CN101748116A - 磁性微粒大量提取dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纳微米材料的应用领域,具体涉及一种利用磁性微粒从生物样品中大量快速抽提基因组DNA的方法。该方法具体步骤是:(1)裂解生物样品:取一定量血液、组织等生物样品,加入蛋白酶K溶液和浓度为4~6M的盐酸胍裂解液,混匀后于56℃水浴中充***解5~20min;(2)在样品裂解液中加入结合液形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液;(3)将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离;(4)清洗;(5)洗脱:加入洗脱液,使DNA从磁性微粒上洗脱下来,在外加磁场作用下将磁性微粒和洗脱下来的DNA分离,收集上清,即得纯化的DNA。本发明可满足从大样本量中成功提取高纯度的DNA;不需要离心机等大型仪器,操作步骤简便,时间短。
Description
技术领域
本发明涉及纳微米材料的应用领域,具体涉及到分子生物学中,利用磁性微粒从生物样品中快速抽提纯化大量基因组DNA。
背景技术
核酸提取是许多分子生物学技术中的关键步骤,由于对纯度、完整性等要求,其提取方法尤为重要。目前,提取DNA的方法多种各样。传统的酚-氯仿液相抽提法,操作繁琐费时,使用溶液具有毒性;而新的固相提取法,较之操作简便,无毒环保。
关于核酸的固相提取法,已报道的方法包括利用硅表面、玻璃、离子交换树脂或者经过修饰的磁珠等特异的吸附DNA。其中,中国专利CN 12430100、CN 101033484A、CN 1706959A、CN 101165182,需要使用离心机等大型仪器,提取过程长;CN 101173274A采用滤器,滤膜等耗材,成本较高。
已有文献报道资料(如:核壳型磁性纳米微球的制备及在核酸提取中的应用,现代生物医学进展,2009,9:470-474),所提取血液的样品量都在200μl以下。已有的核酸自动提取仪,如欧达科仪MP-120,处理样品容量在20~200μl,百维信Lab-Aid 800处理样品容量在100~1000μl,圆点奈米TANBeadSLA-16/SLA-32容量最大为1000μl。通常情况下,纯化50~500μl全血都可以根据血样体积对原方案等比例缩小或放大,但是当从大量样品(如1~10ml)血液中纯化基因组DNA时简单的等比例扩大会引起操作不便、得率降低、纯度下降等各种问题,而无法满足大量提取DNA的需求。提取组织样品DNA亦存在同样的问题。
发明内容
为了解决背景技术中的上述问题,本发明提供了一种基于具有磁性微粒的核酸纯化技术,可用于从大量样品(包括全血或组织)中提取高纯度DNA的方法,以满足临床诊断、法医学、生命科学及各项研究中的对全基因组的大量需求,该方法不需大型仪器,成本低。
本发明的技术方案:
磁性微粒从生物样本中提取大量DNA的方法,其特殊之处在于:该方法包括以下步骤:
(1)裂解细胞:取1~10ml血液样品(或100~1000mg组织样品),加入100~5000μl蛋白酶K溶液和1~20ml浓度为4~6M的盐酸胍裂解液,混匀后于20~70℃水浴中充***解5~20min;
(2)形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液:取0.4~6mg经结合液预处理过的磁性微粒,加入到裂解后的细胞液中,振荡混匀,于室温充分结合,形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液;
(3)将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离:将混合溶液磁性分离,弃去上清,将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离出来,收集;
(4)清洗:用2~40ml清洗液清洗收集的磁性微粒-DNA复合物,去除蛋白和其他杂质。
(5)洗脱:在磁性微粒-DNA复合物中加入0.5~5ml洗脱液,让DNA从磁性微粒上洗脱下来,在外加磁场作用下将磁性微粒和洗脱下来的DNA分离,收集上清,上清即为纯化的DNA。
一般情况下,磁性纳米微球用于核酸提取中,每次提取的最佳样品量都在200μl左右。通常,纯化50μl~500μl人全血都可以根据血样体积对原方案等比例缩小或放大,但是当从大量(>1ml)血液中纯化基因组DNA时简单的等比例扩大会引起操作不便、得率降低、纯度下降等各种问题,而无法满足大量提取DNA的需求。提取组织样品DNA亦存在这样的问题。上述方法通过选用优化的试剂和试剂配比,满足了从1~10ml的血液样本和100~1000mg组织样本中成功提取高纯度的DNA。
上述步骤(1)的血液样品,蛋白酶K溶液和盐酸胍裂解液的体积比为5∶1∶10时,裂解效果最好;上述步骤(1)的组织样品,蛋白酶K溶液和盐酸胍裂解液的比例为:每100mg组织样品加入200μl蛋白酶K和2ml裂解液。蛋白酶K溶液与盐酸胍裂解液量过少,裂解不充分;量过高,成本上升,对裂解效果无显著影响。
上述步骤(1)盐酸胍裂解液的成分是:3~4M GuHCl,0.01~0.02M EDTA,0.01~0.02M NaCl和4~6%TX-100。
步骤(1)水浴反应温度为56℃时效果最好。温度过低,造成蛋白酶K的活性降低;温度过高,酶因变性而失去活性。该体系在选用56℃为裂解温度时,酶的消化作用最强。
上述步骤(4)所用的清洗液可以用乙醇、异丙醇或者异戊醇。
上述步骤(5)所用的洗脱液可以是10mM Tris-HCl、1mM EDTA或者是pH=8.0的TE溶液,也可以用水来洗脱。
在上面所述的方法中,步骤(2)的磁性微粒需要先经过预处理,预处理的具体方法是:取磁性微粒于离心管中,磁性分离至上清澄清,弃去上清液,再向离心管中加入结合液,吹吸混匀,备用;该结合液是聚乙二醇和盐的混合溶液,其中聚乙二醇的体积百分浓度为10%~15%,盐的浓度为1~5M,盐可以选用氯化钠、氯化锂、氯化钡、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化铯、醋酸钠或醋酸钾。
另一方案是:为了避免RNA影响后续反应,可以在步骤(1)混匀操作前可以先加入与血液样品的体积比为1∶100~1∶2000的RNase A溶液,RNase A溶液的浓度为10mg/ml。
上述RNaseA溶液与样品的体积比为1∶1000最好。
本发明的优点:
1、本发明通过优化的试剂和试剂配比,可满足从1~10ml的血液样本或100~1000mg组织样本中成功提取高纯度的DNA。
2、本专利采用盐酸胍裂解液裂解细胞,不需要分步裂解。从样品中提取到的DNA,电泳条带明亮,得率高,纯度高。
3、不需要离心机等大型仪器,可满足偏远地区即时样本分析的问题,亦避免了离心过程对基因组DNA的破坏。
4、操作步骤简便,时间短,全部过程只需要1个小时左右,大大缩短了提取DNA的时间。
附图说明
图1是实施例的方法纯化的DNA的全波长紫外吸收图。
图2是实施例的方法纯化的DNA的琼脂糖电泳图谱。
具体实施例
以下用实施例对本发明做进一步详细说明,但并不限定本发明的保护范围。
实施例1:
(1)磁性微粒的预处理:用移液器移取1ml的磁性微粒于10ml离心管中。磁性分离直至上清澄清,弃去上清。从磁性分离器上取出离心管,加入3ml结合液(结合液是聚乙二醇和盐的混合溶液,其中聚乙二醇的浓度为10%,盐是浓度为1M的NaCl),吹吸混匀,备用。
(2)样品裂解:将200μl蛋白酶K溶液加入10ml离心管的管底,依次加入1ml血液样本(或100mg组织样本)、2ml盐酸胍裂解液(盐酸胍裂解液的浓度为4M,成分是:3~4M GuHCl,0.01~0.02M EDTA,0.01~0.02M NaCl和4~6%TX-100),吹吸混匀,56℃水浴充***解5min。
(3)将步骤(1)预处理后的磁性微粒加入步骤(2)裂解的细胞液中,吹吸混匀,室温静置5min,形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液;将混合溶液磁性分离,弃去上清,将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离出来,收集。
(4)清洗:从磁性分离器上取出离心管,加入4ml清洗液(清洗液用75%的乙醇),吹吸混匀,磁性分离直至上清澄清,弃上清;从磁性分离器上取出离心管,加入2ml清洗液,吹吸混匀,磁性分离直至上清澄清,弃上清。打开离心管盖并将其置于磁性分离器上,室温晾干5min。
(5)从磁性分离器上取出离心管,向管中加入500μl洗脱液(洗脱液可以是10mM Tris-HCl、1mM EDTA或者是pH=8.0的TE溶液,也可以用水洗脱),吹吸混匀,56℃水浴5min;将离心管置于磁性分离器上,磁性分离直至上清澄清,上清液即为纯化得到的DNA,将上清液转移到另一离心管中,上清即为纯化的DNA,可直接用于下游实验或于4℃保存备用。
实施例2:
(1)磁性微粒的预处理:用移液器移取6ml的磁性微粒于50ml离心管中。磁性分离直至上清澄清,弃去上清。从磁性分离器上取出离心管,加入18ml结合液(结合液是聚乙二醇和盐的混合溶液,其中聚乙二醇的浓度为10%,盐是浓度为3M的NaCl),吹吸混匀,备用。
(2)样品裂解:将1.2ml蛋白酶K溶液加入50ml离心管的管底,依次加入6ml血液样本(或600mg组织样本)、12ml浓度为5M的盐酸胍裂解液,6μl浓度为10mg/ml的RNase A溶液,吹吸混匀,20~70℃水浴10min,在56℃水浴中效果最好。
(3)将步骤(1)预处理后的磁性微粒加入步骤(2)裂解的细胞液中,吹吸混匀,室温静置5min,形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液;将混合溶液磁性分离,弃去上清,将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离出来,收集。
(4)清洗:从磁性分离器上取出离心管,加入24ml清洗液(清洗液是75%的乙醇),吹吸混匀,磁性分离直至上清澄清,弃上清;从磁性分离器上取出离心管,加入12ml清洗液,吹吸混匀,磁性分离直至上清澄清,弃上清。打开离心管盖并将其置于磁性分离器上,室温晾干5min。
(5)从磁性分离器上取出离心管,向管中加入3ml洗脱液(洗脱液可以是10mM Tris-HCl、1mM EDTA或者是pH=8.0的TE溶液,也可以用水洗脱),吹吸混匀,20~70℃水浴5min,在56℃水浴中效果最好;将离心管置于磁性分离器上,磁性分离直至上清澄清,上清液即为纯化得到的DNA,将上清液转移到另一离心管中,直接用于下游实验或于4℃保存备用。
实施例3:
(1)磁性微粒的预处理:用移液器移取10ml的磁性微粒于50ml离心管中。磁性分离直至上清澄清,弃去上清。从磁性分离器上取出离心管,加入20ml结合液(结合液是聚乙二醇和盐的混合溶液,其中聚乙二醇的浓度为15%,盐是浓度为5M的NaCl),吹吸混匀,备用。
(2)样品裂解:将2ml蛋白酶K溶液加入50ml离心管的管底,依次加入10ml血液样本(或1000mg组织样本)、20ml盐酸胍裂解液(盐酸胍裂解液的浓度为6M,成分是:3~4M GuHCl,0.01~0.02M EDTA,0.01~0.02M NaCl和4~6%TX-100),吹吸混匀,56℃水浴充***解20min。
(3)将步骤(1)预处理后的磁性微粒加入步骤(2)裂解的细胞液中,吹吸混匀,室温静置5min,形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液;将混合溶液磁性分离,弃去上清,将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离出来,收集。
(4)清洗:从磁性分离器上取出离心管,加入40ml清洗液(清洗液为75%的乙醇),吹吸混匀,磁性分离直至上清澄清,弃上清;从磁性分离器上取出离心管,再加入20ml清洗,吹吸混匀,磁性分离直至上清澄清,弃上清。打开离心管盖并将其置于磁性分离器上,室温晾干5min。
(5)从磁性分离器上取出离心管,向管中加入5ml洗脱液(洗脱液可以是10mM Tris-HCl、1mM EDTA或者是pH=8.0的TE溶液,也可以用水洗脱),吹吸混匀,56℃水浴5min;将离心管置于磁性分离器上,磁性分离直至上清澄清,上清液即为纯化得到的DNA,将上清液转移到另一离心管中,上清即为纯化的DNA,可直接用于下游实验或于4℃保存备用。
由上述实施例中的方法纯化得到的DNA的全波长紫外吸收图如图1所示,由图中可以看到DNA特征峰明显,A260处明显存在一个波峰,A320很小接近0值,且6条曲线几乎重合。DNA的琼脂糖电泳图谱如图2所示,其中M为λDNA/Hind III,1-6均为用本方法提取得到的DNA,从图中可以看到各条带清晰、明亮、无明显拖尾,表明DNA分子完整,纯化过程中几乎没有DNA分子降解。
本发明使用磁性微粒能够从大量样本中提取DNA,可满足从1~10ml的血液样本中成功提取出DNA,亦可满足从100~1000mg的组织样本中成功提取出DNA。采用盐酸胍裂解液从样本中提取到的DNA,其电泳条带明亮,得率高;纯度高,OD260/OD280在1.7~1.9之间;操作步骤简便,不需要离心机等大型仪器,可满足偏远地区即时血样分析的问题,亦避免了离心过程对基因组DNA的破坏;操作时间短,全部过程只需要1个小时左右,大大缩短了提取DNA的时间。
Claims (8)
1.磁性微粒从生物样品中大量提取DNA的方法,其特征在于:该方法包括以下步骤:
(1)裂解样品:取一定量血液或组织样品,加入蛋白酶K溶液和浓度为3~6M的盐酸胍裂解液,混匀后于56℃水浴中充***解5~20min;所述血液样品体积为1~10ml,组织样品为100~1000mg;
(2)形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液:取0.4~6mg磁性微粒与结合液混合,并加入到裂解后的溶液中,振荡混匀,于室温充分结合,形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液;
(3)将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离:将混合溶液磁性分离,弃去上清,将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离出来,收集;
(4)清洗:分别用2~40ml清洗液清洗收集的磁性微粒-DNA复合物,去除蛋白和其他杂质;所述清洗液为75%乙醇;
(5)洗脱:在磁性微粒-DNA复合物中加入0.5~5ml洗脱液,让DNA从磁性微粒上洗脱下来,在外加磁场作用下将磁性微粒和洗脱下来的DNA分离,收集上清,即为纯化的DNA。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(1)血液样品,蛋白酶K溶液和盐酸胍裂解液的体积比为5∶1∶10;组织样品,蛋白酶K溶液和盐酸胍裂解液的比例为:每100mg组织样品加入200μl蛋白酶K和2ml裂解液。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(1)盐酸胍裂解液的成分是:3~6M GuHCl,0.01~0.02M EDTA,0.01~0.02M NaCl和4~6%TX-100。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(1)水浴反应温度为56℃。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(4)清洗液是75%的乙醇。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(5)洗脱液是10mMTris-HCl、1mM EDTA、pH=8.0的TE溶液或水。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述结合液是聚乙二醇和盐的混合溶液,其中聚乙二醇的体积百分浓度为8%~15%,盐的浓度为1~5M,盐是氯化钠、氯化锂、氯化钡、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化铯、醋酸钠或醋酸钾。
8.根据权利要求1-7任一权利要求所述的方法,其特征在于:所述步骤(1)混匀操作前加入与样品的体积比为1∶100~1∶2000的RNase A溶液,RNase A溶液的浓度为10mg/ml。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20100623 |