CN111235145B - 一种核酸纯化试剂及纯化方法 - Google Patents

一种核酸纯化试剂及纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核酸纯化试剂及纯化方法，属于生物领域。所述的试剂包括：磁珠、DNA结合液、洗涤液和洗脱液；所述的磁珠为硅羟基修饰的磁珠；所述的DNA结合液为盐酸胍、醋酸钠、Triton X‑100；所述的洗涤液包括：试剂1：盐酸胍、醋酸钠、Triton X‑100；试剂2：乙醇、醋酸钠、柠檬酸钠；所述的洗脱液为Tris‑HCl，实施过程中在DNA结合液中加入浓度比为1：1‑5的椰油酰基谷氨酸钠和月桂酰基谷氨酸钠可明显提高纯化效果，本发明中各试剂相互作用明显提高核酸的纯化效率并且纯度高，使分离纯化得率可达98.76％，明显高于现有技术。

Description

一种核酸纯化试剂及纯化方法
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种核酸纯化试剂及用该试剂纯化核酸的方法。
背景技术
随着技术的进步，核酸纯化成为分子生物学研究准备阶段的必备工作。疾病诊断、克隆、测序、扩增、杂交、cDNA分析等实验操作的首要步骤就是纯化出完整、高质量的核酸，否则大量的细胞内组合物(如蛋白、多糖)或裂解液中的某些成分(有机溶剂、金属离子)的存在会阻碍这些分子生物学下游反应的完成。
核酸包括脱氧核糖核酸和核糖核酸两种，在细胞中大多以与蛋白质结合的状态存在。对分离纯化核酸的总体原则为：(1)完整性，为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构使最基本的要求，因为遗传信息全部储存在一级结构中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式；(2)纯度，核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度。
核酸纯化方法主要包括两个步骤：一是裂解，将细胞破碎使核酸释放出来，裂解步骤是核酸纯化的关键环节，裂解过程主要是将细胞破碎，释放出核酸；二是纯化，即量释放出来的核酸和细胞内的其他成分如蛋白质、盐和其他杂质分离开。目前使用广泛的核酸分离纯化方法包括酚-氯仿抽提法和离心柱纯化，该方法具有不环保，操作复杂，难以实现多通量等缺点。因此目前尝试较多的是使用磁性微珠进行纯化。
例如，中国专利申请201810136469.6中公开了一种基于磁珠法的核酸纯化试剂，所述核酸纯化试剂为包括一下质量分数的物质的水溶液：1-5％羧基修饰磁珠、11.78-23.56％氯化钠、10-20％聚乙二醇、0.01-0.05％N-月桂酸肌氨酸钠、0.16-0.79％Tris-HCl、0.5-2％EDTA和0.5-2％吐温20。所述的核酸纯化回收试剂盒包括所述的核酸纯化试剂、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，该发明的核酸纯化试剂以及试剂盒的核酸回收效率高，对微量样品的回收损耗更低，且对于100bp左右或者更小的核酸片段回收效率更好，但是该申请中一次性试剂盒的使用量比较大，会加大实验室垃圾的产生，对环境造成破坏，并且其回纯度依然没满足需求。
又如，中国专利申请201810632454.9中公开了一种PCR纯化试剂即使用该试剂纯化PCR产物的方法，PCR纯化试剂包括DNA结合液和洗脱液，所述的DNA结合液的配方为：3mol/L氯化钠、体积浓度为30％的乙醇；洗脱液的配方为：10mmol/L Tris、HCl、100mmol/LNaCl、1mmol/L EDTA、体积浓度为80％乙醇，Tris、HCl的pH值为8.0。该发明的PCR纯化试剂可以成功用于DNA的纯化而不影响DNA纯化的产量，PCR纯化试剂与再生硅柱一起使用，可以减少一次性商业试剂盒的使用数量，减少实验室垃圾的产生，保护环境，节约社会资源和使用费用，但是该申请对核酸的回收率以及纯度不理想。
因此，开发一种能够有效提高分离纯化效率，提高核酸回收率以及纯度的纯化试剂尤为重要。
发明内容
为解决现有技术中的不足，本发明提供了一种核酸纯化试剂以及用该试剂纯化核酸的方法，该纯化试剂能够快速的对核酸进行纯化分离，其回收率和纯度都明显高于现有纯化试剂。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一方面，本发明公开了一种核酸纯化试剂，所述的试剂包括：磁珠、DNA结合液、洗涤液和洗脱液；
所述的磁珠为硅羟基修饰的磁珠浓度为20-30mg/mL，所述的磁珠的粒径为300-800nm；
所述的DNA结合液为4-8M盐酸胍、0.35-0.45M醋酸钠、1-3％Triton X-100；
所述的洗涤液包括：试剂1：4-8M盐酸胍、0.25-0.35M醋酸钠、1-3％Triton X-100；
试剂2：体积分数为70％的乙醇、0.1-0.2M醋酸钠、10-20mM柠檬酸钠；
所述的洗脱液为5-15mM Tris-HCl。
优选地，所述的磁珠为硅羟基修饰的磁珠浓度为22-28mg/mL，所述的磁珠的粒径为400-600nm；
所述的DNA结合液为5-7M盐酸胍、0.40-0.45M醋酸钠、1.5-2.5％Triton X-100；
所述的洗涤液包括：试剂1：5-7M盐酸胍、0.30-0.35M醋酸钠、1.5-2.5％Triton X-100；
试剂2：体积分数为70％的乙醇、0.15-0.2M醋酸钠、12-18mM柠檬酸钠；
所述的洗脱液为8-12mM Tris-HCl。
再优选地，所述的磁珠为硅羟基修饰的磁珠浓度为25mg/mL，所述的磁珠的粒径为500nm；
所述的DNA结合液为6M盐酸胍、0.40M醋酸钠、2.0％Triton X-100；
所述的洗涤液包括：试剂1：6M盐酸胍、0.30M醋酸钠、2.0％Triton X-100；
试剂2：体积分数为70％的乙醇、0.15M醋酸钠、15mM柠檬酸钠；
所述的洗脱液为10mM Tris-HCl。
所述的醋酸钠的pH值为4.5-5，优选为4.6-4.8，再优选为4.7。
所述的柠檬酸钠的pH值为4.5-5，优选为4.6-4.8，再优选为4.6。
所述的Tris-HCl的pH为8-9，优选为8.5。
优选地，所述的DNA结合液中还含有浓度比为1：1-5的椰油酰基谷氨酸钠和月桂酰基谷氨酸钠；优选为浓度比为1：2-4的椰油酰基谷氨酸钠和月桂酰基谷氨酸钠；再优选为浓度比为1：3的椰油酰基谷氨酸钠和月桂酰基谷氨酸钠。
所述的椰油酰基谷氨酸钠的浓度为0.1-0.3M；所述的月桂酰基谷氨酸钠的浓度为0.3-0.6M。
另一方面，本发明公开了一种核酸纯化方法，包括以下步骤：
(1)磁珠预处理：将硅羟基磁珠微粒摇匀，吸入离心管中，磁分离，弃上清，得到预处理的硅羟基磁珠微粒；
(2)混合：吸取DNA结合液和样品加入步骤(1)得到的预处理后的硅羟基磁珠微粒中，超声混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质A；
(3)取试剂1加入步骤(2)得到的物质A中，超声混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质B，重复此步骤一次，得到物质C；
(4)取试剂2加入步骤(3)得到的物质C中，超声混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质D，重复此步骤一次，得到物质E；
(5)取洗脱液缓慢加入步骤(4)得到的物质E中，静置，保持磁力吸附，弃上清，得到物质F；
(6)取洗脱液加入步骤(5)得到的物质F中，超声混匀，静置后再超声混匀，磁力吸附，吸取上清液溶解冻干beads进行荧光PCR检测。
上述步骤(2)中DNA结合液和样品的体积比为70-90：15-25；
优选地，上述步骤(2)中DNA结合液和样品的体积比为75-85：18-22；
再优选地，上述步骤(2)中DNA结合液和样品的体积比为80：20。
作为一个优选的技术方案，所述的核酸纯化试剂，包括以下组分：磁珠、DNA结合液、洗涤液和洗脱液；
所述的磁珠为硅羟基修饰的磁珠浓度为25mg/mL，所述的磁珠的粒径为500nm；
所述的DNA结合液为6M盐酸胍、0.1M椰油酰基谷氨酸钠、0.3M月桂酰基谷氨酸钠、0.40M醋酸钠pH为4.7、2.0％Triton X-100；
洗涤液包括：试剂1：6M盐酸胍、0.30M醋酸钠pH为4.7、2％Triton X-100；
试剂2：体积分数为70％的乙醇、0.15M醋酸钠pH为4.7、15mM柠檬酸钠pH为4.6；
所述的洗脱液为10mM Tris-HCl pH为8.5。
使用上述纯化试剂进行核酸纯化方法，包括以下步骤：
(1)磁珠预处理：将10μL硅羟基磁珠微粒摇匀，吸入离心管中，磁分离，弃上清，得到预处理的硅羟基磁珠微粒；
(2)混合：吸取80μL DNA结合液和20μL样品加入步骤(1)得到的预处理后的硅羟基磁珠微粒中，超声混匀后静置90s，磁分离，弃上清，得到物质A；
(3)取100μL试剂1加入步骤(2)得到的物质A中，超声混匀后静置90s，磁分离，弃上清，得到物质B，重复此步骤一次，得到物质C；
(4)取100μL试剂2加入步骤(3)得到的物质C中，超声混匀后静置90s，磁分离，弃上清，得到物质D，重复此步骤一次，得到物质E；
(5)取100μL洗脱液缓慢加入步骤(4)得到的物质E中，静置10-20s，保持磁力吸附，弃上清，得到物质F；
(6)取100μL洗脱液加入步骤(5)得到的物质F中，超声混匀，55℃条件下静置3min再超声混匀，磁力吸附，吸取上清液溶解冻干beads进行荧光PCR检测。
本发明还提供了一种使用上述纯化试剂在微流控芯片上进行全自动纯化的方法，包括以下步骤：
(1)取10μL磁珠微粉置于纯化仓中，取一粒PCR beads置于PCR仓中；
(2)吸取混匀的DNA结合液和样品混匀后打入纯化仓，超声混匀，静置后在超声混匀，静置后磁力吸附，将纯化仓中液体吸干；
(3)吸取混匀的试剂1打入纯化仓中，超声混匀，磁力吸附，将纯化仓中液体吸干，重复此步骤一次；
(4)吸取混匀的试剂2打入纯化仓中，超声混匀，磁力吸附，将纯化仓中液体吸干，重复此步骤一次；
(5)将洗脱液缓慢打入纯化仓，静置后吸干纯化仓中液体，将纯化仓周围区域升温加热，洗脱液经加热区域进入纯化仓，超声混匀静置，重复3次后磁力吸附；
(6)将纯化仓中的液体推入PCR仓中，使其注满PCR仓，并进行密封；
(7)根据设定好的程序进行温控循环和荧光采集。
上述步骤(2)中所述的静置时间为40-50s，优选为45s。
上述步骤(5)中所述的第一次静置时间为15-25s，优选为20s。
上述步骤(5)中所述的加热温度为55-60℃，优选为55-56℃。
上述步骤(5)中所述的第二次静置时间为55-65s，优选为60s。
与现有技术相比，本发明的优异效果在于：
(1)本发明使用的磁珠微粒为硅羟基磁珠能够更好的分离纯化核酸，该磁珠与本发明的其他纯化试剂相互作用明显提高核酸的纯化效率并且纯度高，使分离纯化得率可达98.76％，明显高于现有技术。
(2)本发明在实施过程中在DNA结合液中加入浓度比为1：1-5的椰油酰基谷氨酸钠和月桂酰基谷氨酸钠，明显提高了纯化效果。
(3)本发明在实施过程中严格控制磁珠结合液的组分，以及各组分的浓度，并分别使用两种洗涤液对核酸进行分层洗涤纯化，提高了纯化效率，本发明控制样品与DNA结合液的体积比，使其能够更好的纯化分离更小片段的核酸，并能达到对微量浓度样品的高度纯化，达到更好的纯化效果。
附图说明
图1纯化产物荧光扩增曲线图；
图2纯化产物紫外分光光度计定量测试图；
附图标记：A-对照样品荧光扩增曲线，B-实施例3纯化产品荧光扩增曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的远离原理和特征进行描述，所举实例只用于解释办法名，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种核酸纯化试剂：
浓度为20mg/mL粒径为300nm的硅羟基磁珠；
DNA结合液：4M盐酸胍、0.35M醋酸钠pH＝4.5、1％Triton X-100；
洗涤液：试剂1：4M盐酸胍、0.25M醋酸钠pH＝4.5、1％Triton X-100；
试剂2：体积分数为70％的乙醇、0.1M醋酸钠pH＝4.5、10mM柠檬酸钠pH＝4.5；
洗脱液：5mM Tris-HCl pH＝8。
纯化方法：
(1)磁珠预处理：将5μL硅羟基磁珠微粒摇匀，吸入离心管中，磁分离，弃上清，得到预处理的硅羟基磁珠微粒；
(2)混合：吸取70μL DNA结合液和15μL样品加入步骤(1)得到的预处理后的硅羟基磁珠微粒中，超声混匀后静置90s，磁分离，弃上清，得到物质A；
(3)取90μL试剂1加入步骤(2)得到的物质A中，超声混匀后静置90s，磁分离，弃上清，得到物质B，重复此步骤一次，得到物质C；
(4)取90μL试剂2加入步骤(3)得到的物质C中，超声混匀后静置90s，磁分离，弃上清，得到物质D，重复此步骤一次，得到物质E；
(5)取100μL洗脱液缓慢加入步骤(4)得到的物质E中，静置10s，保持磁力吸附，弃上清，得到物质F，；
(6)取100μL洗脱液加入步骤(5)得到的物质F中，超声混匀，55℃条件下静置3min再超声混匀，磁力吸附，吸取上清液溶解冻干beads进行荧光PCR检测。
实施例2
一种核酸纯化试剂：
浓度为30mg/mL粒径为800nm的硅羟基磁珠；
DNA结合液：8M盐酸胍、0.2M椰油酰基谷氨酸钠、0.4M月桂酰基谷氨酸钠、0.45M醋酸钠pH＝5、3％Triton X-100；
洗涤液：试剂1：8M盐酸胍、0.35M醋酸钠pH＝5、3％Triton X-100；
试剂2：体积分数为70％的乙醇、0.2M醋酸钠pH＝5、20mM柠檬酸钠pH＝5；
洗脱液：15mM Tris-HCl pH＝9。
纯化方法：
(1)磁珠预处理：将15μL硅羟基磁珠微粒摇匀，吸入离心管中，磁分离，弃上清，得到预处理的硅羟基磁珠微粒；
(2)混合：吸取90μL DNA结合液和25μL样品加入步骤(1)得到的预处理后的硅羟基磁珠微粒中，超声混匀后静置90s，磁分离，弃上清，得到物质A；
(3)取110μL试剂1加入步骤(2)得到的物质A中，超声混匀后静置90s，磁分离，弃上清，得到物质B，重复此步骤一次，得到物质C；
(4)取110μL试剂2加入步骤(3)得到的物质C中，超声混匀后静置90s，磁分离，弃上清，得到物质D，重复此步骤一次，得到物质E；
(5)取100μL洗脱液缓慢加入步骤(4)得到的物质E中，静置10s，保持磁力吸附，弃上清，得到物质F，；
(6)取100μL洗脱液加入步骤(5)得到的物质F中，超声混匀，55℃条件下静置3min再超声混匀，磁力吸附，吸取上清液溶解冻干beads进行荧光PCR检测。
实施例3
一种核酸纯化试剂：
浓度为25mg/mL粒径为500nm的硅羟基磁珠；
DNA结合液：6M盐酸胍、0.2M椰油酰基谷氨酸钠、0.6M月桂酰基谷氨酸钠、0.40M醋酸钠pH＝4.7、2％Triton X-100；
洗涤液：试剂1：6M盐酸胍、0.30M醋酸钠pH＝4.7、2％Triton X-100；
试剂2：体积分数为70％的乙醇、0.15M醋酸钠pH＝4.7、15mM柠檬酸钠pH＝4.6；
洗脱液：10mM Tris-HCl pH＝8.5。
纯化方法：
(1)磁珠预处理：将10μL硅羟基磁珠微粒摇匀，吸入离心管中，磁分离，弃上清，得到预处理的硅羟基磁珠微粒；
(2)混合：吸取80μL DNA结合液和20μL样品加入步骤(1)得到的预处理后的硅羟基磁珠微粒中，超声混匀后静置90s，磁分离，弃上清，得到物质A；
(3)取100μL试剂1加入步骤(2)得到的物质A中，超声混匀后静置90s，磁分离，弃上清，得到物质B，重复此步骤一次，得到物质C；
(4)取100μL试剂2加入步骤(3)得到的物质C中，超声混匀后静置90s，磁分离，弃上清，得到物质D，重复此步骤一次，得到物质E；
(5)取100μL洗脱液缓慢加入步骤(4)得到的物质E中，静置10-20s，保持磁力吸附，弃上清，得到物质F，；
(6)取100μL洗脱液加入步骤(5)得到的物质F中，超声混匀，55℃条件下静置3min再超声混匀，磁力吸附，吸取上清液溶解冻干beads进行荧光PCR检测。
实施例4
一种核酸纯化试剂：
浓度为20mg/mL粒径为300nm的硅羟基磁珠；
DNA结合液：4M盐酸胍、0.1M椰油酰基谷氨酸钠、0.3M月桂酰基谷氨酸钠、0.35M醋酸钠pH＝4.5、1％Triton X-100；
洗涤液：试剂1：4M盐酸胍、0.25M醋酸钠pH＝4.5、1％Triton X-100；
试剂2：体积分数为70％的乙醇、0.1M醋酸钠pH＝4.5、10mM柠檬酸钠pH＝4.5；
洗脱液：5mM Tris-HCl pH＝8。
纯化方法：
(1)取磁珠微粉置于纯化仓中，取一粒PCR beads置于PCR仓中；
(2)吸取混匀的DNA结合液和样品混匀后打入纯化仓，超声混匀，静置40s后在超声混匀，静置15s后磁力吸附，将纯化仓中液体吸干；
(3)吸取混匀的试剂1打入纯化仓中，超声混匀，磁力吸附，将纯化仓中液体吸干，重复此步骤一次；
(4)吸取混匀的试剂2打入纯化仓中，超声混匀，磁力吸附，将纯化仓中液体吸干，重复此步骤一次；
(5)将洗脱液缓慢打入纯化仓，静置15s后吸干纯化仓中液体，将纯化仓周围区域升温加热，加热温度为55℃,洗脱液经加热区域进入纯化仓，超声混匀静置55s，重复3次后磁力吸附；
(6)将纯化仓中的液体推入PCR仓中，使其注满PCR仓，并进行密封；
(7)根据设定好的程序进行温控循环和荧光采集。
实施例5
一种核酸纯化试剂：
浓度为30mg/mL粒径为800nm的硅羟基磁珠；
DNA结合液：8M盐酸胍、0.2M椰油酰基谷氨酸钠、0.4M月桂酰基谷氨酸钠、0.45M醋酸钠pH＝5、3％Triton X-100；
洗涤液：试剂1：8M盐酸胍、0.35M醋酸钠pH＝5、3％Triton X-100；
试剂2：体积分数为70％的乙醇、0.2M醋酸钠pH＝5、20mM柠檬酸钠pH＝5；
洗脱液：15mM Tris-HCl pH＝9。
纯化方法：
(1)取磁珠微粉置于纯化仓中，取一粒PCR beads置于PCR仓中；
(2)吸取混匀的DNA结合液和样品混匀后打入纯化仓，超声混匀，静置50s后在超声混匀，静置15s后磁力吸附，将纯化仓中液体吸干；
(3)吸取混匀的试剂1打入纯化仓中，超声混匀，磁力吸附，将纯化仓中液体吸干，重复此步骤一次；
(4)吸取混匀的试剂2打入纯化仓中，超声混匀，磁力吸附，将纯化仓中液体吸干，重复此步骤一次；
(5)将洗脱液缓慢打入纯化仓，静置25s后吸干纯化仓中液体，将纯化仓周围区域升温加热，加热温度为60℃,洗脱液经加热区域进入纯化仓，超声混匀静置65s，重复3次后磁力吸附；
(6)将纯化仓中的液体推入PCR仓中，使其注满PCR仓，并进行密封；
(7)根据设定好的程序进行温控循环和荧光采集。
实施例6
一种核酸纯化试剂：
浓度为25mg/mL粒径为500nm的硅羟基磁珠；
DNA结合液：6M盐酸胍、0.2M椰油酰基谷氨酸钠、0.6M月桂酰基谷氨酸钠、0.40M醋酸钠pH＝4.7、2％Triton X-100；
洗涤液：试剂1：6M盐酸胍、0.30M醋酸钠pH＝4.7、2％Triton X-100；
试剂2：体积分数为70％的乙醇、0.15M醋酸钠pH＝4.7、15mM柠檬酸钠pH＝4.6；
洗脱液：10mM Tris-HCl pH＝8.5。
纯化方法：
(1)取磁珠微粉置于纯化仓中，取PCR beads置于PCR仓中；
(2)吸取混匀的DNA结合液和样品混匀后打入纯化仓，超声混匀，静置45s后在超声混匀，静置15s后磁力吸附，将纯化仓中液体吸干；
(3)吸取混匀的试剂1打入纯化仓中，超声混匀，磁力吸附，将纯化仓中液体吸干，重复此步骤一次；
(4)吸取混匀的试剂2打入纯化仓中，超声混匀，磁力吸附，将纯化仓中液体吸干，重复此步骤一次；
(5)将洗脱液缓慢打入纯化仓，静置20s后吸干纯化仓中液体，将纯化仓周围区域升温加热，加热温度为55℃,洗脱液经加热区域进入纯化仓，超声混匀静置60s，重复3次后磁力吸附；
(6)将纯化仓中的液体推入PCR仓中，使其注满PCR仓，并进行密封；
(7)根据设定好的程序进行温控循环和荧光采集。
对比例1
与实施例3的区别在于：仅使用试剂2作为洗涤液，即纯化方法(3)使用试剂2，其他操作与步骤与实施例3相同。
对比例2
与实施例3的区别在于：
DNA结合液：6M盐酸胍、0.2M椰油酰基谷氨酸钠、0.40M醋酸钠pH＝4.7、2％TritonX-100；
其他操作与步骤与实施例3相同。
对比例3
与实施例3的区别在于：
DNA结合液：6M盐酸胍、0.8M椰油酰基谷氨酸钠、0.1M月桂酰基谷氨酸钠、0.40M醋酸钠pH＝4.7、2％Triton X-100；
即椰油酰基谷氨酸钠和月桂酰基谷氨酸钠的浓度比为8：1；其他操作与步骤与实施例3相同。
对比例4
与实施例3的区别在于使用的磁珠为所羧基修饰的磁珠微粒，其他操作与步骤与实施例3相同。
对比例5
与实施例3的区别在于DNA结合液和样品的体积比为50：30，即DNA结合液为100μL、样品为60μL；其他操作与步骤与实施例3相同。
试验例1微量浓度核酸的分离纯化效率检测
检测方法：向浓度为20ng/μL的核酸中加入纯化试剂进行纯化，测定纯化后产物中核酸浓度，计算得出纯化得率，具体检测数据见下表1和表2；同时使用荧光定量PCR仪对纯化产物进行荧光扩增和定量。
表1
Figure BDA0002415697960000111
表2
Figure BDA0002415697960000112
Figure BDA0002415697960000121
根据上表1和表2的检测数据可以明显看出使用本发明实施例1-6提供的纯化试剂对核酸进行纯化，其分离纯化得率均在96％左右，最高可达到98.76％，对比例1使用一种洗涤液进行洗涤其纯化效率降低，对比例2和3改变DNA结合液试剂得种类或浓度比也会在一定程度上影响核酸的纯化率，使核酸纯化得率降低，对比例4改变磁珠的种类也会对得率产生影响使得率降低，对比例6改变DNA结合液和样品的体积比对得率影响最大，由此可知只有使用本发明制备的纯化试剂进行核酸纯化，才能使核酸得纯化得率更高。
试验例2不同长度片段核酸的分离纯化效率检测
检测方法：将片段为120bp和460bp的核酸中加入纯化试剂进行纯化，测定纯化前后产物中核酸浓度，计算得出纯化得率，具体检测数据见下表3和表4；同时使用荧光定量PCR仪对纯化产物进行荧光扩增和定量。
表3
片段(bp) 纯化效率％ 片段(bp) 纯化效率％
实施例1 120 95.58 460 94.83
实施例2 120 97.15 460 95.64
实施例3 120 98.24 460 98.32
实施例4 120 96.46 460 96.15
实施例5 120 96.84 460 96.52
实施例6 120 97.35 460 97.03
表4
Figure BDA0002415697960000122
Figure BDA0002415697960000131
根据上表3和表4的检测数据可以明显看出使用本发明实施例1-6提供的纯化试剂对核酸进行纯化，其分离纯化得率均在95％左右，最高可达到98.32％，对比例1使用一种洗涤液进行洗涤其纯化得率有所降低，对比例2和3改变DNA结合液试剂的种类或浓度比也会在一定程度上影响核酸的纯化率，使核酸纯化效率降低，对比例4改变磁珠的种类也会对纯化效率产生影响使效率降低，对比例6改变DNA结合液和样品的体积比对纯化效率影响最大，由此可知只有使用本发明制备的纯化试剂进行核酸纯化，才能使核酸得纯化得率更高。
本发明对实施例3纯化后的核酸进行荧光扩增检测以及紫外分光光度计定量检测，根据附图1和图2可以看出，纯化后核酸的荧光扩增曲线的趋势与对照组(对照组为高纯度核酸)荧光曲线趋势相同，表明本发明纯化后的核酸纯化效果好，得到的核酸纯度高；经荧光定量PCR仪扩增后，荧光曲线的基线平稳，指数扩增区间较长，利于对比分析，且说明扩增效果良好，产物对PCR过程没有抑制效果，多个样品的荧光曲线重合度较高，样品间差别较小，纯化体系较为稳定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种核酸纯化试剂，其特征在于：所述的试剂包括：磁珠、DNA结合液、洗涤液和洗脱液；
所述的磁珠为硅羟基修饰的磁珠浓度为20-30mg/mL，所述的磁珠的粒径为300-800nm；
所述的DNA结合液为4-8 M 盐酸胍、0.35-0.45 M 醋酸钠pH为4.5-5、1-3% Triton X-100；
所述的洗涤液包括：试剂1：4-8 M 盐酸胍、0.25-0.35 M 醋酸钠pH为4.5-5、1-3%Triton X-100；
试剂2：体积分数为70%的乙醇、0.1-0.2 M 醋酸钠pH为4.5-5、10-20 mM 柠檬酸钠pH为4.5-5；
所述的洗脱液为5-15 mM Tris-HClpH为8-9；
所述的DNA结合液中还含有浓度比为1：1-5的椰油酰基谷氨酸钠和月桂酰基谷氨酸钠；
所述的椰油酰基谷氨酸钠的浓度为0.1-0.3 M；所述的月桂酰基谷氨酸钠的浓度为0.3-0.6 M。
2.根据权利要求1所述的纯化试剂，其特征在于：磁珠、DNA结合液、洗涤液和洗脱液；
所述的磁珠为硅羟基修饰的磁珠浓度为25 mg/mL，所述的磁珠的粒径为500nm；
所述的DNA结合液为6 M 盐酸胍、0.40 M 醋酸钠、2.0% Triton X-100；
所述的洗涤液包括：试剂1：6 M 盐酸胍、0.30 M 醋酸钠、2.0% Triton X-10；
试剂2：体积分数为70%的乙醇、0.15 M 醋酸钠、15 mM 柠檬酸钠；
所述的洗脱液为10 mM Tris-HCl。
3.根据权利要求2所述的纯化试剂，其特征在于：磁珠、DNA结合液、洗涤液和洗脱液；
所述的磁珠为硅羟基修饰的磁珠浓度为25 mg/mL，所述的磁珠的粒径为500 nm；
所述的DNA结合液为6 M 盐酸胍、0.40 M 醋酸钠pH为4.7、2.0% Triton X-100；
所述的洗涤液包括：试剂1：6 M 盐酸胍、0.30 M 醋酸钠pH为4.7、2.0% Triton X-100；
试剂2：体积分数为70%的乙醇、0.15 M 醋酸钠pH为4.7、15 mM 柠檬酸钠pH为4.6；
所述的洗涤液为10 mM Tris-HCl pH为8.5。
4.如权利要求1-3任一项所述的纯化试剂进行核酸纯化的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）磁珠预处理：将硅羟基磁珠微粒摇匀，吸入离心管中，磁分离，弃上清，得到预处理的硅羟基磁珠微粒；
（2）混合：吸取DNA结合液和样品加入步骤（1）得到的预处理后的硅羟基磁珠微粒中，超声混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质A；
（3）取试剂1加入步骤（2）得到的物质A中，超声混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质B，重复此步骤一次，得到物质C；
（4）取试剂2加入步骤（3）得到的物质C中，超声混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质D，重复此步骤一次，得到物质E；
（5）取洗脱液缓慢加入步骤（4）得到的物质E中，静置，保持磁力吸附，弃上清，得到物质F；
（6）取洗脱液加入步骤（5）得到的物质F中，超声混匀，静置后再超声混匀，磁力吸附，吸取上清液溶解冻干beads进行荧光PCR检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（2）中DNA结合液和样品的体积比为70-90：15-25。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（2）中DNA结合液和样品的体积比为80：20。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101613696A (zh) * 2009-08-05 2009-12-30 公安部物证鉴定中心 提取纯化dna的试剂
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101613696A (zh) * 2009-08-05 2009-12-30 公安部物证鉴定中心 提取纯化dna的试剂
CN104232469A (zh) * 2014-09-11 2014-12-24 北京化工大学 基于磁珠的样品处理及核酸自动提取***

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Synthesis and characterization of Fe3O4@SiO2 core-shell magnetic microspheres for extraction of genomic DNA from human whole blood;Li G，et al;《Journal of Nanoscience &Nanotechnology》;20111231;第11卷(第12期);10295-10301 *

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