CN101748116A

CN101748116A - 磁性微粒大量提取dna的方法

Info

Publication number: CN101748116A
Application number: CN200910254440A
Authority: CN
Inventors: 崔亚丽; 南婧; 安德鲁·G·陈; 周瑞民; 李芳�
Original assignee: SHAANXI BEIMEI GENE CO Ltd
Current assignee: SHAANXI BEIMEI GENE CO Ltd; Shaanxi Lifegen Co Ltd
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2009-12-22
Publication date: 2010-06-23

Abstract

本发明涉及纳微米材料的应用领域，具体涉及一种利用磁性微粒从生物样品中大量快速抽提基因组DNA的方法。该方法具体步骤是：(1)裂解生物样品：取一定量血液、组织等生物样品，加入蛋白酶K溶液和浓度为4～6M的盐酸胍裂解液，混匀后于56℃水浴中充***解5～20min；(2)在样品裂解液中加入结合液形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液；(3)将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离；(4)清洗；(5)洗脱：加入洗脱液，使DNA从磁性微粒上洗脱下来，在外加磁场作用下将磁性微粒和洗脱下来的DNA分离，收集上清，即得纯化的DNA。本发明可满足从大样本量中成功提取高纯度的DNA；不需要离心机等大型仪器，操作步骤简便，时间短。

Description

磁性微粒大量提取DNA的方法

技术领域

本发明涉及纳微米材料的应用领域，具体涉及到分子生物学中，利用磁性微粒从生物样品中快速抽提纯化大量基因组DNA。

背景技术

核酸提取是许多分子生物学技术中的关键步骤，由于对纯度、完整性等要求，其提取方法尤为重要。目前，提取DNA的方法多种各样。传统的酚-氯仿液相抽提法，操作繁琐费时，使用溶液具有毒性；而新的固相提取法，较之操作简便，无毒环保。

关于核酸的固相提取法，已报道的方法包括利用硅表面、玻璃、离子交换树脂或者经过修饰的磁珠等特异的吸附DNA。其中，中国专利CN 12430100、CN 101033484A、CN 1706959A、CN 101165182，需要使用离心机等大型仪器，提取过程长；CN 101173274A采用滤器，滤膜等耗材，成本较高。

已有文献报道资料(如：核壳型磁性纳米微球的制备及在核酸提取中的应用，现代生物医学进展，2009，9：470-474)，所提取血液的样品量都在200μl以下。已有的核酸自动提取仪，如欧达科仪MP-120，处理样品容量在20～200μl，百维信Lab-Aid 800处理样品容量在100～1000μl，圆点奈米TANBeadSLA-16/SLA-32容量最大为1000μl。通常情况下，纯化50～500μl全血都可以根据血样体积对原方案等比例缩小或放大，但是当从大量样品(如1～10ml)血液中纯化基因组DNA时简单的等比例扩大会引起操作不便、得率降低、纯度下降等各种问题，而无法满足大量提取DNA的需求。提取组织样品DNA亦存在同样的问题。

发明内容

为了解决背景技术中的上述问题，本发明提供了一种基于具有磁性微粒的核酸纯化技术，可用于从大量样品(包括全血或组织)中提取高纯度DNA的方法，以满足临床诊断、法医学、生命科学及各项研究中的对全基因组的大量需求，该方法不需大型仪器，成本低。

本发明的技术方案：

磁性微粒从生物样本中提取大量DNA的方法，其特殊之处在于：该方法包括以下步骤：

(1)裂解细胞：取1～10ml血液样品(或100～1000mg组织样品)，加入100～5000μl蛋白酶K溶液和1～20ml浓度为4～6M的盐酸胍裂解液，混匀后于20～70℃水浴中充***解5～20min；

(2)形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液：取0.4～6mg经结合液预处理过的磁性微粒，加入到裂解后的细胞液中，振荡混匀，于室温充分结合，形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液；

(3)将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离：将混合溶液磁性分离，弃去上清，将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离出来，收集；

(4)清洗：用2～40ml清洗液清洗收集的磁性微粒-DNA复合物，去除蛋白和其他杂质。

(5)洗脱：在磁性微粒-DNA复合物中加入0.5～5ml洗脱液，让DNA从磁性微粒上洗脱下来，在外加磁场作用下将磁性微粒和洗脱下来的DNA分离，收集上清，上清即为纯化的DNA。

一般情况下，磁性纳米微球用于核酸提取中，每次提取的最佳样品量都在200μl左右。通常，纯化50μl～500μl人全血都可以根据血样体积对原方案等比例缩小或放大，但是当从大量(＞1ml)血液中纯化基因组DNA时简单的等比例扩大会引起操作不便、得率降低、纯度下降等各种问题，而无法满足大量提取DNA的需求。提取组织样品DNA亦存在这样的问题。上述方法通过选用优化的试剂和试剂配比，满足了从1～10ml的血液样本和100～1000mg组织样本中成功提取高纯度的DNA。

上述步骤(1)的血液样品，蛋白酶K溶液和盐酸胍裂解液的体积比为5∶1∶10时，裂解效果最好；上述步骤(1)的组织样品，蛋白酶K溶液和盐酸胍裂解液的比例为：每100mg组织样品加入200μl蛋白酶K和2ml裂解液。蛋白酶K溶液与盐酸胍裂解液量过少，裂解不充分；量过高，成本上升，对裂解效果无显著影响。

上述步骤(1)盐酸胍裂解液的成分是：3～4M GuHCl，0.01～0.02M EDTA，0.01～0.02M NaCl和4～6％TX-100。

步骤(1)水浴反应温度为56℃时效果最好。温度过低，造成蛋白酶K的活性降低；温度过高，酶因变性而失去活性。该体系在选用56℃为裂解温度时，酶的消化作用最强。

上述步骤(4)所用的清洗液可以用乙醇、异丙醇或者异戊醇。

上述步骤(5)所用的洗脱液可以是10mM Tris-HCl、1mM EDTA或者是pH＝8.0的TE溶液，也可以用水来洗脱。

在上面所述的方法中，步骤(2)的磁性微粒需要先经过预处理，预处理的具体方法是：取磁性微粒于离心管中，磁性分离至上清澄清，弃去上清液，再向离心管中加入结合液，吹吸混匀，备用；该结合液是聚乙二醇和盐的混合溶液，其中聚乙二醇的体积百分浓度为10％～15％，盐的浓度为1～5M，盐可以选用氯化钠、氯化锂、氯化钡、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化铯、醋酸钠或醋酸钾。

另一方案是：为了避免RNA影响后续反应，可以在步骤(1)混匀操作前可以先加入与血液样品的体积比为1∶100～1∶2000的RNase A溶液，RNase A溶液的浓度为10mg/ml。

上述RNaseA溶液与样品的体积比为1∶1000最好。

本发明的优点：

1、本发明通过优化的试剂和试剂配比，可满足从1～10ml的血液样本或100～1000mg组织样本中成功提取高纯度的DNA。

2、本专利采用盐酸胍裂解液裂解细胞，不需要分步裂解。从样品中提取到的DNA，电泳条带明亮，得率高，纯度高。

3、不需要离心机等大型仪器，可满足偏远地区即时样本分析的问题，亦避免了离心过程对基因组DNA的破坏。

4、操作步骤简便，时间短，全部过程只需要1个小时左右，大大缩短了提取DNA的时间。

附图说明

图1是实施例的方法纯化的DNA的全波长紫外吸收图。

图2是实施例的方法纯化的DNA的琼脂糖电泳图谱。

具体实施例

以下用实施例对本发明做进一步详细说明，但并不限定本发明的保护范围。

实施例1：

(1)磁性微粒的预处理：用移液器移取1ml的磁性微粒于10ml离心管中。磁性分离直至上清澄清，弃去上清。从磁性分离器上取出离心管，加入3ml结合液(结合液是聚乙二醇和盐的混合溶液，其中聚乙二醇的浓度为10％，盐是浓度为1M的NaCl)，吹吸混匀，备用。

(2)样品裂解：将200μl蛋白酶K溶液加入10ml离心管的管底，依次加入1ml血液样本(或100mg组织样本)、2ml盐酸胍裂解液(盐酸胍裂解液的浓度为4M，成分是：3～4M GuHCl，0.01～0.02M EDTA，0.01～0.02M NaCl和4～6％TX-100)，吹吸混匀，56℃水浴充***解5min。

(3)将步骤(1)预处理后的磁性微粒加入步骤(2)裂解的细胞液中，吹吸混匀，室温静置5min，形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液；将混合溶液磁性分离，弃去上清，将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离出来，收集。

(4)清洗：从磁性分离器上取出离心管，加入4ml清洗液(清洗液用75％的乙醇)，吹吸混匀，磁性分离直至上清澄清，弃上清；从磁性分离器上取出离心管，加入2ml清洗液，吹吸混匀，磁性分离直至上清澄清，弃上清。打开离心管盖并将其置于磁性分离器上，室温晾干5min。

(5)从磁性分离器上取出离心管，向管中加入500μl洗脱液(洗脱液可以是10mM Tris-HCl、1mM EDTA或者是pH＝8.0的TE溶液，也可以用水洗脱)，吹吸混匀，56℃水浴5min；将离心管置于磁性分离器上，磁性分离直至上清澄清，上清液即为纯化得到的DNA，将上清液转移到另一离心管中，上清即为纯化的DNA，可直接用于下游实验或于4℃保存备用。

实施例2：

(1)磁性微粒的预处理：用移液器移取6ml的磁性微粒于50ml离心管中。磁性分离直至上清澄清，弃去上清。从磁性分离器上取出离心管，加入18ml结合液(结合液是聚乙二醇和盐的混合溶液，其中聚乙二醇的浓度为10％，盐是浓度为3M的NaCl)，吹吸混匀，备用。

(2)样品裂解：将1.2ml蛋白酶K溶液加入50ml离心管的管底，依次加入6ml血液样本(或600mg组织样本)、12ml浓度为5M的盐酸胍裂解液，6μl浓度为10mg/ml的RNase A溶液，吹吸混匀，20～70℃水浴10min，在56℃水浴中效果最好。

(4)清洗：从磁性分离器上取出离心管，加入24ml清洗液(清洗液是75％的乙醇)，吹吸混匀，磁性分离直至上清澄清，弃上清；从磁性分离器上取出离心管，加入12ml清洗液，吹吸混匀，磁性分离直至上清澄清，弃上清。打开离心管盖并将其置于磁性分离器上，室温晾干5min。

(5)从磁性分离器上取出离心管，向管中加入3ml洗脱液(洗脱液可以是10mM Tris-HCl、1mM EDTA或者是pH＝8.0的TE溶液，也可以用水洗脱)，吹吸混匀，20～70℃水浴5min，在56℃水浴中效果最好；将离心管置于磁性分离器上，磁性分离直至上清澄清，上清液即为纯化得到的DNA，将上清液转移到另一离心管中，直接用于下游实验或于4℃保存备用。

实施例3：

(1)磁性微粒的预处理：用移液器移取10ml的磁性微粒于50ml离心管中。磁性分离直至上清澄清，弃去上清。从磁性分离器上取出离心管，加入20ml结合液(结合液是聚乙二醇和盐的混合溶液，其中聚乙二醇的浓度为15％，盐是浓度为5M的NaCl)，吹吸混匀，备用。

(2)样品裂解：将2ml蛋白酶K溶液加入50ml离心管的管底，依次加入10ml血液样本(或1000mg组织样本)、20ml盐酸胍裂解液(盐酸胍裂解液的浓度为6M，成分是：3～4M GuHCl，0.01～0.02M EDTA，0.01～0.02M NaCl和4～6％TX-100)，吹吸混匀，56℃水浴充***解20min。

(4)清洗：从磁性分离器上取出离心管，加入40ml清洗液(清洗液为75％的乙醇)，吹吸混匀，磁性分离直至上清澄清，弃上清；从磁性分离器上取出离心管，再加入20ml清洗，吹吸混匀，磁性分离直至上清澄清，弃上清。打开离心管盖并将其置于磁性分离器上，室温晾干5min。

(5)从磁性分离器上取出离心管，向管中加入5ml洗脱液(洗脱液可以是10mM Tris-HCl、1mM EDTA或者是pH＝8.0的TE溶液，也可以用水洗脱)，吹吸混匀，56℃水浴5min；将离心管置于磁性分离器上，磁性分离直至上清澄清，上清液即为纯化得到的DNA，将上清液转移到另一离心管中，上清即为纯化的DNA，可直接用于下游实验或于4℃保存备用。

由上述实施例中的方法纯化得到的DNA的全波长紫外吸收图如图1所示，由图中可以看到DNA特征峰明显，A₂₆₀处明显存在一个波峰，A₃₂₀很小接近0值，且6条曲线几乎重合。DNA的琼脂糖电泳图谱如图2所示，其中M为λDNA/Hind III，1-6均为用本方法提取得到的DNA，从图中可以看到各条带清晰、明亮、无明显拖尾，表明DNA分子完整，纯化过程中几乎没有DNA分子降解。

本发明使用磁性微粒能够从大量样本中提取DNA，可满足从1～10ml的血液样本中成功提取出DNA，亦可满足从100～1000mg的组织样本中成功提取出DNA。采用盐酸胍裂解液从样本中提取到的DNA，其电泳条带明亮，得率高；纯度高，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.7～1.9之间；操作步骤简便，不需要离心机等大型仪器，可满足偏远地区即时血样分析的问题，亦避免了离心过程对基因组DNA的破坏；操作时间短，全部过程只需要1个小时左右，大大缩短了提取DNA的时间。

Claims

1.磁性微粒从生物样品中大量提取DNA的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)裂解样品：取一定量血液或组织样品，加入蛋白酶K溶液和浓度为3～6M的盐酸胍裂解液，混匀后于56℃水浴中充***解5～20min；所述血液样品体积为1～10ml，组织样品为100～1000mg；

(2)形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液：取0.4～6mg磁性微粒与结合液混合，并加入到裂解后的溶液中，振荡混匀，于室温充分结合，形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液；

(4)清洗：分别用2～40ml清洗液清洗收集的磁性微粒-DNA复合物，去除蛋白和其他杂质；所述清洗液为75％乙醇；

(5)洗脱：在磁性微粒-DNA复合物中加入0.5～5ml洗脱液，让DNA从磁性微粒上洗脱下来，在外加磁场作用下将磁性微粒和洗脱下来的DNA分离，收集上清，即为纯化的DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)血液样品，蛋白酶K溶液和盐酸胍裂解液的体积比为5∶1∶10；组织样品，蛋白酶K溶液和盐酸胍裂解液的比例为：每100mg组织样品加入200μl蛋白酶K和2ml裂解液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)盐酸胍裂解液的成分是：3～6M GuHCl，0.01～0.02M EDTA，0.01～0.02M NaCl和4～6％TX-100。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)水浴反应温度为56℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)清洗液是75％的乙醇。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)洗脱液是10mMTris-HCl、1mM EDTA、pH＝8.0的TE溶液或水。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述结合液是聚乙二醇和盐的混合溶液，其中聚乙二醇的体积百分浓度为8％～15％，盐的浓度为1～5M，盐是氯化钠、氯化锂、氯化钡、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化铯、醋酸钠或醋酸钾。

8.根据权利要求1-7任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)混匀操作前加入与样品的体积比为1∶100～1∶2000的RNase A溶液，RNase A溶液的浓度为10mg/ml。