CN103805581A - β-糖苷酶突变体及其编码基因与其在生产人参皂苷CK中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β-糖苷酶突变体及其编码基因与其在生产人参皂苷CK中的应用。本发明提供的蛋白，命名为lacS-mut，是如下1）的蛋白质：1）由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2）将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-糖苷酶活性的由1）衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明突变野生型β-糖苷酶基因，得到β-糖苷酶突变体，与野生型相比，其在合成人参皂苷CK活力上有显著提高，因此具有较好的工业应用前景。

Description

β-糖苷酶突变体及其编码基因与其在生产人参皂苷CK中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种β-糖苷酶突变体及其编码基因与其在生产人参皂苷CK中的应用。

背景技术

人参是传统的中医药材。据现代药理研究报道，人参具有增强人体免疫力，改善营养、抗衰老和减缓疲劳等功效。人参皂苷CK作为人参的主要有效活性成分之一，更易于被人体吸收，且具有促进恶性肿瘤细胞衰亡、遏制肿瘤扩散或恶化等医疗功效，因此具有极高的生产价值和应用前景。然而，人参皂苷CK在天然的人参提取物中并不存在，而是由其它人参皂苷成分（如人参皂苷Rb₁,Rb₂,Rd,Re和Rg₁等）经由肠道菌代谢转化生成，因此在自然界中含量非常低。人参皂苷的转化过程主要包括将葡萄糖等单糖基团从主体结构水解除去，水解的方法有化学水解法和生物催化反应法等。化学方法虽然转化效率较高，但催化缺乏专一性，从而限制了其广泛的应用。而生物催化反应法，利用酶法实现人参皂苷CK合成的研究比较少，主要是真菌来源的一些酶蛋白的纯化和性质研究，如纯化自Paecilomyces Bainier的葡糖苷酶，纯化自Thermuscaldophilus的葡糖苷酶等被发现有合成人参皂苷CK的活性，但一方面活性较低、转化过程中有中间产物累积；另一方面这些酶的基因序列均无报道，无法实现重组表达。在酶法合成人参皂苷CK的研究当中，不仅转化效率有待提高，而且同时应尽量减少甚至消除中间产物的累积，以最大程度加大人参皂苷CK的产量，降低下游分离纯化工作的难度。

来自硫磺矿硫化叶菌的β-糖苷酶（LacS，β-Glycosidase）已被报道具有合成人参皂苷CK的能力，但转化效率有限，无法满足大规模生产的需求。利用该酶合成CK的优势在于：1、该酶已被重组表达，适于通过蛋白质工程手段进一步提高其催化效率；2、该酶的反应温度较高，热稳定性非常好，有助于在高温生产条件下完成产物合成，提高转化效率，降低生产过程中污染的可能；3、该酶催化合成人参皂苷CK的中间过程已被清楚阐释；4、该酶的晶体结构已被报道，为其进一步改造以及对酶突变体的分析提供了重要的参考信息。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种β-糖苷酶突变体及其编码基因。

本发明提供的蛋白，命名为lacS-mut，是如下1）的蛋白质：

1）由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2）将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-糖苷酶活性的由1）衍生的蛋白质。

上述序列表中的序列4由489个氨基酸组成，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。

上述基因是如下(1）或(2）或(3）的DNA分子：

(1）序列表中序列3所示的DNA分子；

(2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码具有β-糖苷酶活性蛋白的DNA分子；

(3）与（1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有β-糖苷酶活性蛋白的DNA分子。

上述严格条件为在6×SSC，0.5% SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1% SDS和1×SSC,0.1% SDS各洗膜一次。

上述序列3均由1470个核苷酸组成，所述序列3的编码区为自5’末端第1-1470位核苷酸。

含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组载体为将上述蛋白的编码基因***表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体，具体为将序列表中的序列3所示的DNA分子***载体pET28a的NheI和XhoI识别位点间得到的重组载体。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在作为β-糖苷酶中的应用也是本发明保护的范围。

上述蛋白在生产人参皂苷CK中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种生产人参皂苷CK的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）发酵上述重组菌，收集发酵液、离心收集菌体、破碎菌体后离心收集上清液；

2）将所述上清液与人参皂苷底物Rb₁在MC缓冲液中反应，得到人参皂苷CK。

上述方法中，1）所述发酵在IPTG诱导下进行；

2）所述MC缓冲液为pH值为5.5的MC缓冲液；所述pH值为5.5的MC缓冲液具体由终浓度为200mM磷酸氢二钠、终浓度为100mM柠檬酸和水组成。

本发明的实验证明，本发明突变野生型β-糖苷酶基因，得到β-糖苷酶突变体，与野生型相比，其在合成人参皂苷CK活力上有显著提高，因此具有较好的工业应用前景。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、β-糖苷酶突变体及其编码基因的获得

1、β-糖苷酶及其编码基因的获得

提取硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）（ATCC 35091,DSM 1616）的基因组DNA并以其为模板，以5’-atggctagcatgtactcatttccaaatagc-3’(forward)and 5’-gtgctcgagttagtgccttaatggctttac-3’(reverse)为引物进行PCR扩增。PCR扩增条件如下：先95℃预变性4min，然后95℃ 45s，55℃ 30s，72℃ 1min30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

回收上述PCR反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得约1470bp大小的片段。

将上述获得的PCR产物用NheI和XhoI双酶切，酶切产物与经相同酶切的pET28a载体（Novagen公司，编号69864-3）用T4连接酶（购自宝生物公司）16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌MC1061感受态细胞，获得重组菌。

提取重组菌的质粒测序验证，测序分析，该PCR产物的基因命名为lacS，其核苷酸序列为序列表中的序列1，通过比对，其为硫磺矿硫化叶菌的β-糖苷酶lacS的基因，该基因编码的蛋白命名为LacS，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。将含有该PCR产物的质粒命名为pET28a-lacS，该质粒为将序列表中的序列1***pET28a载体的NheI和XhoI双酶切位点间得到的载体。

2、突变得到β-糖苷酶突变体

在β-糖苷酶lacS基因的基础上，利用易错PCR的方法，构建随机突变文库。主要是通过改变PCR扩增体系中锰离子的浓度，提高Taq DNA聚合酶的错配率，从而在基因序列中引入突变。在本研究中，进行一轮突变文库构建，得到突变的PCR产物1和突变的PCR产物2。

将上述突变的PCR产物1和突变的PCR产物2分别NheI和XhoI双酶切，酶切产物分别与经相同酶切的pET28a载体连接，连接产物分别转化BL21（DE3）的感受态细胞中，得到突变文库。筛选重组菌，筛选方法为在无菌操作间用无菌牙签将包含着突变体的单菌落克隆挑入已分装有800 ul LB培养基（胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L,酵母提取物5g/L,添加抗生素卡那霉素至50μg/mL）37℃摇床培养2h后，加入诱导剂IPTG至终浓度0.4mM，在30℃摇床诱导约16h。离心、弃置上清液，收集菌体，冻融法细胞破壁，并加入溶菌酶（10mg/ml,Tris-HCl缓冲液，pH8.0）在37℃反应1h，离心，上清液即为破壁后的粗酶液。以粗酶液和人参皂苷底物Rb₁反应（条件为85℃，pH5.5），以二硝基水杨酸法（DNS法）检测反应副产物还原糖含量，间接体现转化生成人参皂苷CK的能力。

对于生成还原糖较多的重组菌，提取质粒送去测序，结果该质粒中的PCR产物的基因具有序列表中序列3所示的核苷酸，该基因命名为lacS-mut，该基因编码的蛋白命名为lacS-mut，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4。

将上述lacS-mut的氨基酸和核苷酸序列与野生型β-糖苷酶lacS的氨基酸和核苷酸序列相比：

lacS-mut的氨基酸序列（序列4）为将野生型β-糖苷酶lacS的氨基酸序列（序列表中序列2的）自N‘末端起第218位缬氨酸Val突变为甘氨酸Gly，lacS-mut基因的核苷酸序列（序列3）为将野生型β-糖苷酶lacS基因的核苷酸序列（序列表中序列1的）自5‘末端起第652-654位GTT突变为GGT。说明lacS-mut为lacS的突变体。

将含有lacS-mut的质粒命名为pET28a-lacS-mut，该质粒为将序列表中的序列3***pET28a的NheI和XhoI双酶切位点间得到的载体，将含有该质粒的重组菌命名为BL21（DE3）/pET28a-lacS-mut。

上述BL21（DE3）/pET28a-lacS-mut也可以按照如下方法制备：人工合成序列表中序列3，将序列表中序列3所示的DNA分子***pET28a的NheI和XhoI双酶切位点间得到的pET28a-lacS-mut；再将pET28a-lacS-mut导入BL21（DE3）的感受态细胞中，得到BL21（DE3）/pET28a-lacS-mut。

采用同样的方法将质粒pET28a-lacS转入BL21（DE3）的感受态细胞中，得到重组菌BL21（DE3）/pET28a-lacS。

实施例2、lacS-mut具有β-糖苷酶活性

一、β-糖苷酶突变体的获得

1、诱导表达

将上述获得的BL21（DE3）/pET28a-lacS-mut的单菌落接种至含有卡那霉素（终浓度为50μg/ml）的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集发酵液，将发酵液按照1%（体积百分含量）的接种量转接至100ml新鲜的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀达到0.6，再在培养基中加入无菌的IPTG，使IPTG在培养基中的终浓度为0.4mM在30℃进行诱导发酵。16h后结束发酵，将发酵液4000g离心10min收集菌体。

将菌体重悬于50ml浓度为50mM的结合缓冲液（Tris-盐酸，pH值为8、含有300mM NaCl和10mM咪唑），超声破壁（200W,工作3s暂停3s，工作100次），离心（15,700g,4℃,30min）去除细胞碎片，收集上清液。

2、纯化

将上述的上清液经0.22μm滤膜过滤后，用纯化的条件为：

漂洗缓冲液：50 mM pH8 Tris-HCl，300mM NaCl，20 mM 咪唑；

洗脱缓冲液：50 mM pH8 Tris-HCl，300mM NaCl，250 mM 咪唑。

收集流出液，经透析处理（透析液为pH值为5.5的MC缓冲液，其由终浓度为200mM磷酸氢二钠、终浓度为100mM柠檬酸和水组成；透析袋的截留分子量8000-14000）后，得到纯化酶液（突变）。

用酶活测试及SDS-PAGE等方法验证，确认纯化组分的纯度；以Bradford蛋白浓度测定法测试纯化蛋白浓度。

采用同样的方法将重组菌BL21（DE3）/pET28a-lacS进行诱导表达、纯化，得到纯化酶液（野生）。

二、β-糖苷酶活性检测及生产人参皂苷CK中的应用

将10μl上述得到的纯化酶液（突变）、10μl人参皂苷底物Rb₁（pH值为5.5的MC缓冲液，其由终浓度为200mM磷酸氢二钠、终浓度为100mM柠檬酸和水组成），在85℃反应1h时间，反应后真空干燥样品并以甲醇重新溶解，高压液相色谱检测。高压液相色谱检测条件为，C18柱(Waters Symmetry,250mm×4.6mm,5μm)，柱温为35℃，流动相为乙腈。0-20min，70-60%水，30-40%乙腈；2—35min，60-0%水，40-100%乙腈；35-40min，100%乙腈；40-45min，70%水，30%乙腈。流速为1.0ml/min，检测波长为203nm。以纯化酶液（野生）为对照。标准品人参皂苷Rb₁（北京百灵威化学技术有限公司，产品编号ASB-00007190-010）和人参皂苷CK（成都普瑞法科技开发有限公司，产品编号G4038）参照。

结果标准品人参皂苷CK的保留时间为32.402min，纯化酶液（野生）反应后产物和纯化酶液（突变）反应后产物的保留时间分别为32.397min和32.400min；说明得到人参皂苷CK。

纯化酶液（野生）反应后产物中人参皂苷CK的量为0.09g/L/h；

纯化酶液（突变）反应后产物中人参皂苷CK的量为0.24g/L/h。

上述结果表明，突变体生成CK的能力为野生型的2-5倍。

Claims (9)

1.一种蛋白，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-糖苷酶活性由序列4衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下(1）或(2）或(3）的DNA分子：

(1）序列表中序列3所示的DNA分子；

(2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码具有β-糖苷酶活性蛋白的DNA分子；

(3）与（1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有β-糖苷酶活性蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：

所述重组载体为将权利要求1所述蛋白的编码基因***表达载体中，得到表达权利要求1所述蛋白的重组载体。

6.权利要求1所述蛋白在作为β-糖苷酶中的应用。

7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在生产人参皂苷CK中的应用。

8.一种生产人参皂苷CK的方法，包括如下步骤：

1）发酵权利要求4所述重组菌，收集发酵液、离心收集菌体、破碎菌体后离心收集上清液；

2）将所述上清液与人参皂苷底物Rb₁在MC缓冲液中反应，得到人参皂苷CK。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

1）所述发酵在IPTG诱导下进行；

2）所述MC缓冲液为pH值为5.5的MC缓冲液；所述pH值为5.5的MC缓冲液具体由终浓度为200mM磷酸氢二钠、终浓度为100mM柠檬酸和水组成。