Jan 4.；Soto-Pantoja等，2013Expert Opin Ther Targets，17：89-103；Irandoust等，2013PLoS One，Epub Jan8；Chao等，2012Curr Opin Immunol，24：225-32；Theocharides等，2012J Exp Med，209(10)：1883-99)，例如为足够降低巨噬细胞中由CD47/SIRPα信号轴上的CD47/SIRPα相互作用生成的吞噬细胞抑制信号的抗体量，即本发明的抗体促进了巨噬细胞介导的对表达CD47的细胞的吞噬作用。

有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。

本文所用术语“阻断”表示存在本发明的抗体时减少CD47的信号传递。CD47介导的信号传递阻断指本发明的CD47抗体存在时CD47信号传递水平低于CD47的对照水平(即不存在抗体时的CD47信号传递水平)，降低的幅度大于或等于5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或100％。可使用多种标准技术测量CD47信号传递水平，如作为非限制性实施例，测量下游基因激活和/或响应CD47激活的荧光素酶报告试验。本领域技术人员应理解可使用多种试验测量CD47信号传递水平，包括例如可商购获得的试剂盒。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。

术语“凝集”表示细胞结块，而术语“血凝反应”表示特定的一类细胞(即血红细胞)结块。因此，血凝反应是凝集的一种类型。

II.CD47抗体

在一些方面，本发明提供一种抗CD47抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段特异性结合CD47，例如人CD47，优选地特异性结合CD47的胞外结构域。

在一些实施方案中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段包含：

HCDR1包含SEQ ID NO：10或由SEQ ID NO：10组成，

HCDR2包含SEQ ID NO：11或由SEQ ID NO：11组成，和

HCDR3包含SEQ ID NO：12或由SEQ ID NO：12组成；和/或

LCDR1包含SEQ ID NO:13或由SEQ ID NO:13组成，

LCDR2包含SEQ ID NO:14或由SEQ ID NO:14组成，和

在一个优选的实施方案中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区包含：

SEQ ID NO：10所示的HCDR1，

SEQ ID NO：11所示的HCDR2，和

SEQ ID NO：12所示的HCDR3；和

(2)轻链可变区，所述轻链可变区包含：

SEQ ID NO:13所示的LCDR1，

SEQ ID NO:14所示的LCDR2，和

(1)重链可变区，所述重链可变区包含：

包含SEQ ID NO：10或由SEQ ID NO：10组成的HCDR1，

包含SEQ ID NO：11或由SEQ ID NO：11组成的HCDR2，和

包含SEQ ID NO：12或由SEQ ID NO：12组成的HCDR3；和

(2)轻链可变区，所述轻链可变区包含：

包含SEQ ID NO:13或由SEQ ID NO:13组成的LCDR1，

包含SEQ ID NO:14或由SEQ ID NO:14组成的LCDR2，和

包含SEQ ID NO:15或16或由SEQ ID NO:15或16组成的LCDR3。

(1)重链可变区，所述重链可变区包含：

SEQ ID NO：10所示的HCDR1，

SEQ ID NO：11所示的HCDR2，和

SEQ ID NO：12所示的HCDR3；和

(2)轻链可变区，所述轻链可变区包含：

SEQ ID NO:13所示的LCDR1，

SEQ ID NO:14所示的LCDR2，和

SEQ ID NO:15或16所示的LCDR3。

在一些实施方案中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段包含：

(1)重链可变区(VH)，所述重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；

(2)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

在一些优选的实施方案中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4中含有一处或多处氨基酸取代(例如，保守性取代)、缺失或***的VH和VL，并且仍然保留充分的特异性结合CD47的能力。

在一些实施方案中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段包含分别与SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4具有至少85％、至少90％或至少95％或99％同一性的VH和VL，并且仍然保留充分的特异性结合CD47的能力。

在一些优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区如SEQ ID NO：3所示，轻链可变区如SEQ ID NO：4所示。

在一些实施方案中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(2)轻链可变区，所述轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；

在一些优选的实施方案中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6中含有一处或多处氨基酸取代(例如，保守性取代)、缺失或***的VH和VL，并且仍然保留充分的特异性结合CD47的能力。

在一些实施方案中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段包含分别与SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6具有至少85％、至少90％或至少95％或99％同一性的重链可变区和轻链可变区，并且仍然保留充分的特异性结合CD47的能力。

在一些优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区如SEQ ID NO：5所示，轻链可变区如SEQ ID NO：6所示。

在一些优选的实施方案中，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(2)轻链可变区，所述轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列；

(iii)包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列相比具有一个或多个(例如1－10个，1－5个，1－3个，例如，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体为单克隆抗体，例如，鼠源单克隆抗体、人源化抗体或亲和力成熟的单克隆抗体。

在一些优选的实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体为鼠源单克隆抗体，其中所述鼠源单克隆抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，可变区轻链包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

在一些优选的实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体为人源化抗体，其中所述人源化抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，轻链可变区包含如SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列。

在一些优选的实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段融合至IgG的恒定区，例如人IgG的恒定区，优选人IgG1或人IgG4的恒定区，更优选包含S228P/L235E的人IgG4的恒定区。其中重链恒定区序列如SEQ ID NO:7，轻链恒定区序列如SEQ ID NO:8。

在一些方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的抗CD47抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。

在一些实施方案中，所述编码如本文所公开的抗CD47抗体的重链可变区的核酸序列选自SEQ ID NO:17或19；所述编码如本文所公开的抗CD47抗体的轻链可变区的核酸序列选自SEQ ID NO:18、20或21。

在一些方面，本发明涉及包含编码如本文所公开的抗体或其抗原结合片段的核酸分子的载体。

在优选的实施方案中，所述载体为表达载体。

在一些方面，本发明涉及药物组合物，其包含如本文所公开的抗CD47抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。

在一些方面，本发明涉及用于制备抗CD47抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段并从宿主细胞分离抗体或抗原结合片段。

在一些方面，本发明涉及调节受试者的免疫应答的方法，其包括向受试者施用如本文所公开的抗CD47抗体或其抗原结合片段，使得受试者中的免疫应答受到调节。

在一些方面，本发明涉及用于治疗或预防与CD47相关的疾病的方法，其中包括向患有与CD47相关的疾病的患者或有患有与CD47相关的疾病的倾向的受试者施用有效量的如本文所公开的抗CD47抗体或其抗原结合片段或施用有效量的包含如本文所公开的抗CD47抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

在另一些方面，本发明的方法还涉及通过联合疗法治疗或预防肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段和一种或多种其它药物。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括向受试者联合施用有效量的第二药物，其中本文公开的抗CD47抗体或其抗原结合片段是第一药物。在一个实施方案中，第二药物是用于治疗相关疾病的化疗剂、放疗剂或者生物大分子药物。在一个实施方案中，该生物大分子药物例如是通过T细胞识别攻击肿瘤细胞的各种单克隆抗体药，例如利妥昔单抗、西妥昔单抗与曲妥珠单抗。如本文所用的表述“第二药物”并不意味着它是指第一药物之外的唯一药物。因此，第二药物不必是一种药物，而可以是构成或包含多于一种这类药物。

在一些实施方案中，受试者或个体是人。

在一些方面，本发明涉及如本文所公开的抗CD47抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防与CD47相关的疾病的药物中的用途。

在一些方面，本发明涉及使用如本文所公开的抗体或其抗原结合片段的试剂盒或装置和相关方法，以及如本文所公开的药物组合物，其可用于治疗与CD47相关的疾病，例如，癌症，可以选自，但不限于，白血病、淋巴癌、结直肠癌或卵巢癌等。为此，本发明优选提供可用于治疗此类病症的制品，其包含含有如本文所公开的抗体或其抗原结合片段的容器以及用于使用如本文所公开的抗体或其抗原结合片段来治疗、改善或预防与CD47相关的疾病或其进展或复发的说明材料。

本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有抗CD47抗体或其抗原结合片段、方法和用途。

III.抗CD47抗体或其抗原结合片段的实施方案

本发明提供下述实施方案：

1.一种分离的抗体或抗原结合片段，其特异性结合CD47，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区包含重链CDR1、CDR2和CDR3，其中

重链CDR1包含SEQ ID NO：10或由SEQ ID NO：10组成，

重链CDR2包含SEQ ID NO：11或由SEQ ID NO：11组成，和

重链CDR3包含SEQ ID NO：12或由SEQ ID NO：12组成；和/或

(2)轻链可变区，所述轻链可变区包含轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中

轻链CDR1包含SEQ ID NO:13或由SEQ ID NO:13组成，

轻链CDR2包含SEQ ID NO:14或由SEQ ID NO:14组成，和

轻链CDR3包含QQGX₁X₂X₃PFT或由QQGX₁X₂X₃PFT组成,其中X₁为N或K,X₂为T或N，X₃为L或Y。

2.根据实施方案1所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区包含：

包含SEQ ID NO：10或由SEQ ID NO：10组成的重链CDR1，

包含SEQ ID NO：11或由SEQ ID NO：11组成的重链CDR2，和

包含SEQ ID NO：12或由SEQ ID NO：12组成的重链CDR3；和

(2)轻链可变区，所述轻链可变区包含：

包含SEQ ID NO:13或由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR1，

包含SEQ ID NO:14或由SEQ ID NO:14组成的轻链CDR2，和

包含SEQ ID NO:15或16或由SEQ ID NO:15或16组成的轻链CDR3。

3.根据实施方案2所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区包含：

SEQ ID NO：10所示的重链CDR1，

SEQ ID NO：11所示的重链CDR2，和

SEQ ID NO：12所示的重链CDR3；和

(2)轻链可变区，所述轻链可变区包含：

SEQ ID NO:13所示的轻链CDR1，

SEQ ID NO:14所示的轻链CDR2，和

SEQ ID NO:15或16所示的轻链CDR3。

4.根据实施方案1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列；或

(2)轻链可变区，所述轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列；或

5.根据实施方案4所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区如SEQID NO：3所示，轻链可变区如SEQ ID NO：4所示。

6.根据实施方案1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列；或

(2)轻链可变区，所述轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性并且保留特异性结合CD47的能力的氨基酸序列；或

7.根据实施方案6所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：5所示的重链可变区和与SEQ ID NO：6所示的轻链可变区。

8.根据实施方案1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(2)轻链可变区，所述轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列；

9.根据实施方案8所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：5所示的重链可变区和SEQ ID NO：9所示的轻链可变区。

10.根据实施方案1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体为单克隆抗体，例如，鼠源单克隆抗体、人源化抗体或亲和力成熟的抗体。

11.根据实施方案1-10中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段融合至IgG的恒定区，例如人IgG的恒定区，优选人IgG1或人IgG4的恒定区，更优选包含S228P/L235E的人IgG4的恒定区，其中重链恒定区序列如SEQ ID NO:7，轻链恒定区序列如SEQ ID NO:8.。

12.一种分离的核酸分子，其包含编码如实施方案1-11的任一项中所定义的分离的抗体或其抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。

13.根据实施方案12所述的分离的核酸分子，其包含选自SEQ ID NO:17或19的编码重链可变区的核苷酸序列，和/或选自SEQ ID NO:18、20或21的编码轻链可变区的核苷酸序列。

14.一种分离的核酸分子，其包含编码如实施方案1-11的任一项中所定义的分离的抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸序列。

15.一种载体，其包含实施方案12-14中任一项的核酸分子。

16.一种宿主细胞，其包含实施方案15的载体。

17.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞，例如，大肠杆菌细胞、酵母细胞、CHO和HEK293细胞等。

18.一种药物组合物，其包含至少一种如实施方案1-11的任一项中所定义的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。

19.一种制备如实施方案1-11的任一项中所定义的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括以下步骤：

-在实施方案16的宿主细胞中表达如实施方案1-11的任一项中所定义的抗体或其抗原结合片段；和

-从所述宿主细胞分离所述抗体或其抗原结合片段。

20.根据实施方案1-11中任一项所定义的抗体或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗受试者中与CD47相关的疾病的药物中的用途。

21.根据实施方案20所述的用途，其中所述受试者为小鼠或人，优选为人。

22.根据实施方案20所述的用途，其中所述与CD47相关的疾病选自白血病、淋巴癌、结直肠癌或卵巢癌，优选为急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

23.一种用于预防或治疗受试者中与CD47相关的疾病的试剂盒，其包含：容器，所述容器包含实施方案1-11的任一项中所定义的至少一种抗体或其抗原结合片段；和使用说明材料。

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。

本领域技术人员应该理解，除非另外注明，以下实施例中所用的试剂、质粒、细胞等均为可商购获得的产品。

实施例1.抗原制备、鉴定和小鼠免疫

在CD47的胞外区段CD47-ECD的羧基端融合人IgG1 Fc(SEQ ID NO：1)或者6*his(SEQ ID NO：2)，通过ExpiCHO***(Thermo Fisher，Cat No.A29133)进行瞬转表达(瞬转方法参见：ExpiCHO^TMExpression System Kit User Guide:ExpiCHO Expression System)。表达上清离心后进行亲和纯化，得到的蛋白样品再通过SDS-PAGE进行纯度和浓度鉴定，同时通过在ELISA水平进行对照抗体(Hu5F9,又名magrolimab,可参见美国专利申请US20160304609)和抗原之间的结合来判定抗原的活性，当抗原纯度达到95％以上且抗原和抗体呈现良好的结合后才能用于后续动物免疫和抗体筛选。

对于抗原的瞬转表达和纯化，其具体操作如下：

质粒制备过程：根据融合人IgG1 Fc(SEQ ID NO：1)或者6*his(SEQ ID NO：2)的CD47-ECD基因序列合成全长基因(基因合成由通用生物合成)，合成时在上下游引入双酶切位点序列，获得基因片段，2％琼脂糖凝胶纯化回收目的片段，经双酶切后分别克隆到相同酶切处理的pcDNA3.0表达载体上，转化大肠杆菌后，筛选单克隆菌株，提取质粒用于测序验证，验证准确的质粒供下一步转染ExpiCHO-S细胞用。

转染当天，确认ExpiCHO-S细胞(购自Thermo Fisher，Cat No.A29127)密度为7×10⁶至1×10⁷个活细胞/mL，细胞活率>98％，此时用37℃预热的新鲜ExpiCHO表达培养基25mL将细胞调整到终浓度为6×10⁶个细胞/mL。用4℃预冷的OptiPRO^TM SFM 1mL稀释制备的质粒(共25μg),同时用920μL OptiPRO^TM SFM稀释80μL ExpiFectamine^TM CHO，再将两者混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamine^TMCHO/质粒DNA混合液。混合液室温孵育1-5min之后转移到准备好的细胞悬液中，缓慢加入并同时轻轻摇晃细胞悬液，最后置于细胞培养摇床中，在37℃，8％CO₂条件下培养。

在转染后18-22个小时内添加ExpiCHO^TMEnhancer和ExpiCHO^TMFeed，摇瓶放置于32℃摇床和5％CO₂条件下继续培养，在转染后第5天，添加相同体积的ExpiCHO^TMFeed，缓慢加入的同时轻轻混匀细胞混悬液。转染12-15天后，将细胞表达上清高速离心(15000g，10min)，所得Fc标签蛋白表达上清通过MabSelect SuRe LX(GE，17547403)进行亲和纯化，然后采用100mM乙酸钠(pH3.0)洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl中和；所得His标签蛋白表达上清通过Ni Smart Beads 6FF(常州天地人和生物科技有限公司，SA036050)进行亲和纯化，然后采用梯度浓度的咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。最后所得蛋白通过浓缩管(Millipore，UFC901096)置换至PBS缓冲液当中。

将纯度和活性鉴定合格的CD47-ECD-Fc用于小鼠免疫，具体操作如下：

购买C57BL/6小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司),6-8周龄，雌性。免疫时采取皮下多点免疫的方式，每次皮下免疫50μg,每两星期免疫一次，共免疫四次。免疫四次后通过ELISA测定免疫的效价，其中ELISA抗原包板采用CD47-ECD-his(SEQ ID NO:2)。测定结果显示免疫效价达到1：600,000，此时采用100μg CD47-ECD-Fc(SEQ ID NO:1)进行加强免疫，2到3天后取脾脏，分离脾脏B淋巴细胞,用于后续免疫抗体库的构建。

实施例2.免疫抗体库构建和筛选

分离按照实施例1所述经免疫的小鼠脾脏中的B淋巴细胞，抽取其RNA，并通过反转录试剂盒(TaKaRa，6210A)反转录成cDNA。参考张学梅,赵彩红,李俊等人，鼠源抗人乳腺癌MRP1/ABCC1噬菌体Fab抗体库的构建[J]，生命科学研究，2014，18(4):338-343中记载的方法，设计一系列的引物分别扩增轻链和重链的可变区以及第一个恒定区，并且在重链CH1的C端融合M13噬菌体GIII蛋白，构建至噬菌体展示用载体上，最终构建的免疫库以Fab的形式展示在M13噬菌体的外壳蛋白上。

具体操作如下：

根据小鼠中所有轻链和重链的V基因和第一个恒定区基因分别设计含有NcoI和AscI、SfiI和NotI酶切位点的简并引物，PCR得到含有可变区和恒定区的区段，通过双酶切和连接反应将目的抗体基因片段***至噬菌体展示用载体上，其中在Fab的重链部分的C端融合了GIII基因。连接产物通过回收试剂盒(Omega，D6492-02)回收，然后通过电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)转化至感受态大肠杆菌SS320细胞(Lucigen,MC1061 F)中，复苏1小时后，涂布于具有氨苄抗性的2-YT固体平板(由胰蛋白胨1.5％，酵母提取物1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％，按质量/体积(g/mL)配制而成)。为了计算库容，同时将1μL菌液进行稀释，而后在平板上进行涂布培养，通过长出的克隆数目进行推算，计算将所有电转化产物形成的总克隆数，即库容容量。此免疫库的库容为1×10⁹cfu。

基于库容容量，挑取50个OD(1个OD为5×10⁸cfu)的以上构建的小鼠免疫库菌加入到新鲜的2-YT液体培养基中，使得初始OD值为0.05。置于37℃，220rpm培养至对数生长期(OD600＝0.5-0.6)，再以50倍于细菌数的数量(即，感染复数MOI为50)加入VSCM13辅助噬菌体(购自Stratagene)，充分混匀，静置30min后在220rpm的摇床中继续培养1小时。随后，将培养物以10000rpm的转速离心5min后，弃上清，将培养液替换为羧苄青霉素50μg/mL/卡那霉素40μg/mL双抗性的2-YT培养基(下文也称为C+/K+2-YT培养基)，并于30℃，220rpm继续培养过夜。次日，菌液于13000g离心10min，收集上清后加入20％PEG/NaCl(由体积浓度为20％的PEG6000和2.5M NaCl配制而成)使得PEG/NaCl最终浓度为4％，混匀，并置于冰上1小时，再以13000g的转速离心10min，将沉淀得到小鼠免疫库对应的噬菌体用PBS润洗后保存并用于后续噬菌体筛选。

本实施例采用免疫管固相筛选的方式筛选针对CD47的抗体，具体方法如下：

第一轮筛选时，在免疫管中加入4mL的50μg/mL的CD47-his，4℃包被过夜，第二天弃去包被液，加入含5％奶粉的PBS封闭2h，PBS润洗两次后加入制备好的噬菌体(总量为10¹²)，孵育2h。用PBS润洗8遍，后用PBST润洗2遍，以去除非特异性结合的噬菌体，然后向免疫管中加入0.8mL含0.05％EDTA的胰酶消化液，用于洗脱特异性结合目标抗原的噬菌体，接着将其侵染对数期的SS320菌体(Lucigen，60512-1)，37℃静置30min，然后220rpm条件下培养1h，再加入VSCM13辅助噬菌体，静置30min，继续在220rpm条件下培养1h。离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，并于30℃，220rpm环境下继续培养过夜。

第二天制备噬菌体。最终得到的噬菌体继续用于第二轮的筛选,如此反复，其中第二次和第三次筛选的抗原浓度分别5μg/mL和1μg/mL，除此之外，PBS润洗强度也逐渐加大，PBS洗脱次数依次为12次和16次。同时对每轮随机挑选10个克隆进行序列分析，经过两到三轮的筛选，当富集较明显并且序列呈现较高多态性时，选择这一轮的菌进行单克隆涂布制备。通过将0.1mM IPTG诱导的单克隆诱导Fab上清进行ELISA，选择阳性克隆进行测序分析。实验发现，此次免疫库筛选得到了超过60个具有不同序列的阳性克隆。通过进一步将这些克隆制备的Fab诱导上清进行CCRF-CEM细胞上的结合实验和SIRPα的结合阻断实验之后，筛选得到部分克隆既结合CCRF-CEM细胞又具有可以阻断SIRPα在细胞上结合的功能。克隆F4(重链可变区CDR1-3分别为SEQ ID NO：10-12，轻链可变区CDR1-3分别为SEQ ID NO：13-15；更具体地，重链可变区为SEQ ID NO：3；轻链可变区为SEQ ID NO：4)是其中之一，为鼠源抗体。

实施例3.鼠源抗体F4的人源化

简言之，将按照实施例2筛选得到的鼠源抗体F4和已知的人源抗体的数据库进行比对，找到同源性最高的种系基因germline，选择使用其框架区(采用AbM定义CDR和框架区)，然后借助计算机预测模拟，通过回复突变的方式保留F4抗体框架区中对抗原结合具有重要影响的鼠源氨基酸，最后将抗原互补性决定区CDR替换为F4中对应的CDR序列。

鼠源抗体F4经人源化后得到人源化抗体F4H3L3，其重链可变区CDR1-3分别为SEQID NO：10-12，轻链可变区CDR1-3分别为SEQ ID NO：SEQ ID NO：13-15；更具体地，重链可变区序列为SEQ ID NO：5，轻链可变区序列为SEQ ID NO：6。

实施例4.人源化抗体F4H3L3的亲和力成熟

为了提升F4H3L3和抗原的亲和力，本实施例对其进行了进一步的亲和力成熟。

4.1亲和力成熟噬菌体展示文库的构建

在本实施例，首先对抗体采用AbM定义CDR和框架区，然后设计一系列引物分别对其CDR进行单点或者连续三点突变进行亲和力成熟噬菌体展示文库的构建，一共可以分为四个库。第一个库，在3个CDR上同时进行单点随机突变，位置分别在L-CDR1、L-CDR3和H-CDR3上；第二个库，在3个CDR上同时进行单点随机突变，位置分别在L-CDR2、H-CDR1和H-CDR2上；第三个库，是对L-CDR3进行连续的三点突变；第四个库是对H-CDR3进行连续的三点突变。

4.2亲和力成熟噬菌体展示文库的筛选

亲和力成熟文库的筛选采用的是液相磁珠法筛选(即液相筛选)，是基于将抗原蛋白CD47-ECD-Fc进行生物素标记后，再与偶联有链霉亲和素的磁珠结合，通过将结合抗原的磁珠和亲和力成熟噬菌体展示文库进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程，经历2-3轮的淘选，由此针对抗原的特异性单克隆抗体可以大量富集。

亲和力成熟噬菌体展示文库抗体筛选的具体实施方法如下：

首先用1mL浓度为100nM的生物素标记CD47-ECD-Fc与链霉亲和素偶联的磁珠孵育，使得生物素标记的目的蛋白结合到磁珠上。然后将结合目的蛋白的磁珠和制备的噬菌体室温下孵育2h。经PBST洗涤8次后，去除非特异性吸附的噬菌体，加入胰蛋白酶(Gibco，25200072)轻轻混匀并反应20min，以洗脱特异性结合的抗体展示噬菌体。随后，用洗脱下来的噬菌体侵染对数期的SS320菌体(Lucigen,MC1061 F)并静置30min，然后在220rpm条件下培养1h，再加入VSCM13辅助噬菌体并静置30min，继续在220rpm条件下培养1h，离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，最终得到的噬菌体继续用于下一轮的淘选。其中第二轮、第三轮和第四轮噬菌体筛选的抗原浓度依次递减，分别为10nM，1nM和0.1nM；除此之外，PBS润洗强度也逐渐加大，PBS洗脱次数依次为12次，16次和20次。

经过亲和力成熟筛选后，在ELISA水平筛选到非常多的抗体能够更好的结合CD47-ECD-Fc抗原，这些抗体包含SEQ ID NO：10-12所示的重链可变区CDR1-3，SEQ ID NO：13、14和16所示的轻链可变区CDR1-3，其中F4AM4(轻链可变区CDR3进行了突变，即，重链可变区CDR1-3分别为SEQ ID NO：10-12，轻链可变区CDR1-3分别为SEQ ID NO：13、14和16，更具体地，重链可变区为SEQ ID NO：5，轻链可变区为SEQ ID NO：9)为其中之一。

实施例5.全长抗体的构建、表达和纯化

在本实施例将所有抗体，包括鼠源抗体F4、人源化抗体F4H3L3和亲和力成熟抗体F4AM4的构建、表达和纯化进行了描述。因为CD47是一类广谱表达于正常细胞上的蛋白，因此为了避免抗体Fc介导的ADCC效应功能导致的毒性，参考美国专利申请US20130224188A1中的描述，将抗体构建至IgG4(S228P/L235E)简称IgG4PE上,其中重链恒定区序列如SEQ IDNO:7，轻链恒定区序列如SEQ ID NO:8。并通过ExpiCHO瞬转表达***(Thermo Fisher，A29133)进行表达以及后续的纯化,具体方法可以参见实施例1。最后通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)将所得抗体置换至PBS缓冲液中。并通过超微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司，Nano-300)进行浓度测定，将经测定的A280数值除以抗体理论消光系数后的数值作为后续研究的抗体浓度值，质检合格后，分装并保存于－80℃。

实施例6.候选抗体FACS水平上亲和力测定

由于细胞水平的CD47相对于重组蛋白更接近天然构象，因此在细胞水平的亲和力更能评估候选抗体的亲和力。为了比较候选抗体和其改造分子以及参比抗体的亲和力,本实施例通过流式方法测定了人源化抗体F4H3L3、亲和力成熟抗体F4AM4以及参比抗体Hu5F9(参照FortySeven公司的专利US20160304609进行制备)在细胞CCRF-CEM(一种人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞，购自ATCC，Number:CCL-119)上的结合能力。具体流式水平验证方法如下：

取1×10⁵个CCRF-CEM细胞，低速离心(300g)去上清。将离心管底部的细胞通过配制好的FACS缓冲液(含体积百分比为2％FBS的1×PBS缓冲液)润洗一次，然后向润洗后的细胞中加入梯度稀释的待测抗体，在4℃孵育1h，接着再用上述FACS缓冲液润洗三次，加入PE标记的山羊抗人IgG Fc抗体(Abcam，ab98596)0.5μg，在4℃孵育1h。其后，经FACS缓冲液润洗三次，并向细胞中加入200μL FACS缓冲液重悬细胞，最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)进行检测。

结果显示在图1中，亲和力成熟抗体F4AM4在细胞水平的结合能力优于对照抗体Hu5F9，同时也优于亲和力成熟之前的抗体F4H3L3，在细胞水平上的结合EC50分别为：F4AM4抗体0.059μg/ml，Hu5F9抗体0.052μg/ml,F4H3L3抗体0.078μg/ml。但在饱和浓度10μg/ml抗体浓度下，F4AM4结合细胞的平均荧光强度为133000，F4H3L3结合细胞的平均荧光强度为122000,而对照抗体Hu5F9的平均荧光强度只有94500。因此基于EC50和饱和浓度下的平均荧光强度等数据可以说明F4AM4在细胞水平的亲和力优于F4H3L3，特别是优于对照抗体Hu5F9，F4H3L3在细胞水平的亲和力也优于对照抗体Hu5F9。

实施例7.候选抗体FACS水平上阻断SIRPα在肿瘤细胞上的结合

候选抗体结合CD47，进而阻断其受体SIRPa的结合，因此在机制上阻断SIRPa在肿瘤细胞上的结合活性是抗CD47抗体药物的关键。

因此，本实施例通过流式方法测定了人源化抗体F4H3L3、亲和力成熟抗体F4AM4以及参比抗体Hu5F9在细胞水平上阻断SIRPα结合的活性。

具体流式水平验证方法如下：

取1×10⁵个CCRF-CEM细胞，低速离心(300g)去上清。将离心管底部的细胞通过配制好的FACS缓冲液(含2％FBS的1×PBS缓冲液)润洗一次，然后向润洗后的细胞中加入梯度稀释的抗体(即，人源化抗体F4H3L3、亲和力成熟抗体F4AM4以及参比抗体Hu5F9)进行孵育1h，FACS缓冲液润洗两次后加入100μL的1μg/mL SIRPα-mFC(ACRO，SIA-H52A8)，在4℃孵育1h，经FACS缓冲液润洗三次，加入100μL PE标记的羊抗鼠Fc二抗(1:200，Abcam,98742)，在4℃孵育1h后离心去上清，向细胞中加入200μL FACS缓冲液重悬细胞，最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)检测SIRPα-mFC在CCRF-CEM肿瘤细胞水平上结合的量。

结果如图2显示，亲和力成熟抗体F4AM4、对照抗体Hu5F9和人源化抗体F4H3L3都能够显著阻断SIRPα-mFC在肿瘤细胞上的结合，阻断能力相似。

实施例8.候选抗体促进巨噬细胞吞噬癌症细胞

肿瘤细胞高表达CD47，与巨噬细胞上的受体SIRPa结合，传递给巨噬细胞“don’teat me”的信号，进而阻断吞噬细胞对肿瘤细胞的吞噬和杀伤，因此阻断CD47和SIRPa结合的候选抗体可以有效促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。本实施例比较了人源化抗体F4H3L3、亲和力成熟抗体F4AM4以及参比抗体Hu5F9促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力。

具体的实验方法如下：

首先，分离人外周血单核细胞PBMC，加入50ng/mL rhM-CSF(购自Peprotech，300-25-10)用于诱导细胞分化为巨噬细胞，37℃细胞培养箱中培养约8天后，吸除上清和未贴壁的细胞，然后加入accutase细胞消化液(购自Sigma，A6964)在37℃孵育45min，消化贴壁细胞并用完全培养基(RPMI1640+10％FBS)制备成均一的细胞悬液，按5×10⁴个细胞每孔分装至96孔板中。加入梯度稀释的抗CD47单克隆抗体，充分混匀，在37℃孵育0.5h，然后再加入2.5×10⁴个CFSE(购自Abcam，ab113853)处理标记的CCRF-CEM，充分混匀，在37℃孵育1h后加入0.25μg APC标记的抗CD14抗体(购自eBioscience,17-0149-42)。置于4℃孵育20min，然后通过500g离心5min，用FACS缓冲液将细胞洗两遍，最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)进行检测，其中巨噬细胞中吞噬有CFSE标记的CCRF-CEM的比例即为吞噬率。

结果如图3显示,所有抗CD47抗体促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬是剂量依赖性的。相比于对照抗体Hu5F9和人源化抗体F4H3L3，亲和力成熟后抗体F4AM4可以更有效的促进巨噬细胞对肿瘤细胞CCRF-CEM的吞噬。比如在同等浓度下，如10μg/ml吞噬率分别为34.8％(F4AM4)、27.3％(F4H3L3)和27.2％(Hu5F9)。

实施例9.候选抗体动物水平抑制肿瘤生长

阻断CD47和SIRPa的候选抗体可以有效促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬和杀伤，在动物实验水平体现为肿瘤的缩小。在本实施例中比较了候选抗体F4AM4和对照抗体Hu5F9的肿瘤抑制效果。

具体实验方法如下：

购买体重约20g的雌性NOD/SCID小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司)，6-8周龄，实验小鼠饲养在恒温恒湿的独立通风盒内，饲养室温度21-24℃，湿度30-53％。每只小鼠通过皮下注射3×10⁶个Raji细胞用于成瘤，10-13天后，待小鼠的肿瘤体积约为80mm³时，将符合要求的小鼠随机分为五组，每组8只，具体为PBS组(阴性对照组),对照抗体Hu5F9组(0.6mg/kg，阳性对照组1),对照抗体Hu5F9(3mg/kg，阳性对照组2),亲和力成熟抗体F4AM4组(0.6mg/kg),亲和力成熟抗体F4AM4组(3mg/kg)。从分组当天开始，通过尾静脉注射方式给药，每周3次，注射三周，共9次，观察和记录肿瘤长a(mm)和宽b(mm)，计算其肿瘤生长体积(V)，计算方式为：V＝(a×b²)/2，记录抗体抗肿瘤效果。同时测定相对肿瘤抑制率(TGI％)，其计算公式：TGI＝1-T/C(％)。T和C分别为治疗组和阴性PBS对照组在某一特定时间点的肿瘤体积。

结果如图4显示，候选抗体和对照抗体都可以显著抑制肿瘤的生长且呈现剂量依赖效应。相对于参比抗体Hu5F9，亲和力成熟抗体F4AM4在低浓度剂量(0.6mg/kg)条件下的肿瘤抑制能力更强，相对肿瘤抑制率(TGI％)分别高达77％和86％，而在高浓度剂量(3mg/kg)条件下两个抗体几乎可以完全压制肿瘤的生长，相对肿瘤抑制率(TGI％)高达98％。

实施例10.候选抗体对红细胞的血凝反应比较

抗体药通过血液循环到达肿瘤病灶部位从而发挥药效，而血液中的红细胞大量表达CD47，由于候选抗体属于二价抗体(即，一个抗体分子能够结合两个CD47)，当浓度达到一定浓度水平时即可以通过交联作用引起红细胞的聚集，从而被吞噬细胞清除，一定程度上是造成贫血等毒性反应的重要原因之一。本实施例比较了亲和力成熟抗体F4AM4以及参比抗体Hu5F9对红细胞的血凝反应。

具体方法如下：

从1mL抗凝处理的人血液中分离红细胞，离心后吸去上清，PBS润洗两次后,加入1mL PBS并重悬。使用PBS将红细胞稀释20倍，以每孔50μL吸取红细胞加入到96孔圆底细胞培养板中，然后等体积加入梯度稀释的抗CD47抗体，充分混匀，置于37℃培养箱孵育3h。之后取出观察血凝反应程度，红细胞沉积的面积大小代表了血凝的强度，面积越大代表血凝越强，反之越弱。

结果如图5显示，亲和力成熟抗体F4AM4处理的红细胞聚集成一小团沉在圆孔底部，表示血凝反应较弱，而对照抗体Hu5F9处理的红细胞分散面积大，显示血凝反应非常严重，这与专利US20160304609中报道结果是一致的。这表示相对于对照抗体Hu5F9，候选抗体F4AM4具有较低的血凝反应、较低的贫血毒性或者副作用。

实施例11.候选抗体的热稳定性比较

抗体的热稳定性可使用“熔解温度”(Tm)来表征,通常Tm值越高,表明抗体的热稳定性越强。差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry；DSF)能够根据蛋白质图谱中的荧光变化过程提供有关蛋白质结构稳定性的信息，检测蛋白的构型变化，获得蛋白质的熔解温度(Tm)。在本实施例中，采用DSF法检测了候选抗体的Tm值。

具体方法如下：

制备抗体溶液，0.2mg/mL，19μL/孔，每个供试品在96孔板(Nunc)中设置三个平行孔，并以PBS和IPI(Ipilimlumab)作为参比，然后在每个孔中加入1μL浓度为100×的SYPROorange染料，用移液枪吹打混匀，准备上机。样品热稳定测试采用ABI 7500FAST RT-PCR仪器，试验类型选择熔解曲线，采用连续模式，扫描温度范围为25～95℃，升温速率为1％，25℃平衡5min，在升温过程中采集数据，报告基团选择“ROX”，淬灭基团选择“None”，反应体积20μL，以熔解曲线一阶导数的第一个峰谷对应的温度确定为候选抗体的熔解温度Tm。

结果如表1显示，亲和力成熟抗体F4AM4以及对照抗体Hu5F9的Tm值分别为70.6℃和63.9℃，这表明，与对照抗体Hu5F9相比，亲和力成熟抗体F4AM4具有更佳的热稳定性。

表1.候选抗体和对照抗体的熔解温度

抗体名称	Tm(℃)
		F4AM4	70.6
Hu5F9	63.9

本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

序列表

<110> 上海元宋生物技术有限公司

三优生物医药（上海）有限公司

<120> CD47结合分子及其用途

<130> IDC196021

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 350

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD47-ECD-Fc

<400> 1

Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn

1 5 10 15

Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn

20 25 30

Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr

35 40 45

Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser

50 55 60

Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys

85 90 95

Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys

100 105 110

Tyr Arg Val Val Ser Trp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

115 120 125

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

145 150 155 160

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

165 170 175

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

180 185 190

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

195 200 205

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

210 215 220

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

225 230 235 240

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

245 250 255

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

260 265 270

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

275 280 285

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

290 295 300

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

305 310 315 320

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

325 330 335

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345 350

<210> 2

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD47-ECD-6*his

<400> 2

Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn

1 5 10 15

Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn

20 25 30

Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr

35 40 45

Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser

50 55 60

Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys

85 90 95

Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys

100 105 110

Tyr Arg Val Val Ser Trp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Ala His His His His His His His His

130 135

<210> 3

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠源抗体F4重链可变区VH

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠源抗体F4轻链可变区VL

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体F4H3L3重链可变区VH

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Asp Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体F4H3L3轻链可变区VL

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人重链恒定区

<400> 7

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人轻链恒定区

<400> 8

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 亲和力成熟的抗体F4AM4的轻链可变区

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Asn Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 10

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Val Met His

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<400> 11

Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Asp Gly Thr Lys

1 5 10

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 12

Pro Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 13

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 14

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 15

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Phe Thr

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 16

Gln Gln Gly Lys Asn Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 17

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码重链可变区的核酸序列

<400> 17

caggttcaac tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctctgtta tgcactgggt gaggcagaag 120

cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acactgatgg aactaagtac 180

aatgagaact tcaaagacaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggagttta gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgg aagaccttac 300

tacggtacta ggtacggaag ctggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 360

tctgca 366

<210> 18

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码轻链可变区的核酸序列

<400> 18

gacattcaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa a 321

<210> 19

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码重链可变区的核酸序列

<400> 19

caggttcagc tggttcagag cggtgccgaa gttaaaaaac cgggtgcaag cgttaaaatg 60

agctgtaaag caagcggtta tacctttacc agcagcgtta tgcattgggt tcgtcaggca 120

cctggtcaag gtctggaatg gattggttat atcaatccgt ataccgatgg caccaaatat 180

gcacagaaat ttcagggtcg tgcaaccctg accagcgata aaagcaccag caccgcatat 240

atggaattta gcagcctgcg tagcgaagat accgcagtgt attattgtgg tcgtccgtat 300

tatggcaccc gttatggtag ctggtttgca tattggggtc agggcaccct ggttaccgtt 360

agcagc 366

<210> 20

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码轻链可变区的核酸序列

<400> 20

gatattcaga tgacccagag tccgagcagc ctgagcgcaa gcgttggtga tcgtgttacc 60

attacctgtc gtgcaagcca ggatattagc aattatctga attggtatca gcagaaaccg 120

ggtaaagcac cgaaactgct gatctattat accagccgtc tgcatagcgg tgttccgagc 180

cgttttagcg gtagcggtag tggcaccgat tataccctga ccattagcaa tctgcagccg 240

gaagatattg caacctatta ttgtcagcag ggcaataccc tgccgtttac ctttggtagc 300

ggcaccaaac tggaaattaa a 321

<210> 21

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码轻链可变区的核酸序列

<400> 21

gacatccaga tgacccagtc tccatcctct ctgtccgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgta gagccagcca ggacatctcc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctactac acctctcggc tgcactctgg cgtgccctct 180

agattttctg gctccggctc tggcaccgac tacaccctga ccatctctaa cctgcagcct 240

gaggatatcg ccacctacta ctgccagcag ggcaagaact accccttcac cttcggctcc 300

ggcaccaagc tggaaatcaa g 321

Claims

1.一种分离的CD47结合分子，其特异性结合人CD47，其中所述分离的CD47结合分子包含：

重链CDR1包含SEQ ID NO：10或由SEQ ID NO：10组成，

重链CDR2包含SEQ ID NO：11或由SEQ ID NO：11组成，和

重链CDR3包含SEQ ID NO：12或由SEQ ID NO：12组成；和/或

轻链CDR1包含SEQ ID NO:13或由SEQ ID NO:13组成，

轻链CDR2包含SEQ ID NO:14或由SEQ ID NO:14组成，和

2.根据权利要求1所述的分离的CD47结合分子，其中所述分离的CD47结合分子包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区包含：

包含SEQ ID NO：10或由SEQ ID NO：10组成的重链CDR1，

包含SEQ ID NO：11或由SEQ ID NO：11组成的重链CDR2，和

包含SEQ ID NO：12或由SEQ ID NO：12组成的重链CDR3；和

(2)轻链可变区，所述轻链可变区包含：

包含SEQ ID NO:13或由SEQ ID NO:13组成的轻链CDR1，

包含SEQ ID NO:14或由SEQ ID NO:14组成的轻链CDR2，和

包含SEQ ID NO:15或16或由SEQ ID NO:15或16组成的轻链CDR3。

3.根据权利要求2所述的分离的CD47结合分子，其中所述分离的抗CD47结合分子包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区包含：

SEQ ID NO：10所示的重链CDR1，

SEQ ID NO：11所示的重链CDR2，和

SEQ ID NO：12所示的重链CDR3；和

(2)轻链可变区，所述轻链可变区包含：

SEQ ID NO:13所示的轻链CDR1，

SEQ ID NO:14所示的轻链CDR2，和

SEQ ID NO:15或16所示的轻链CDR3。

4.根据权利要求1所述的分离的CD47结合分子，其中所述分离的CD47结合分子包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；

(2)轻链可变区，所述轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

5.根据权利要求4所述的分离的CD47结合分子，其中重链可变区如SEQ ID NO：3所示，轻链可变区如SEQ ID NO：4所示。

6.根据权利要求1所述的分离的CD47结合分子，其中所述分离的CD47结合分子包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(2)轻链可变区，所述轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；

7.根据权利要求6所述的分离的CD47结合分子，其中所述分离的CD47结合分子包含SEQID NO：5所示的重链可变区和与SEQ ID NO：6所示的轻链可变区。

8.根据权利要求1所述的分离的CD47结合分子，其中所述分离的CD47结合分子包含：

(1)重链可变区，所述重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(2)轻链可变区，所述轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列；

9.根据权利要求8所述的分离的CD47结合分子，其中所述分离的CD47结合分子包含SEQID NO：5所示的重链可变区和SEQ ID NO：9所示的轻链可变区。

10.根据权利要求1所述的分离的CD47结合分子，其中所述CD47结合分子为单克隆抗体，例如，鼠源单克隆抗体、人源化抗体或亲和力成熟的抗体。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的分离的CD47结合分子，其中所述CD47结合分子融合至IgG的恒定区，例如人IgG的恒定区，优选人IgG1或人IgG4的恒定区，更优选包含S228P/L235E的人IgG4的恒定区，其中重链恒定区序列如SEQ ID NO：7，轻链恒定区序列如SEQ ID NO：8。

12.一种分离的核酸分子，其包含编码如权利要求1-11的任一项中所定义的分离的CD47结合分子的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。

13.根据权利要求12所述的分离的核酸分子，其包含选自SEQ ID NO:17或19的编码重链可变区的核苷酸序列，和/或选自SEQ ID NO:18、20或21的编码轻链可变区的核苷酸序列。

14.一种分离的核酸分子，其包含编码如权利要求1-11的任一项中所定义的分离的CD47结合分子的重链和/或轻链的核酸序列。

15.一种载体，其包含权利要求12-14中任一项的核酸分子。

16.一种宿主细胞，其包含权利要求15的载体。

17.根据权利要求16所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞，例如，大肠杆菌细胞、酵母细胞、CHO和HEK293细胞。。

18.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1-11的任一项中所定义的CD47结合分子和药学上可接受的载体。

19.一种制备如权利要求1-11的任一项中所定义的CD47结合分子的方法，其包括以下步骤：

-在权利要求16的宿主细胞中表达如权利要求1-11的任一项中所定义的CD47结合分子；和

-从所述宿主细胞分离所述CD47结合分子。

20.根据权利要求1-11中任一项所定义的CD47结合分子在制备用于预防或治疗受试者中与CD47相关的疾病的药物中的用途。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述受试者为人。

22.根据权利要求20所述的用途，其中所述与CD47相关的疾病选自白血病、淋巴癌、结直肠癌或卵巢癌，优选为急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

23.一种用于预防或治疗受试者中与CD47相关的疾病的试剂盒，其包含：容器，所述容器包含权利要求1-11的任一项中所定义的至少一种CD47结合分子；和使用说明材料。