CN111304272B

CN111304272B - 一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法

Info

Publication number: CN111304272B
Application number: CN201911341704.4A
Authority: CN
Inventors: 曲媛; 于未博; 唐美玲; 姜世丹
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2039-12-24
Also published as: CN111304272A

Abstract

本发明公开一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶总皂苷制备人参稀有皂苷的方法，以轮枝镰孢菌为发酵菌种，将种子液加入添加有三七茎叶皂苷的培养基中，摇床发酵培养7天，发酵结束后过滤菌液，菌液用等体积的正丁醇提取2次，合并正丁醇提取液，减压浓缩得到富含三七皂苷Fd、人参皂苷Mx及人参皂苷CK的稀有皂苷产物；本发明方法工艺简单、发酵成本低、转化效率高，为其工业化生产及新药制备提供了保证。

Description

一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法

技术领域

本发明属生物医药技术领域，具体涉及一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法。

背景技术

三七Panax notoginseng (Burk) F.H. Chen为五加科人参属植物，为我国著名的传统中药。三七具有化瘀止血，活血定痛的功效。三七最主要的活性成分为皂苷类化合物。目前已从三七不同部位如根、茎叶、花、果等分离鉴定出150余种皂苷。同时，人们在研究皂苷生理活性的同时，发现皂苷中的糖链与其生物活性密不可分，如皂苷糖分子越少，其活性越高。例如，人参皂苷CK含有一个葡萄糖基，为达玛烷型二醇组人参皂苷的生物体内代谢产物，其具有良好的抑制癌细胞生长及抗转移的作用。由于这类低糖链皂苷在三七中的含量极低，限制了其在药物领域的应用。因此，快速高效地制备低糖链稀有皂苷已成为研究热点与难题。

为了有效获得大量的人参稀有皂苷，传统化学方法时间长、耗能高、产率低、选择性差，极易造成环境污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，可实现绿色、高效、专一的稀有人参皂苷的转化方法，易于工业化生产。

本发明的目的是通过以下具体技术方案实现的：

一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，具体步骤如下：

以轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)为发酵菌种，接种到含有三七茎叶皂苷的液体发酵培养基中，摇床发酵培养7天，发酵结束后过滤菌液，菌液用等体积的正丁醇提取2次，合并正丁醇提取液，减压浓缩得到人参稀有皂苷产物；将人参稀有皂苷产物采用反相硅胶进行纯化，溶剂***为甲醇/水，依次采用不同浓度的甲醇溶液（按体积比为甲醇:水 = 50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0）进行梯度流动相洗脱，根据薄层色谱（TLC）结果，合并洗脱液，分别浓缩后，得到三七皂苷Fd、人参皂苷Mx、人参皂苷CK，三七皂苷Fd、人参皂苷Mx、人参皂苷CK其结构式分别如下Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所示：

所述轮枝镰孢菌的接种量为5-15%，即轮枝镰孢菌占液体发酵培养基总质量的5-15%。

所述液体发酵培养基为马铃薯培养基，其制备方法是：取200g新鲜市售马铃薯，切成边长为1cm的正方形马铃薯块，加纯净水1L煮沸30min，用8层纱布过滤，用纯净水定容至1L，每升加20g葡萄糖混匀，在121℃下灭菌20 min后，放置至室温，调整培养基pH值为5.5。

所述液体发酵培养基中三七茎叶皂苷的浓度为0.5-1g/L。

所述摇床发酵培养的摇床转速为100-180r/min，温度为25-30℃。

本发明的优点是：采用新方法对三七茎叶总皂苷进行生物转化，转化的时间短，过程稳定，转化产物相对单一，且成本低廉。通过该方法可实现定向、专一的生产和分离稀有人参皂苷，易于工业化生产。

附图说明

图 1 轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明方法作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。

本发明使用的岛津高效液相色谱仪（包括在线脱气机DGU-20A3R(C)、二元泵LC-20AB、自动进样器SIL-20A、柱温箱CTO-20A、检测器SPD-20A）。

实施例1

（1）液体发酵培养基的制备：将200g去皮马铃薯，切成1.0cm左右的马铃薯丁，加入1L纯水煮沸30min，8层纱布过滤并将液体补齐至1L，加入葡萄糖20g，充分混匀，在121℃下灭菌20min后，放置至室温，采用稀盐酸和稀氢氧化钠溶液调节培养基pH值为5.5；

（2）将三七茎叶总皂苷加入到步骤（1）的液体发酵培养基中，三七茎叶总皂苷的浓度为1g/L，按照10%的接种量，将轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)接种到步骤（1）制备得到的液体发酵培养基中，将培养基置于28℃恒温摇床中150r/min培养7天；

（3）步骤（2）发酵结束后过滤菌液，菌液用等体积的正丁醇提取2次，合并正丁醇提取液，旋转蒸发仪减压浓缩得到正丁醇浸膏（0.64g），即人参稀有皂苷产物；

（4）将步骤（3）得到的正丁醇浸膏（0.64g）经反相硅胶ODS柱色谱分离（溶剂***按体积比为甲醇:水 = 50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0）为流动相进行梯度洗脱，根据TLC结果，合并洗脱液，分别经过旋转蒸发仪减压浓缩后，得到三七皂苷Fd（0.12g），人参皂苷Mx（0.05g），人参皂苷CK（0.19g）。

经NMR鉴定，三七皂苷Fd为式Ⅰ所示化合物，人参皂苷Mx为式Ⅱ所示化合物，人参皂苷CK为式Ⅲ所示化合物：

本实施例提取分离到的三七皂苷Fd、人参皂苷Mx及人参皂苷CK的理化特征及化学结构的定性鉴定如下：

三七皂苷Fd：白色无定形粉末，分子式C₄₇H₈₀O₁₇。

¹³C-NMR (pyridine-d ₅，125 MHz)：δ：131.3(C-25)，126.4(C-24)，107.3(C-1')，106.2(C-1''')，98.5(C-1'')，83.8(C-20)，89.2(C-3)，79.7(C-3'), 79.1(C-3''), 78.7(C-5'), 78.3(C-3'''), 77.3(C-5''), 76.2(C-2'), 75.3(C-2''), 75.2(C-2'''),72.3(C-4''), 72.0(C-4'), 71.5(C-4'''), 70.5(C-6''), 70.4(C-12)，67.4(C-5'''),63.5(C-6'), 56.7(C-5)，51.8(C-17)，52.0 (C-14)，50.6(C-9)，49.9(C-13)，40.4(C-8)，40.0(C-4)，39.6(C-1)，37.3(C-10)，36.5(C-22)，35.5(C-7)，31.2(C-15)，31.1(C-11)，27.0(C-2)，28.5(C-28)，27.1(C-16)，26.2(C-26)，23.5(C-23)，22.7(C-21)，18.8(C-6)，18.3(C-27)，17.8(C-30)，17.2(C-29)，16.6(C-18)，16.4(C-19)。

人参皂苷Mx：白色无定形粉末，分子式C₄₁H₇₀O₁₂。

¹³C-NMR (pyridine-d ₅，125 MHz)：δ：131.4(C-25)，126.4(C-24)，106.2(C-1'')，98.4(C-1')，83.8(C-20)，79.7(C-3'), 78.4(C-3)，78.3(C-3''), 77.3(C-5'), 75.2(C-2'), 75.2(C-2''), 72.0(C-4'), 71.5(C-4''), 70.5(C-12), 70.4(C-6'), 67.3(C-5''), 56.7(C-5)，52.0(C-17)，51.8 (C-14)，50.7(C-9)，49.9(C-13)，40.4(C-8)，39.9(C-4)，39.8(C-1)，37.7(C-10)，36.6(C-22)，35.5(C-7)，31.1(C-15)，31.3(C-11)，29.0(C-2)，28.6(C-28)，27.0(C-16)，26.2(C-26)，23.5(C-23)，22.7(C-21)，19.1(C-6)，18.3(C-27)，17.8(C-30)，16.7(C-29)，16.7(C-18)，16.4(C-19)。

人参皂苷CK：白色无定形粉末，分子式C₃₆H₆₂O₈。

¹³C-NMR (pyridine-d ₅，125 MHz)：δ：130.9(C-25)，125.9(C-24)，83.3(C-20)，78.4(C-3)，70.4(C-12)，56.4(C-5)，51.8(C-17)，51.6(C-14)，50.3(C-9)，49.6(C-13)，40.2(C-8)，39.6(C-4)，39.4(C-1)，37.6(C-10)，36.3(C-22)，35.2(C-7)，31.2(C-15)，30.8(C-11)，28.4(C-2)，28.7(C-28)，26.7(C-16)，25.8(C-26)，23.2(C-23)，22.6(C-21)，18.9(C-6)，17.9(C-27)，17.4(C-30)，16.6(C-29)，16.3(C-18)，16.1(C-19)。

取步骤（3）的人参稀有皂苷产物5mg，用甲醇溶解定容至1mL，用0.45μm微孔滤膜过滤后，采用高效液相色谱法进行检测。

高效液相色谱法测定条件：色谱柱：YMC-Triart C18色谱柱（5µm，250mm×4.6mm），流速为1.0mL/min，洗脱条件见表1，柱温为25℃，紫外检测波长为203nm，进样量为20.0µL。

检测结果：从图1可以看出，经过轮枝镰孢菌转化后，三七茎叶总皂苷的成分发生了变化，三七茎叶总皂苷的原有皂苷含量大幅度下降，而新生成皂苷三七皂苷Fd、人参皂苷Mx及人参皂苷CK含量显著增加；经检测，三七皂苷Fd、人参皂苷Mx及人参皂苷CK重量之和在人参稀有皂苷产物中的含量为65.8%。

表1 洗脱条件

。

实施例2

（2）将三七茎叶总皂苷加入到步骤（1）的液体发酵培养基中，三七茎叶总皂苷的浓度为0.8g/L，按照5%的接种量，将轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)接种到步骤（1）制备得到的液体发酵培养基中，将培养基置于30℃恒温摇床中180r/min培养7天；

（3）步骤（2）发酵结束后过滤菌液，菌液用等体积的正丁醇提取2次，合并正丁醇提取液，旋转蒸发仪减压浓缩得到正丁醇浸膏，即人参稀有皂苷产物；

（4）将步骤（3）得到的正丁醇浸膏经反相硅胶ODS柱色谱分离（溶剂***按体积比为甲醇:水 = 50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0）为流动相进行梯度洗脱，根据TLC结果，合并洗脱液，分别经过旋转蒸发仪减压浓缩后，得到三七皂苷Fd，人参皂苷Mx，人参皂苷CK。

实施例3

（2）将三七茎叶总皂苷加入到步骤（1）的液体发酵培养基中，三七茎叶总皂苷的浓度为0.5g/L，按照15%的接种量，将轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)接种到步骤（1）制备得到的液体发酵培养基中，将培养基置于25℃恒温摇床中100r/min培养7天；

Claims

1.一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶总皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于，以轮枝镰孢菌为发酵菌种，接种到含有三七茎叶皂苷的液体发酵培养基中，摇床发酵培养7天，发酵结束后过滤菌液，菌液用等体积的正丁醇提取2次，合并正丁醇提取液，减压浓缩得到人参稀有皂苷产物；将人参稀有皂苷产物采用反相硅胶进行纯化，采用不同浓度的甲醇水溶液进行梯度流动相洗脱，根据薄层色谱结果，合并洗脱液，分别浓缩后，得到三七皂苷Fd、人参皂苷Mx、人参皂苷CK。

2.根据权利要求1所述利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶总皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于，轮枝镰孢菌的接种量为5-15%。

3.根据权利要求1所述利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶总皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于，液体发酵培养基的制备方法是：取200g新鲜市售马铃薯，切成边长为1cm的正方形马铃薯块，加纯净水1L煮沸30min，用8层纱布过滤，用纯净水定容至1L，每升加20g葡萄糖混匀，在121℃下灭菌20 min后，放置至室温，调整培养基pH值为5.5。

4.根据权利要求1所述利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶总皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于，液体发酵培养基中三七茎叶皂苷的浓度为0.5-1g/L。

5.根据权利要求1所述利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶总皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于，摇床发酵培养的摇床转速为100-180r/min，温度为25-30℃。