CN113336822B - 麦冬-甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
麦冬-甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113336822B CN113336822B CN202110560123.0A CN202110560123A CN113336822B CN 113336822 B CN113336822 B CN 113336822B CN 202110560123 A CN202110560123 A CN 202110560123A CN 113336822 B CN113336822 B CN 113336822B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- volume ratio
- water
- mixed solvent
- methanol
- gradient manner
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
- C07J71/0005—Oxygen-containing hetero ring
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一类甾体皂苷类化合物及其制备方法和医药用途，属于医药技术领域。首先使用乙醇水溶液提取麦冬获得粗提物，然后依次通过大孔树脂吸附、ODS色谱柱、HPLC YMC ODS‑A C18色谱多级分离，获得甾体皂苷类化合物，本发明的甾体皂苷类化合物的制备方法简单，易操作，设备价格低廉，使用的溶剂环境友好，便于工业放大生产，本发明所制备的甾体皂苷类化合物对肺癌细胞有显著的细胞毒性，有望作为肺癌治疗的潜在药物。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用，具体涉及麦冬干燥根茎中的甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
传统中药麦冬为百合科(Liliaceae)沿阶草属植物麦冬(Ophiopogon japonicus(L.f.)Ker-Gawl)的干燥块根，其味甘、微苦，微寒，归肺、心、胃经，具有滋阴生津，润肺清心等功效，可用于肺燥干咳，津伤口渴，心烦失眠，内热消渴，肠燥便秘等症。麦冬原产中国，日本、越南、印度也有分布。麦冬是我国传统的药食两用植物，《神农本草经》将麦冬列为养阴润肺的上品，言其“久服轻身，不老不饥”，麦冬已被开发成多种保健食品和在茶饮食疗中广泛应用。虽然国内外研究学者对麦冬的化学成分和药理作用进行了部分研究，麦冬以甾体皂苷类、多糖、和高异黄酮为主要化学成分，其中甾体皂苷和高异黄酮具有多种药理活性，现仍急需进一步研究开发中药麦冬中的功能活性成分以便更好地开发其药用价值。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一系列甾体皂苷类化合物及其制备方法和医药用途。
本发明所提供的甾体皂苷类化合物及其盐，所述的甾体皂苷类化合物具有以下结构通式：
其中，R1、R2、R3和R4分别为氢、羟基或甲基。
进一步地，所述的甾体皂苷类化合物包括如下化合物：
本发明另一方面提供所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，该方法主要包括如下步骤：
(1)使用乙醇水溶液提取麦冬(Ophiopogon japonicus)，回收提取溶剂，得粗提物浸膏；
(2)将步骤(1)所得的粗提物加水溶解，上样至大孔吸附树脂色谱柱，梯度洗脱，洗脱液为乙醇-水体积比由0:100梯度增加90:10的混合溶剂，收集乙醇-水体积比为70:30～95:5的洗脱液；
(3)将步骤(2)所得的洗脱液，上样至硅胶柱色谱柱，梯度洗脱，洗脱液为石油醚和乙酸乙酯体积比由100:0梯度降低到1:5的混合溶剂，或者石油醚和丙酮体积比由100:0梯度降低到1:5的混合溶剂，或者二氯甲烷和丙酮体积比由100:0梯度降低到1:5的混合溶剂，或者氯仿和丙酮体积比由100:0梯度降低到1:5的混合溶剂，或者二氯甲烷和甲醇体积比由100:0梯度降低到1:5的混合溶剂，或者氯仿和甲醇体积比由100:0梯度降低到1:5的混合溶剂，收集体积比为100:6～1:2的洗脱液；
(4)将步骤(3)中所得的洗脱液上样至ODS反向柱色谱分离，梯度洗脱，洗脱液为甲醇-水体积比由20:80梯度增加至100:0的混合溶剂或乙腈-水体积比由20:80梯度增加至100:0的混合溶剂，收集甲醇-水体积比为2:8～8:2或乙腈-水体积比为2:8～8:2的洗脱液；
(5)将步骤(4)所得的洗脱液上样到HPLC制备型色谱柱YMC ODS-A C18，用甲醇-水的体积比为50:50～90:10的混合溶剂或者乙腈-水的体积比为20:80～70:30的混合溶剂为流动相进行洗脱，得到甾体皂苷化合物。
进一步地，步骤(1)中所述提取为加热回流提取或加热超声提取1～6次。
进一步地，步骤(1)中所述乙醇水溶液的体积百分比浓度为50％～99％，麦冬与乙醇水溶液的重量体积比为1:5～1:20g/mL。
进一步地，乙醇的体积百分比浓度为70～95％，麦冬与乙醇的重量体积比为1:10-1:15g/mL。
进一步地，步骤(2)中所述的大孔吸附树脂色谱柱采用水溶解后全拌样的上样方法，具体步骤为将粗提物溶解于水中，粗提物与水的重量体积比为1:1～1:10，得到粗提物的水溶液，加入3～10倍粗提物重量的大孔吸附树脂搅拌均匀，滤干。
进一步地，粗提物与水的重量体积比为1:2～1:5；加入3～6倍粗提物重量的大孔吸附树脂。
进一步地，所述大孔吸附树脂为D101、D101B、HPD-100中的任意一种。
进一步地，步骤(3)中所述洗脱液为石油醚和乙酸乙酯体积比由100:15梯度降低到1:2的混合溶剂，或者石油醚和丙酮体积比由100:15梯度降低到1:2的的混合溶剂，或者二氯甲烷和丙酮体积比由100:4梯度降低到2:1的的混合溶剂，或者氯仿和丙酮体积比由100:4梯度降低到2:1的混合溶剂，或者二氯甲烷和甲醇体积比由100:0梯度降低到1:1的混合溶剂，或者氯仿和甲醇体积比由100:8梯度降低到1:1的的混合溶剂，收集体积比为100:15～4:1的洗脱物。
进一步地，步骤(4)中所述洗脱液为甲醇-水体积比由40:60梯度增加至90:10的混合溶剂或乙腈-水体积比由40:60梯度增加至80:20的混合溶剂，收集甲醇-水体积比为40:60～90:10或乙腈-水体积比为40:60～80:20的洗脱物。
进一步地，步骤(5)中使用甲醇-水的体积比为60:40～90:10的混合溶剂或者乙腈-水的体积比为30:70～70:30的混合溶剂为流动相。
本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含所述的甾体皂苷类化合物及其药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料、稀释剂和载体。
本发明进一步提供了所述甾体皂苷类化合物及其药学上可接受的盐或所述的药物组合物在制备预防和治疗癌症的药物中的应用。
进一步地，所述的癌细胞为肺癌细胞NCI-H460。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
1.本发明以麦冬为原料，首次提取获得甾体皂苷类化合物1-4。
2.本发明的甾体皂苷类化合物的制备方法简单，易操作，设备价格低廉，使用的溶剂环境友好，便于工业放大生产。
3.本发明的甾体皂苷类化合物对肺癌细胞系均显示细胞毒性，甾体皂苷化合物4对肺癌有显著的细胞毒性，有望作为肺癌治疗的潜在药物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
实施例1
一类提取于麦冬的甾体皂苷类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：
(1)麦冬干燥根茎500g用70％乙醇提取3次(每次用量为10L，每次提取2h)，减压回收提取液，得到粗提物；
(2)上述步骤(1)所得的乙醇粗提物加水溶解(粗提物和水重量体积比＝1:1)，经D101大孔树脂吸附(粗提物:大孔树脂重量比＝1:5)，依次用水、20％乙醇-水(v/v)、50％乙醇-水(v/v)、70％乙醇-水(v/v)和90％乙醇-水(v/v)梯度洗脱，得到不同极性部位的洗脱物；
(3)步骤(2)中所得90％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以石油醚和乙酸乙酯体积比为100:15，100:20，3:1，1:1，1:2的混合溶剂洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的石油醚：乙酸乙酯3:1～1:2流份经ODS反相柱色谱分离，依次用体积比40:60，60:40，80:20，100:0甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)流份经HPLC YMC ODS-A C18色谱分离制备，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝67:33(v/v)，得到甾体皂苷1(tR＝61min)(收率为0.00119％)，得到甾体皂苷2(tR＝78min)(收率为0.00092％)；上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)流份经HPLC YMC ODS-A C18色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝80:20(v/v)，得到甾体皂苷3(tR＝37min)(收率为0.00058％)，得到甾体皂苷4(tR＝45min)(收率为0.00071％)。
根据甾体皂苷1～4的理化性质和波谱数据鉴定了其结构。
甾体皂苷1的结构鉴定数据如下：
白色无定形粉末(CH3OH)。HRESI-MS给出准分子离子峰为m/z 413.2959[M-H2O+H]+，结合其NMR数据可知其分子式为C27H42O4，不饱和度为7。1H-NMR(400MHz,pyridine-d5)中，高场区可见4个甲基氢信号δH 0.69(3H,d,J＝5.4Hz,CH 3-27),0.94(3H,s,CH 3-18),1.14(3H,d,J＝7.0Hz,CH 3-21),1.35(3H,s,CH 3-19)，低场区可见1个烯氢信号δH 5.67(1H,br.s,H-6)。13C-NMR(100MHz,pyridine-d5)谱中共显示27个甾体母核碳信号，其中包括异螺甾烷结构中的螺缩酮特征碳信号δC 109.4(C-22)，五七元环骈合的特征碳信号δC 53.8(C-1)和2个双键碳信号δC 145.6(C-5)和122.2(C-6)。将化合物1的1DNMR数据，与文献报道的bufospirostenin A数据进行对比[1]，根据5-7元环上的碳信号δC53.4(C-1),144.9(C-5),61.2(C-9)，可知化合物1的结构为5/7/6/5/5/6元环***的异螺甾烷醇型甾体皂苷元。进一步依据HSQC、HMBC和1H-1H COSY谱的相关信息对其氢碳数据进行归属。
HMBC谱中，δH 2.67(H-4α),2.80(H-4β)与δC 145.6(C-5),122.2(C-6),δH 2.47(H-2β)与δC 73.7(C-10),δH 2.74(H-2α)与δC 145.6(C-5),δH 1.35(CH 3-19)与δC 53.8(C-1),61.3(C-9)的远程相关，进一步提示A/B环是通过C-1和C-5以5-7元环骈合而成。NOESY谱中，δH 1.99(H-20)与δH 0.94(CH 3-18)相关,δH 1.61(H-8)与δH 0.94(CH 3-18),1.35(CH 3-19)相关，提示CH3-18,CH3-19和H-20均为β取向；δH 3.17(H-1)与δH 4.43(H-3α),1.88(H-7α),1.62(H-9)相关，提示他们均为α构型,且B/C环为反式骈合。
经检索，该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为ophiopogonoside 1。NMR信号归属见表1和表2。
甾体皂苷2的结构鉴定数据如下：
白色无定形粉末(CH3OH)。HRESI-MS给出准分子离子峰为HRESI-MS m/z 430.2943[M-2H2O+H]+，可知其分子式为C27H42O4。1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)中，高场区可见4个甲基氢信号：δH 0.70(3H,d,J＝5.4Hz,CH 3-27),1.08(3H,s,CH 3-18),1.13(3H,d,J＝7.9Hz,CH 3-21),1.35(3H,s,CH 3-19)，低场区提供1个双键氢信号δH 5.68(1H,br.s,H-6)。13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)谱中共给出27个碳信号，其中包括异螺甾烷型甾体皂苷的螺甾缩酮δC 108.9(C-22)的特征季碳信号，以及δC 145.7(C-5)和122.4(C-6)的双键碳信号；根据化合物2的1D NMR数据，并结合化合物1的NMR数据进行分析，可知化合物2的结构与1相似，也为A/B环为5-7元环骈合而成的异螺甾烷醇型甾体皂苷元，不同在CH3-21的构型。并根据HSQC和1H-1H COSY谱的相关信息对氢碳数据进行归属。
HMBC谱中，δH 3.18(H-1)与δC 145.7(C-5),122.4(C-6),17.1(CH3-19),δH 2.74(H-2α)与δC 145.7(C-5),δH 2.82(H-4α)与δC 145.7(C-5),122.4(C-6),δH 1.35(CH 3-19)与δC 73.8(C-10),61.4(C-9)的远程相关，进一步提示A/B环是通过C-1和C-5以5-7元环骈合而成。
NOESY谱中，δH 4.59(H-16)与δH 2.67(H-20),1.07(H-14)相关,提示H-20为α构型，δH 1.56(H-8)与δH 1.08(CH 3-18),δH 1.35(CH 3-19)相关，提示CH3-18,CH3-19和H-8均为β构型,且B/C环为反式骈合，δH 3.18(H-1)与δH 4.44(H-3α),1.87(H-7α),1.57(H-9)相关，提示他们均为α构型。
综上，经检索，该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为ophiopogonoside2。NMR信号归属见见表1和表2。
甾体皂苷3的结构鉴定数据如下：
白色无定形粉末(CH3OH)。HRESI-MS给出准分子离子峰为m/z 461.2921[M-H]-，可知其分子式为C27H42O6。1H-NMR(400MHz,pyridine-d5)中，高场区可见4个甲基氢信号：δH0.69(3H,d,J＝5.4Hz,CH 3-27),0.94(3H,s,CH 3-18),1.14(3H,d,J＝7.0Hz,CH 3-21),1.35(3H,s,CH 3-19)，低场区提供1个双键氢信号δH 5.67(1H,br.s,H-6)。13C-NMR(100MHz,pyridine-d5)谱中共给出27个碳信号，其中包括异螺甾烷型甾体皂苷的螺甾缩酮δC 110.1(C-22)的特征季碳信号，以及δC 141.4(C-5)和122.4(C-6)的双键碳信号；根据化合物3的1D NMR数据，并结合文献NMR数据，可知化合物3为异螺甾烷醇型甾体皂苷元，是ophiopogonin R的苷元结构，并根据HSQC和1H-1H COSY谱的相关信息对氢碳数据进行归属。
在NOESY谱图中，H-8/H3-18,H-12/H3-18,H3-18/H-20和H-16/H3-21的远程相关说明了C-12，C-14和C-17位上的羟基均为α取向，H-20为β取向,B,C和D环为trans-trans骈和，D和E环为cis骈和，H-1β/H3-19,H-1α/H-3,H-1α/H-9说明H-3为α取向。
综上，确定化合物3的结构为12-hydroxy ophiogeni，经检索，该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为ophiopogonoside 3。NMR信号归属见见表1和表2。
甾体皂苷4的结构鉴定数据如下：
白色无定形粉末(CH3OH)。HRESI-MS给出准分子离子峰为m/z 461.3089[M-H]-，分子式为C27H44O4。1H-NMR(400MHz,pyridine-d5)中，高场区可见4个甲基氢信号：δH 0.69(3H,d,J＝5.4Hz,CH 3-27),1.02(3H,s,CH 3-19),1.10(3H,s,CH 3-18),1.20(3H,d,J＝7.0Hz,CH 3-21)。13C-NMR(100MHz,pyridine-d5)谱中共给出27个碳信号，其中包括异螺甾烷型甾体皂苷的螺甾缩酮δC 109.9(C-22)的特征季碳信号，以及除甾体皂苷母核上的δC 82.4(C-16)和67.2(C-26)外的连氧碳信号：δC 87.5(C-14)和71.6(C-3)；根据化合物4的1D NMR数据，可知化合物4为异螺甾烷醇型甾体皂苷苷元，并根据HSQC谱的相关信息对氢碳数据进行归属。
HMBC谱中，δH 1.89(H-2),2.27(H-4α)与δC 71.6(C-3),δH 1.02(CH 3-19)与δC 43.1(C-5),δH 2.05(H-8),2.57(H-9)与δC 22.6(C-7),δH 1.10(CH 3-18)与δC 45.7(C-13),87.5(C-14)的远程相关，进一步提示C-3和C-14位上羟基的取代。
NOESY谱中，δH 1.40(H-5)与δH 1.02(CH 3-19),2.05(H-8)相关,δH 2.05(H-8)与δH1.10(CH 3-18),1.02(CH 3-19)相关，提示CH3-18,CH3-19和H-5,H-8均为β构型，即A/B环为顺势骈合方式，δH 2.11(H-20)与δH 1.10(CH 3-18),相关，提示H-20为β构型。
综上，鉴定化合物4的结构为：(25R)-5β-spirostan-3β,14-diol，经检索，该化合物为首次以天然产物形式分离得到，将其命名为ophiopogonoside 4。
表1.化合物的1-4的1H NMR数据(pyridine-d5,δin ppm,J in Hz)
| No. | 1<sup>a</sup> | 2<sup>b</sup> | 3<sup>b</sup> | 4<sup>a</sup> |
| 1 | 3.17m | 3.17m | 1.82m,1.17m | 1.86m,1.04m |
| 2 | 2.74m,2.47m | 2.74m,2.47m | 2.06m,1.78m | 1.89m |
| 3 | 4.43m | 4.44m | 3.83m | 3.87m |
| 4 | 2.80m,2.67m | 2.67m,2.82m | 2.65m | 2.27m,1.79m |
| 5 | - | - | - | 1.40m |
| 6 | 5.67br.s | 5.68br.s | 5.49br.s | 1.93m,1.32m |
| 7 | 2.23m,1.52m | 2.11m,1.87m | 2.71m,1.88m | 1.39m |
| 8 | 1.61m | 1.56m | 2.16m | 2.01m |
| 9 | 1.62m | 1.57m | 2.07m | 2.57m |
| 10 | - | - | - | - |
| 11 | 2.54m,1.69m | 2.51m,1.67m | 1.58m | 1.49m,1.40m |
| 12 | 1.78m,1.22m | 1.88m,1.19m | 4.49m | 2.27m,1.49m |
| 13 | - | - | - | - |
| 14 | 1.23m | 1.07m | - | - |
| 15 | 2.17m,1.88m | 2.18m,1.53m | 2.47m,1.72m | 2.37m,1.88m |
| 16 | 4.56m | 4.59m | 4.99m | 5.1m |
| 17 | 1.83m | 2.02m | - | 2.83m |
| 18 | 0.94s | 1.08s | 0.99s | 1.10s |
| 19 | 1.35s | 1.35s | 1.10s | 1.02s |
| 20 | 1.99m | 2.67m | 2.39m | 2.11m |
| 21 | 1.14d(7.0) | 1.13d(7.9) | 1.30d(7.0) | 1.20d(7.0) |
| 22 | - | - | - | - |
| 23 | 1.69m | 1.63m,1.54m | 1.75m,1.67m, | 1.73m, |
| 24 | 1.57m | 1.62m | 1.93m | 1.59m |
| 25 | 1.59m | 1.82m | 1.58m | 1.60m |
| 26 | 3.58m,3.49m | 3.62m | 3.45m | 3.53m |
| 27 | 0.69d(5.4) | 0.70d(5.4) | 0.66d(5.5) | 0.69d(5.4) |
a Measured at 400MHz
b Measured at 600MHz
表2.化合物的1-4的13C NMR数据(pyridine-d5,δin ppm)
a Measured at 100MHz
b Measured at 150MHz
实施例2
一类提取于麦冬的甾体皂苷类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：
(1)麦冬干燥根茎1000g用85％乙醇提取4次(每次用量为15L，每次提取4h)，减压回收提取液，得到粗提物；
(2)上述步骤(1)所得乙醇粗提物加水溶解(粗提物和水重量体积比＝1:3)，经D101B大孔树脂吸附(粗提物:大孔树脂重量比＝1:5)，用水，20％乙醇-水(v/v)、50％乙醇-水(v/v)、70％乙醇-水(v/v)和90％乙醇-水(v/v)梯度洗脱，得到不同极性部位的洗脱物；
(3)步骤(2)中所得90％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次用石油醚和丙酮体积比100:15，100：20，3:1，1:1，1:2的混合溶剂洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的石油醚：丙酮3:1～1:2流份经ODS反相柱色谱分离，用体积比为40:60，60:40，80:20，100:0甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)流份经HPLC YMC ODS-A C18制备型色谱柱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝67:33(v/v)，得到甾体皂苷1(tR＝61min)(收率为0.00100％)，得到甾体皂苷2(tR＝78min)(收率为0.00085％)；上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)流份经HPLC YMC ODS-A C18色谱柱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝80:20(v/v)，得到甾体皂苷3(tR＝37min)(收率为0.00060％)，得到甾体皂苷4(tR＝45min)(收率为0.00080％)。
根据甾体皂苷1～4的结构鉴定方法见实施例1。
实施例3
一类提取于麦冬的甾体皂苷类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：
(1)麦冬干燥根茎1200g用95％乙醇提取3次(每次用量为12L，每次提取6h)，减压回收提取液，得到粗提物；
(2)上述步骤(1)所得95％乙醇粗提物加水溶解(粗提物和水重量体积比＝1:5)，经HPD-100大孔树脂吸附(粗提物:大孔树脂重量比＝1:6)，用水、30％乙醇-水(v/v)、50％乙醇-水(v/v)，70％乙醇-水(v/v)和90％乙醇-水(v/v)梯度洗脱，得到不同极性部位的洗脱物；
(3)步骤(2)中所得90％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以二氯甲烷和丙酮体积比为100:4，100:6，100:8，100:10，8:1，6:1，4:1，2:1的混合溶剂洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的二氯甲烷：丙酮100:8～6:1流分经ODS色谱，用20:80，40:60，60:40，80:20甲醇-水的混合溶剂(v/v)梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)流份经HPLC YMC ODS-A C18色谱柱分离制备，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝67:33(v/v)，得到甾体皂苷1(tR＝61min)(收率为0.00100％)，得到甾体皂苷2(tR＝78min)(收率为0.00092％)；上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)流份经HPLC YMC ODS-A C18色谱柱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝80:20(v/v)，得到甾体皂苷3(tR＝37min)(收率为0.00060％)，得到甾体皂苷4(tR＝45min)(收率为0.00065％)。
根据甾体皂苷1～4的结构鉴定方法见实施例1。
实施例4
一类提取于麦冬的甾体皂苷类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：
(1)麦冬干燥根茎500g用70％乙醇提取4次(每次用量为10L，每次提取2h)，减压回收提取液，得到粗提物；
(2)上述步骤(1)所得乙醇粗提物加水溶解(粗提物:水＝重量体积比1:1)，经HPD-100大孔树脂吸附(粗提物:大孔树脂重量比＝1:3)，依次用水，20％乙醇-水(v/v)、50％乙醇-水(v/v)、70％乙醇-水(v/v)和90％乙醇-水(v/v)梯度洗脱，得到不同极性部位的洗脱物；
(3)步骤(2)中所得90％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以氯仿和丙酮体积比为100:4，100:6，100:8，100:10，8:1，6:1，4:1，2:1的混合溶剂洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的氯仿：丙酮100:10～2:1流份经ODS反相柱色谱分离，用50:50，60:40，70:30，80:20，90:10甲醇-水的混合溶剂(v/v)梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)流份经HPLC YMC ODS-A C18色谱柱分离制备，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝67:33(v/v)，得到甾体皂苷1(tR＝61min)(收率为0.00110％)，得到甾体皂苷2(tR＝78min)(收率为0.00090％)；上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)流份经HPLC YMC ODS-A C18色谱柱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝80:20(v/v)，得到甾体皂苷3(tR＝37min)(收率为0.00060％)，得到甾体皂苷4(tR＝45min)(收率为0.00068％)。
根据甾体皂苷1～4的结构鉴定方法见实施例1。
实施例5
一类提取于麦冬的甾体皂苷类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：
(1)麦冬干燥根茎1000g用85％乙醇提取4次(每次用量为15L，每次提取6h)，减压回收提取液，得到粗提物；
(2)上述步骤(1)所得乙醇粗提物加水溶解(粗提物:水＝重量体积比1:1)，经D101B大孔树脂吸附(粗提物:大孔树脂重量比＝1:5)，用水、20％乙醇-水(v/v)、50％乙醇-水(v/v)、70％乙醇-水(v/v)和90％乙醇-水(v/v)梯度洗脱，得到不同极性部位的洗脱物；
(3)步骤(2)中所得90％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以二氯甲烷和丙酮体积比为100:0，100:4，100:6，100:8，100:10，8:1，6:1，4:1，2:1的混合溶剂洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的二氯甲烷：丙酮100:10～2:1流分经ODS反相柱色谱分离，用40:60，60:40，80:20，100:0甲醇-水的混合溶剂(v/v)梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)流份经HPLC YMC ODS-A C18色谱柱分离制备，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝67:33(v/v)，得到甾体皂苷1(tR＝61min)(收率为0.00120％)，得到甾体皂苷2(tR＝78min)(收率为0.00090％)；上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)流份经HPLC YMC ODS-A C18色谱柱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝80:20(v/v)，得到甾体皂苷3(tR＝37min)(收率为0.00056％)，得到甾体皂苷4(tR＝45min)(收率为0.00070％)。
根据甾体皂苷1～4的结构鉴定方法见实施例1。
实施例6
一类提取于麦冬的甾体皂苷类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：
(1)麦冬干燥根茎2000g用70％乙醇提取3次(每次用量为20L，每次提取2h)，减压回收提取液，得到粗提物；
(2)上述步骤(1)所得70％乙醇粗提物加水溶解(粗提物:水重量体积比＝1:1)，经D101大孔树脂吸附(粗提物:大孔树脂＝1:3)，用水，20％甲醇-水(v/v)，50％乙醇-水(v/v)、70％乙醇-水(v/v)和90％乙醇-水(v/v)梯度洗脱，得到不同极性部位的洗脱物；
(3)步骤(2)中所得90％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以二氯甲烷和甲醇体积比为100:0，100:4，100:6，100:8，100:10，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1混合溶剂洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的二氯甲烷：甲醇100:6～4:1流分经ODS反相柱色谱分离，用20:80,40:60，60:40，,80:20，100:0甲醇-水的混合溶剂(v/v)梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)流份经HPLC YMC ODS-A C18色谱分离制备，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝65:35(v/v)，得到甾体皂苷1(tR＝61min)(收率为0.000126％)，得到甾体皂苷2(tR＝78min)(收率为0.00095％)；上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)流份经HPLC YMC ODS-A C18色谱柱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝80:20(v/v)，得到甾体皂苷3(tR＝37min)(收率为0.00054％)，得到甾体皂苷4(tR＝45min)(收率为0.00070％)。
根据甾体皂苷1～4的结构鉴定方法见实施例1。
实施例7
实施例1-6中制备所得甾体皂苷1-8的抗肿瘤活性研究
(1)实验原理
MTT法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50％的N，N-二甲基甲酰胺和20％的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。
(2)实验方法
肺癌细胞NCI-H460使用1640完全培养基(含10％胎牛血清)培养，维持温度37℃，CO2含量为5％。使用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化。
取对数生长期肺癌细胞NCI-H460消化成单细胞悬液，调节细胞浓度为105/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，每组3个平行孔。接种24小时后，细胞贴壁生长，弃上清，按照实验所需浓度加入浓度分别为100μM、50μM、10μM、1μM的受试单体继续培养24小时。24小时后，用MTT法测定细胞生长状况：每孔加入50μL MTT储备液，终浓度为2mg/mL。继续培养4小时后，弃去上清，每孔加DMSO 100μL，10min后用自动酶标仪于490nm测定各孔吸光度A。
(3)实验结果
甾体皂苷类化合物1-4的细胞毒性实验结果见表3。
表3化合物1～4的细胞毒活性
由上述结果可知，实施例1-6中制备得到的甾体皂苷化合物1-4对肺癌细胞NCI-H460细胞系均具有细胞毒性，甾体皂苷化合物4的细胞毒性尤其显著。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (6)
1.一种甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，主要包括如下步骤：
(1)使用乙醇水溶液提取麦冬，回收提取溶剂，得粗提物；
(2)将步骤(1)所得的粗提物加水溶解，上样至大孔吸附树脂色谱柱，梯度洗脱，洗脱液为乙醇-水体积比由0:100梯度增加至90:10的混合溶剂，收集乙醇-水体积比为70:30～95:5的洗脱液；
(3)将步骤(2)所得的洗脱液，上样至硅胶柱色谱柱，梯度洗脱，洗脱液为石油醚和乙酸乙酯体积比由100:0梯度降低到1:5的混合溶剂，或者石油醚和丙酮体积比由100:0梯度降低到1:5的混合溶剂，或者二氯甲烷和丙酮体积比由100:0梯度降低到1:5的混合溶剂，或者氯仿和丙酮体积比由100:0梯度降低到1:5的混合溶剂，或者二氯甲烷和甲醇体积比由100:0梯度降低到1:5的混合溶剂，或者氯仿和甲醇体积比由100:0梯度降低到1:5的混合溶剂，收集体积比为100:6～1:2的洗脱液；
(4)将步骤(3)中所得的洗脱液上样至ODS色谱柱，梯度洗脱，洗脱液为甲醇-水体积比由20:80梯度增加至100:0的混合溶剂或乙腈-水体积比由20:80梯度增加至100:0的混合溶剂，收集甲醇-水体积比为20:80～80:20或乙腈-水体积比为20:80～80:20的洗脱液；
(5)将步骤(4)所得的洗脱液上样到HPLC制备型色谱柱YMC ODS-A C18，用甲醇-水的体积比为50:50～90:10的混合溶剂或者乙腈-水的体积比为20:80～70:30的混合溶剂为流动相进行洗脱，得到甾体皂苷化合物；
所得的甾体皂苷类化合物的结构如下：
2.根据权利要求1所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取为加热回流提取或加热超声提取；所述乙醇水溶液的体积百分比浓度为50％～99％，麦冬与乙醇水溶液的重量体积比为1:5～1:20g/mL。
3.根据权利要求1所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的大孔吸附树脂色谱柱采用水溶解后全拌样的上样方法，具体步骤为将粗提物溶解于水中，粗提物与水的重量体积比为1:1～1:10，得到粗提物的水溶液，加入3～10倍粗提物重量的大孔吸附树脂搅拌均匀，滤干。
4.根据权利要求1所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述洗脱液为石油醚和乙酸乙酯体积比由100:15梯度降低到1:2的混合溶剂，或者石油醚和丙酮体积比由100:15梯度降低到1:2的混合溶剂，或者二氯甲烷和丙酮体积比由100:4梯度降低到2:1的混合溶剂，或者氯仿和丙酮体积比由100:4梯度降低到2:1的混合溶剂，或者二氯甲烷和甲醇体积比由100:0梯度降低到1:1的混合溶剂，或者氯仿和甲醇体积比由100:8梯度降低到1:1的混合溶剂，收集体积比为100:15～4:1的洗脱物。
5.根据权利要求1所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述洗脱液为甲醇-水体积比由40:60梯度增加至90:10的混合溶剂或乙腈-水体积比由40:60梯度增加至80:20的混合溶剂。
6.根据权利要求1所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(5)中使用甲醇-水的体积比为60:40～90:10的混合溶剂或者乙腈-水的体积比为30:70～70:30的混合溶剂为流动相。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110560123.0A CN113336822B (zh) | 2021-05-21 | 2021-05-21 | 麦冬-甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110560123.0A CN113336822B (zh) | 2021-05-21 | 2021-05-21 | 麦冬-甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113336822A CN113336822A (zh) | 2021-09-03 |
| CN113336822B true CN113336822B (zh) | 2022-04-15 |
Family
ID=77470728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110560123.0A Active CN113336822B (zh) | 2021-05-21 | 2021-05-21 | 麦冬-甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113336822B (zh) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101591374B (zh) * | 2009-06-26 | 2011-06-29 | 重庆理工大学 | 一种甾体化合物、其制备方法及含有它们的药物组合物和用途 |
-
2021
- 2021-05-21 CN CN202110560123.0A patent/CN113336822B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113336822A (zh) | 2021-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112300242B (zh) | 一种呋甾皂苷类化合物单体的制备方法 | |
| CN110627861B (zh) | 一种知母甾体皂苷化合物及其制备方法和应用 | |
| CN110452249A (zh) | 新吉玛烷型倍半萜内酯类化合物及其制备和应用 | |
| CN108689851B (zh) | 一类惕各烷型二萜化合物及其制备方法和应用 | |
| CN104774232B (zh) | 雪胆葫芦烷型四环三萜化合物，含有该化合物的药物组合物及其应用 | |
| CN113336822B (zh) | 麦冬-甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN109879921B (zh) | 从知母中分离的具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法 | |
| CN105601693B (zh) | 人参皂苷f1的制备及其抗肿瘤作用 | |
| CN113214214B (zh) | 关苍术中一种萜类化合物的制备方法和应用 | |
| CN105949266A (zh) | 睡茄交酯类化合物及提取方法及应用 | |
| CN111303238B (zh) | 甾体皂苷类化合物及其制备方法和医药用途 | |
| CN112898263B (zh) | 一种从佛手中分离的香豆素骈木脂素化合物及其保肝用途 | |
| CN113336649A (zh) | 麻疯树烷型二萜类化合物及其制备方法和用途 | |
| CN111529515B (zh) | 12,15-二氧-α-蛇床烯在制药中的应用 | |
| CN113372407B (zh) | 甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN115611844B (zh) | 一种从关苍术中分离得到的化合物的制备方法和应用 | |
| CN111303231B (zh) | 甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN105949272A (zh) | 魏察酸浆苦素y及提取方法及用途 | |
| CN105198954B (zh) | 通关藤中c21甾类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN113735922B (zh) | 一种从墨角兰中提取木脂素类或萜类化合物的方法 | |
| CN113336732B (zh) | Abietane型二萜类化合物及其制备方法和用途 | |
| CN115160396B (zh) | 从中华雪胆中提取的具有抗肠炎活性的葫芦烷型四环三萜类化合物及其制备方法与应用 | |
| CN114276339B (zh) | 一种倍半木脂素类化合物及其分离方法和应用 | |
| CN117304032B (zh) | 断节参中一种甾体皂苷元化合物及其制备方法与应用 | |
| CN115141245B (zh) | 从中华雪胆中提取的具有抗乳腺炎活性的葫芦烷型四环三萜类化合物及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |