CN113960142A - 一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法 - Google Patents
一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法。本发明基于使用回文探针引发的三维自组装DNA纳米结构，结合热稳定连接酶的高保真度和电化学测量的先天优势，设计了一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法，利用该制备方法制得的电化学生物传感器具有设计简单、通用性好、仪器便宜、测定特异性高和灵敏度高的优点。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法。
背景技术
p53基因是重要的肿瘤抑制基因之一，其可以通过编码和表达p53蛋白来介导细胞增殖和凋亡，在预防肿瘤发生中发挥关键的作用。p53基因的碱基突变被认为是人类癌症中常见的遗传学改变。除了肿瘤抑制活性的丧失，突变的p53基因还显示出新的致癌活性，以促进肿瘤的发生、进展、转移和耐药性。癌症患者中该基因的突变已成为临床上有价值的生物标志物，用于早期诊断、预后评估、复发风险评估和潜在治疗目标。因此，对突变p53基因进行高度灵敏可靠的检测对于癌症筛查、预防和治疗至关重要。目前，已经开发了多种用于产生用于疾病相关基因检测的放大信号的技术，例如聚合酶链反应（Polymerase ChainReaction，PCR）、滚动循环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）、链置换扩增（Strand Displacement Amplification，SDA）和切口核酸内切酶信号放大（Nickingenzyme signal amplification，NESA）等。尽管这些技术取得了重大进展，但这些策略有其自身的缺点，阻碍了从试管到临床诊断和其他应用的过渡。例如，PCR 已被认为是一种成熟的核苷酸指数扩增技术，并广泛用于通过扩增分子杂交事件来检测基因。然而，它需要特殊的设备来精确控制温度循环，并面临与目标扩增过程相关的交叉污染风险。类似地，RCA 强烈依赖于相对较长的挂锁，而SDA通常受到皮摩尔至亚皮摩尔水平的测定能力的限制，不支持在没有序列预扩增的情况下直接检测低丰度的目标物种。同时，基于酶促扩增的分析存在容易交叉污染、对环境条件（例如 pH 和温度）变化的内在脆弱性、非特异性催化扩增的假阳性结果和复杂操作的缺点。此外，单碱基错配的靶基因几乎可以无法与野生基因区分开来。为了规避这些限制并提高识别单碱基多态性的能力，迫切需要开发一种简单的无酶信号放大技术来筛选目标基因中存在的点突变。
由于其固有的优势，例如操作简单、成本低、等温扩增效率高和无需酶介导，杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction，HCR）已成为各种生物分析中信号放大的通用工具，其组成元件包括：引发探针和两条可杂交互补并带有粘性末端的发夹型DNA（H1和H2）。若无引发序列存在时，H1和H2可以稳定存在。一旦存在引发探针，发夹H1的二级结构被引发探针打开，H1释放的茎端会将发夹H2的二级结构打开，H2释放的茎端与引发探针的序列相同，又会打开H1的二级结构，H1和H2如此往复循环的被相互打开，最后形成一条含有缺口的双链-链状线***替共聚物。然而，线性HCR的检测灵敏度不足以报告临床应用中与疾病相关的生物标志物。因此，非线性HCR，例如分支HCR、树突HCR和堆积HCR，由于其二次和指数信号放大而引起越来越多的兴趣。然而，非线性HCR通常需要更多不同的DNA发夹来驱动纳米结构的生长，这使得探针设计更加困难，增加了检测成本并需要更长的反应时间才能达到最大。此外，非线性HCR可能涉及更复杂的组装过程，例如去除残留积木的净化步骤。因此，非常需要使用极少量的独特DNA链作为构建块，通过可编程相互作用（例如，回文粘性末端之间的相互作用）组装高阶周期性和紧凑的DNA纳米结构。
对于含有回文片段的核酸，相同类型的链之间的杂交可以在没有任何辅助探针的帮助下通过基于回文的相互作用发生。例如，作为回文片段，我们可以将5'-CCGTACGG-3'与3'-GGCATGCC-5'以3'→5' 方向杂交，产生双链（ds）双链体。通过将回文片段设计成构建块，可以大大简化组装***。回文DNA链适合以可控方式构建不同几何形状明确的DNA纳米结构，包括一维DNA 纳米管、二维DNA 阵列和三维超分子多面体以及可配置的DNA网络和DNA微粒。此外，回文介导的DNA纳米技术允许将可预测的、可编程的DNA结构直接自组装到固体基材的表面上，而无需在同质溶液中进行预构建过程。并且，基于回文的分析***或DNA组件可以提高信号灵敏度和有效载荷能力，因此对生物医学生物分析和药物输送应用具有特别的希望，例如检测疾病相关的生物标志物，各种病理和生理过程中重要遗传调节因子的细胞内成像，体内肿瘤进化的实时监测和作为抗核酸酶药物递送纳米载体的癌症靶向治疗。
基于上述原因，我们基于使用回文探针引发的三维自组装DNA纳米结构，结合热稳定连接酶的高保真度和电化学测量的先天优势（如灵敏度高、操作简单、响应迅速以及与其他信号转导技术的兼容性好），设计了一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法。利用该制备方法制得的超灵敏电化学检测生物传感器通过将基于连接的表面功能化与回文介导的HCR相结合，能够进行双信号放大，以超灵敏区分基因点突变。在该电化学生物传感器的表面上，触发探针（TP）的靶介导固定仅从两个发夹DNA构建块激活三维DNA纳米片（3D SDN）的自组装。自组装的3D SDN材料具有高负载能力，可容纳大量电化学指示剂亚甲蓝（MB）并产生强电化学信号。利用基于3D SDN的电化学生物传感器，可以检测较低浓度的靶标DNA，线性响应范围宽，即使在复杂的生物环境下（例如胎牛血清和细胞匀浆中），也可以轻松区分具有单点突变的突变基因与野生型基因。因具有设计简单、通用性好、仪器便宜、测定特异性和灵敏度高的优点，基于回文探针引发的三维自组装DNA纳米结构所构建的回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器有望为早期临床诊断和医学研究所需的点突变分析提供潜在平台，同时也为筛选遗传多态性以实施癌症诊断、预后和精确治疗提供了替代工具。
发明内容
本发明的目的在于基于仅由两类回文DNA发夹探针制备3D SDNA三维纳米片的组装技术，而提供一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将裸金电极用氧化铝抛光粉打磨至表面光洁，在去离子水中超声洗涤，将洗涤后的金电极浸入新配置的Piranha溶液中以消除有机污染，再用去离子水对金电极进行清洗，室温晾干，即得预处理后的金电极；在预处理后的金电极表面滴加10 μL 1 μM的硫醇化捕获探针以完全覆盖金电极工作界面，并在室温下、水饱和的气氛中孵育12 h，随后使用超纯水洗涤金电极，然后采用6-巯基-1-己醇封闭电极表面非特异性吸附位点，即得探针修饰的工作电极；
（2）将10 μL目标探针滴加到步骤（1）所得的探针修饰的工作电极的表面，并在室温下孵育1 h，随后将工作电极置于0.1 M pH7.4 PBS缓冲液中搅拌清洗；在洗涤后的电极表面继续滴加10 μL 1 μM的触发探针并在室温下孵育1 h，然后将工作电极置于0.1 MpH7.4 PBS缓冲液中搅拌清洗；在洗涤后的工作电极表面滴加10 μL 10 U的Taq DNALigase，在室温下反应2 h；反应结束后，将工作电极在95℃热水中浸泡5 min以热释放目标DNA，然后转移到另一管相同温度的水中，然后逐渐冷却至室温；目标DNA杂交-连接-热释放的过程共进行三次；
（3）将10 μL 1 μM的回文探针1与等量等浓度的回文探针2混合均匀并滴在步骤（2）处理好的工作电极表面，然后在室温下孵育2 h；孵育结束后，使用0.1 M pH7.4 PBS缓冲液洗涤工作电极，接着将亚甲蓝滴加到工作电极表面并在室温下孵育40 min，即获得待测的工作电极；
（4）使用0.1 M pH7.4 PBS缓冲液洗涤待测工作电极，然后以饱和甘汞电极作为参比电极，以铂丝作为辅助电极，组成三电极体系，并将三电极体系置于工作溶液中，在电化学工作站上做循环伏安扫描，收集产生的电化学信号。
上述制备方法中，所述回文探针1核苷酸序列为：5’-CCGTACGGTTTCGTCGTGCAGCAGCAGCAGCAGCAACGGCTTGCTGCTGCTGCTGCTGC-3’，
所述回文探针2核苷酸序列为：5’-TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGCCGTTTTGATCGATC-3’。
上述制备方法中，所述目标探针核苷酸序列为：5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’、5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCtTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’、 5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCcTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’、
5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCaTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’、
5’-GGAACAGCTTTtAGGTGCaTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’、
5’-GGAACAGCTTTtAGGTGCaTGTTTGTtCCTGTCCTGGG-3’、
5’-GGAACAGCTTTtAGtTGCaTGTTTGTtCCTGTCCTGGG-3’中的任意一种时，
所述硫醇化捕获探针核苷酸序列为：5’-P-CGCACCTCAAAGCTGTTCCTTTTTTTTTT-SH-3’，
所述触发探针核苷酸序列为：5’-TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGCCCAGGACAGGCACAAACA-3’。
上述制备方法中，所述目标探针核苷酸序列为：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCC-3’时，
所述硫醇化捕获探针核苷酸序列为：5’-P-CCAGCTCCAACTACCACAATTTTTTTTTT–SH-3’，
所述触发探针核苷酸序列为：5’-TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGGGCACTCTTGCCTACGCCA-3’。
一种利用上述制备方法制得的回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器。
通过改变上述制备方法中捕获探针、目标探针和触发探针的序列，从而能够构建用于特异性地检测与目标探针所对应的基因的点突变的通用电化学生物传感器。
本发明的发明原理如下：
首先，具有 5'-PO3 部分的捕获探针（CP）通过Au-S键相互作用固定在打磨好的金电极表面，电极表面剩余的裸露区域用6-巯基-1-己醇（MCH）进行封闭。随后，在金电极传感表面在目标探针、触发探针（TP）和热稳定连接酶的混合物中孵育，然后重复退火处理步骤并通过热水浸泡洗涤。为了筛选点突变，CP和TP 被设计为与目标探针完全互补，它们之间的杂交可以形成典型的三明治三链体，其中切口位于可能致癌的点突变附近。因此，只有当目标探针存在并且三链体中没有错配的碱基对时，TP才能连接到CP并在洗涤步骤中保留在电极表面上。其他核酸探针，包括杂交的目标链，都会从电极表面被热洗掉。当暴露于两个亚稳态发夹DNA探针（HP1和HP2）时，表面限制的TP会启动回文介导的HCR（p-HCR）过程，从而实现三维DNA纳米片（3D SDNA）的自组装。众所周知，亚甲蓝(MB)是一种氧化还原活性指示剂，可以通过与鸟嘌呤相互作用或***双链而积聚在电极表面，并且表面固定的DNA材料可以介导电荷MB的运输。因此，在用MB溶液处理3D SDNA组装电极后，能够检测到增强的电化学信号。
由于HP1和HP2之间的相互作用被它们的茎部分锁住，短回文片段无法促进HP1/HP1或HP2/HP2稳定杂种的形成，因此HP1和HP2在溶液中分别稳定存在。一旦遇到TP探针，HP1就会通过杂交打开，释放出与HP2互补的24碱基片段。这样，亚稳态HP2打开，又打开了下一个HP1，从而打破了两个发夹探针的亚稳态，激活了HCR反应。HP1和HP2在水平方向交替排列，形成一条长长的连续ds DNA线（L-HCR产物），其中回文片段以规则重复的方式排列。排列在相邻L-HCR产物上的相同回文末端可以相互作用，导致不同 L-HCR 之间在不同方向上发生横向交联，并在电极上产生交织的3D（而不是2D）SDNA结构表面。整个杂交过程称为回文介导的杂交链反应（p-HCR），在此过程中只涉及两个发夹DNA构建块。
本发明的优点在于：
本发明基于回文探针引发的三维自组装DNA纳米结构设计了一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法，利用该方法制得的回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器具有以下几个优点：
（1）用粘性末端介导的三维核酸纳米组装技术，仅由两类发夹DNA短序列就可以自组装出3D SDNA纳米片。
（2）该回文核酸纳米片构建的电化学生物传感器具有较好的检测性能。首先，该电化学传感器使用MB分子来嵌入由回文探针引发的三维自组装DNA纳米结构中进行信号输出，这比传统的依靠核酸探针构型变化的电信号传导方法具有更低的检测背景信号；其次，触发探针可以引发二个回文发卡交替打开并产生回文介导的杂交链反应，使得3D SDNA纳米结构最终形成，这一现象表示一个靶标分子可以引入多个信号响应分子，从而提高了该电化学生物传感器的检测灵敏度。
（3）该回文核酸纳米片构建的电化学生物传感器可以准确识别目标基因的点突变。利用Taq DNA Ligase的高保真特性，该电化学生物传感器具有单核苷酸点突变区分能力。
（4）该回文核酸纳米片构建的电化学生物传感器能够在复杂的生物环境下（例如胎牛血清和细胞匀浆中），也可以保持优异的检测性能和选择性。
附图说明
图1：实施例1中基于回文探针引发的三维自组装DNA纳米结构的回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器构建流程图。
图2：实施例1中在表面限制的TP触发作用下形成三维DNA回文核酸纳米片的示意图。
图3：实施例1中回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器中回文核酸纳米片材料表征图。其中3A为回文核酸纳米片的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：泳道M代表DNA标准条带；泳道1为回文探针1（HP1）；泳道2为回文探针2（HP2）；泳道3为回文探针1与回文探针2的混合物；泳道4 为回文探针1与回文探针2的混合物，且加入了p53基因相关的触发探针（TP）。3B为最终的三维自组装DNA纳米结构——回文核酸纳米片的原子力表征图像。
图4：实施例2中回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的检测性能分析及实施例3中回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的单核苷酸点突变区分能力分析。其中4A为实施例2中回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的可行性分析数据，黑色虚线为目标探针p53 DNA不存在时的电化学生物传感器检测信号，红色虚线为目标探针p53 DNA存在时的电化学传感器检测信号，红色实线为背景信号。4B为实施例2中不同浓度目标探针p53DNA的电化学生物传感器检测信号。4C为实施例2中电化学生物传感器检测信号与目标探针p53 DNA浓度的线性关系。4D为实施例3中回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器检测p53基因中发生的单核苷酸点突变区分能力，其中红色为野生型目标探针p53 DNA，将其扣除背景的检测信号定义为100%，绿色、蓝色和青色为单碱基突变探针（绿色为T碱基突变，蓝色为C碱基突变，青色为A碱基突变），紫色为二碱基突变探针，黄色为三碱基突变探针，咖喱色为四碱基突变探针。
图5：实施例4和实施例5中回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器在复杂生物环境下的检测性能分析。其中5A为回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器在FBS（胎牛血清）中的检测性能分析，空白柱为人为实际添加的目标探针的浓度，斜线柱为回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器检测出来的目标探针浓度。5B为回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器在细胞匀浆中的检测性能分析，空白柱为人为实际添加的目标探针的浓度，斜线柱为回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器检测出来的目标探针浓度。
图6：实施例6中回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的通用性评估。其中6A为使用回文探针引发的三维自组装DNA纳米结构用于KRAS基因的回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器示意图。6B为回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器用于KRAS基因检测的可行性分析数据。黑色虚线为目标探针不存在时的电化学生物传感器检测信号，红色虚线为目标探针存在时的电化学传感器检测信号。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1
本实施例基于回文探针引发的三维自组装DNA纳米结构的回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的构建流程图见图1；在表面限制的TP触发作用下形成3D SDNA三维回文核酸纳米片的示意图见图2。
一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将直径为2 mm的裸金电极用粒径为0.05 μm的氧化铝抛光粉打磨5 min，使其表面光洁，然后把打磨好的金电极置于去离子水中超声洗涤5 min，随后将洗涤后的金电极置于新配置的Piranha溶液（Piranha溶液中H2SO4与H2O2的体积比为3:1）中浸泡10 min以消除有机污染，然后使用去离子水对电极进行清洗，置于室温下进行干燥，即得预处理后的金电极；在预处理后的金电极表面滴加10 μL 1 μM硫醇化捕获探针（CP）以完全覆盖金电极工作界面，为了使CP探针与金电极表面充分结合且防止界面水分蒸发变干，将滴加CP探针的金电极在室温下、水饱和的气氛中孵育12 h，随后使用超纯水洗涤金电极，然后将20 μL 1mM 6-巯基-1-己醇（MCH）滴加在电极表面孵育10 min以封闭电极表面非特异性吸附位点，即得探针修饰的工作电极。
其中，所述CP探针核苷酸序列为：5’-P-CGCACCTCAAAGCTGTTCCTTTTTTTTTT-SH-3’。
（2）将10 μL目标探针p53 DNA滴加到步骤（1）所得的探针修饰的工作电极的表面，在室温下孵育1 h，随后将工作电极置于0.1 M PBS缓冲液（pH =7.4）中搅拌清洗；在洗涤后的工作电极表面继续滴加10 μL 1 μM的触发探针（TP）并在室温下孵育1 h，然后继续将工作电极置于0.1 M PBS缓冲液（pH =7.4）中搅拌清洗；在洗涤后的工作电极表面滴加10 μLTaq DNA Ligase (10 U)，在室温下反应2 h；反应结束后，将工作电极在热水（95℃）中浸泡5 min以热释放目标 DNA，然后转移到另一管相同温度的水中，然后逐渐冷却至室温；目标DNA杂交-连接-热释放的过程共进行三次。
其中，所述目标探针p53 DNA核苷酸序列为：
5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’。
所述TP探针核苷酸序列为：
5’-TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGCCCAGGACAGGCACAAACA-3’。
（3）将 10 μL 1 μM的回文探针1（HP1）与等量等浓度的回文探针2（HP2）混合均匀并滴加在步骤（2）处理好的工作电极表面，然后在室温下孵育2 h以进行基于p-HCR的三维DNA纳米材料自组装；为了去除电极表面游离的核酸探针，使用0.1 M PBS缓冲液（pH=7.4）洗涤工作电极，接着将10 μL 1 mM 亚甲蓝（MB）滴加到工作电极表面并在室温下孵育40min，即获得待测的工作电极。
（4）使用0.1 M PBS缓冲液（pH =7.4）洗涤待测工作电极，并以铂丝作为辅助电极、以饱和甘汞电极作为参比电极组成常规三电极***，使用电化学工作站收集产生的电化学信号（所有电化学测量均在 CHI660D 电化学工作站上进行；差分脉冲伏安测量在-0.4 V至0.1 V范围内进行，脉冲幅度为50 mV，脉冲宽度为1.1 s，脉冲周期为0.5 s；使用含有0.5 MKCl的1 mM Fe(CN)6 3-/4- 溶液作为工作溶液，在0.1 Hz至10 kHz 的频率范围内进行电化学阻抗谱测量，同时循环伏安以 0.1 mV/s 的扫描速率从-0.2 V到0.6 V进行测量）。
其中，所述HP1核苷酸序列为：5’-CCGTACGGTTTCGTCGTGCAGCAGCAGCAGCAGCAACGGCTTGCTGCTGCTGCTGCTGC-3’。
所述HP2核苷酸序列为： 5’-TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGCCGTTTTGATCGATC-3’。
图3A为回文核酸纳米片的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图，其中泳道M代表DNA标准条带；泳道1为回文探针1（HP1）；泳道2为回文探针2（HP2）；泳道3为回文探针1与回文探针2的混合物；泳道4 为回文探针1与回文探针2的混合物，且加入了p53基因相关的触发探针（TP）。从图3A中可以看出，当不存在目标序列时，对应的回文探针1（HP1）和回文探针2（HP2）都处于相对稳定的单体状态（泳道1-3）；当存在触发探针时，DNA的凝胶电泳迁移速率发生显著变化，产生了不同条带的组装产品，表明触发探针可以触发三维DNA纳米材料的组装。
图3B为最终的三维自组装DNA纳米结构——回文核酸纳米片的原子力表征图像。使用原子力显微镜对最终形成的回文核酸纳米片结构进行结构形态表征，结构如图3B所示，可以看出最终形成的回文核酸纳米片结构为椭圆形，该结构具有宽度和高度，证明了通过HP1和HP2两条回文序列可以形成三维的纳米片结构。
实施例2
仅改变目标探针p53 DNA的浓度，参照实施例1的方法构建回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器，使用电化学工作站对所构建的回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的电化学信号进行检测。
图4A为该回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的可行性分析实验。黑色虚线为目标探针p53 DNA不存在时的电化学生物传感器检测信号，红色虚线为目标探针p53 DNA存在时的电化学传感器检测信号，红色实线为背景信号。从4A中可以看出，当存在目标探针p53 DNA时，该电化学生物传感器产生明显的电化学信号，远远区分于背景信号（黑色虚线）和目标探针不存在的电化学信号。
图4B为不同浓度目标探针p53 DNA条件下的电化学生物传感器检测信号，可以看出，电化学信号随着目标探针p53 DNA 浓度在10 fM到10 nM范围内的增加而逐渐增加，表明更多的目标物种确实可以自组装成更多的三维DNA纳米材料结构，并可以吸附更多的氧化还原分子（MB）在电极表面。此外，峰值电流与目标探针浓度的对数之间实现了良好的线性关系（图4C）。
实施例3
仅改变目标探针p53 DNA的序列，参照实施例1的方法构建回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器，使用电化学工作站对所构建的回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的电化学信号进行检测。
所使用的DNA链如下：
T碱基突变探针核苷酸序列为：5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCtTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’；
C碱基突变探针核苷酸序列为：5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCcTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’；
A碱基突变探针核苷酸序列为：5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCaTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’；
二碱基突变探针核苷酸序列为：5’-GGAACAGCTTTtAGGTGCaTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’；
三碱基突变探针核苷酸序列为：5’-GGAACAGCTTTtAGGTGCaTGTTTGTtCCTGTCCTGGG-3’；
四碱基突变探针核苷酸序列为：5’-GGAACAGCTTTtAGtTGCaTGTTTGTtCCTGTCCTGGG-3’。
图4D为相应的回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器对单核苷酸点突变区分能力分析数据。其中红色为野生型目标探针p53 DNA（该目标探针p53 DNA序列与实施例1中相同），将其扣除背景的检测信号定义为100%，绿色、蓝色和青色为单碱基突变（绿色为T碱基突变，蓝色为C碱基突变，青色为A碱基突变），紫色为两个碱基突变，黄色为三个碱基突变，咖喱色为四个碱基突变。
相对电流响应 (Rc) 的计算公式如下： Rc (Ct-Cb)/(Cw-Cb)×100%，其中Cw、Ct和Cb分别对应于野生型目标探针p53 DNA、突变型目标探针和空白样品的峰值电流。从图中可以看出，未突变的目标探针p53 DNA诱导的电化学信号明显高于其余突变型目标探针诱导的电化学信号。具体而言，将野生型目标探针p53 DNA上的信号定义为100%，则所有其他突变型目标探针引起的相对电流响应低于10%。这一系列数据表明所构建的使用回文探针引发的三维自组装DNA纳米结构可用于p53基因点突变的检测，且具有单核苷酸点突变区分能力。
实施例4
首先将不同浓度的目标探针p53 DNA序列加入2 mL10%（v/v）胎牛血清中并充分混合（目标探针终浓度分别为1 pM，10 pM，100 pM和1000 pM），然后参照实施例1的方法构建回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器，并使用电化学工作站检测电化学信号进行，只是将10 μL的目标探针p53 DNA序列替换为前述胎牛血清与目标探针p53 DNA序列的混合物。
图5A为对应的为回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器在FBS中的检测性能分析，空白柱为人为实际添加的目标探针浓度，斜线柱为回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器检测出来的目标探针浓度。从图中可以看出，回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器检测出来的p53目标探针浓度与人为实际添加的目标探针的浓度基本保持一致，这表明了回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器能够应用于复杂的生物环境中检测。
实施例5
L02肝细胞培养于5 mL含体积分数10%胎牛血清和100 IU/mL青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640培养基中，置于37℃、体积分数5％CO2及95%相对湿度的二氧化碳细胞培养箱内培养24 h；将L02肝细胞（1.0×107个）在 25℃、3000 rpm下离心3分钟以去除上清液，然后将沉淀物重新悬浮在2 mL的RIPA裂解缓冲液（购自上海生工生物工程股份有限公司）中，在室温下孵育10分钟后，即得到L02肝细胞匀浆；立即将不同浓度的p53 DNA目标探针序列加入2 mL细胞匀浆中并充分混合（目标探针终浓度分别为1 pM，10 pM，100 pM和1000 pM），然后参照实施例1的方法构建回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器，并使用电化学工作站检测电化学信号进行，只是将10 μL的目标探针p53 DNA序列替换为前述细胞匀浆与目标探针p53 DNA序列的混合物。
图5B为回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器在细胞匀浆中的检测性能分析。空白柱为人为实际添加的p53目标探针，斜线柱为回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器检测出来的目标探针浓度。从图中可以看出，回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器检测出来的p53目标探针浓度与人为实际添加的目标探针的浓度基本保持一致，这表明了回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器能够应用于复杂的生物环境中检测。
实施例6
仅改变捕获探针、目标探针和触发探针的序列，参照实施例1的方法构建回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器，使用电化学工作站对所构建的超灵敏电化学传感器的电化学信号进行检测。
所使用的DNA链如下：
KRAS捕获探针核苷酸序列为：5’-P’-CCAGCTCCAACTACCACAATTTTTTTTTT–SH-3’；
Target KRAS目标探针核苷酸序列为： 5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCC-3’；
KRAS触发探针核苷酸序列为：5’-TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGGGCACTCTTGCCTACGCCA-3’。
图6A为使用回文探针引发的三维自组装DNA纳米结构的回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的构建示意图。图6B展示了回文核酸纳米片超灵敏生物电化学传感器对KRAS基因的检测可行性，可以从图中看出，Target KARS目标探针存在时，该电化学生物传感器展示出了理想的检测性能。通过这一数据分析，表明只需要改变触发探针和捕获探针就可以构建得到可检测不同目标基因的回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器，证明本发明提供的回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器具有较好的通用性和应用潜力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgcacctcaa agctgttcct ttttttttt 29
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaacagctt tgaggtgcgt gtttgtgcct gtcctggg 38
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgctgctgct gctgctgcac gacgcccagg acaggcacaa aca 43
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgtacggtt tcgtcgtgca gcagcagcag cagcaacggc ttgctgctgc tgctgctgc 59
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgctgctgct gctgctgcac gacggcagca gcagcagcag caagccgttt tgatcgatc 59
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggaacagctt tgaggtgctt gtttgtgcct gtcctggg 38
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggaacagctt tgaggtgcct gtttgtgcct gtcctggg 38
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggaacagctt tgaggtgcat gtttgtgcct gtcctggg 38
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggaacagctt ttaggtgcat gtttgtgcct gtcctggg 38
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggaacagctt ttaggtgcat gtttgttcct gtcctggg 38
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggaacagctt ttagttgcat gtttgttcct gtcctggg 38
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccagctccaa ctaccacaat ttttttttt 29
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttgtggtagt tggagctggt ggcgtaggca agagtgcc 38
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tgctgctgct gctgctgcac gacgggcact cttgcctacg cca 43
Claims (5)
1.一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将裸金电极用氧化铝抛光粉打磨至表面光洁，在去离子水中超声洗涤，将洗涤后的金电极浸入新配置的Piranha溶液中以消除有机污染，再使用去离子水对金电极进行清洗，室温晾干，即得预处理后的金电极；在预处理后的金电极表面滴加10 μL 1 μM的硫醇化捕获探针以完全覆盖金电极工作界面，并在室温下、水饱和的气氛中孵育12 h，再用超纯水洗涤金电极，然后采用6-巯基-1-己醇封闭电极表面非特异性吸附位点，即得探针修饰的工作电极；
2）将10 μL目标探针滴加到步骤（1）所得的探针修饰的工作电极的表面，并在室温下孵育1 h，随后将工作电极置于0.1 M pH7.4 PBS缓冲液中搅拌清洗；在洗涤后的电极表面继续滴加10 μL 1 μM的触发探针并在室温下孵育1 h，再将工作电极置于0.1 M pH7.4 PBS缓冲液中搅拌清洗；在洗涤后的工作电极表面滴加10 μL 10 U的Taq DNA Ligase，在室温下反应2 h；反应结束后，将工作电极在95℃热水中浸泡5 min以热释放目标DNA，然后转移到另一管相同温度的水中，然后逐渐冷却至室温；目标DNA杂交-连接-热释放的过程共进行三次；
3）将10 μL 1 μM的回文探针1与等量等浓度的回文探针2混合均匀并滴在步骤（2）处理好的工作电极表面，然后在室温下孵育2 h；孵育结束后，使用0.1 M pH7.4 PBS缓冲液洗涤工作电极，随后将亚甲蓝滴加到工作电极表面并在室温下孵育40 min，即获得待测的工作电极；
4）使用0.1 M pH7.4 PBS缓冲液洗涤待测工作电极，然后以饱和甘汞电极作为参比电极，以铂丝作为辅助电极，组成三电极体系，并将三电极体系置于工作溶液中，在电化学工作站上做循环伏安扫描，收集产生的电化学信号。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述回文探针1核苷酸序列为：5’-CCGTACGGTTTCGTCGTGCAGCAGCAGCAGCAGCAACGGCTTGCTGCTGCTGCTGCTGC-3’；
所述回文探针2核苷酸序列为：5’-TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGCCGTTTTGATCGATC-3’。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
当所述目标探针核苷酸序列为：5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’、5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCtTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’、5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCcTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’、
5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCaTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’、
5’-GGAACAGCTTTtAGGTGCaTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’、
5’-GGAACAGCTTTtAGGTGCaTGTTTGTtCCTGTCCTGGG-3’、
5’-GGAACAGCTTTtAGtTGCaTGTTTGTtCCTGTCCTGGG-3’中的任意一种时，
所述捕获探针核苷酸序列为：5’-P-CGCACCTCAAAGCTGTTCCTTTTTTTTTT-SH-3’，
所述触发探针核苷酸序列为：5’-TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGCCCAGGACAGGCACAAACA-3’。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述目标探针核苷酸序列为：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCC-3’时，
所述捕获探针核苷酸序列为：5’-P-CCAGCTCCAACTACCACAATTTTTTTTTT–SH-3’，
所述触发探针核苷酸序列为：5’-TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGGGCACTCTTGCCTACGCCA-3’。
5.一种利用如权利要求1所述的制备方法制得的回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器。
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant |