IT201900006679A1 - METODO PER LA DETERMINAZIONE DIRETTA DI ANEUPLOIDIE A CARICO DEL FETO DA ANALISI NON INVASIVA DEL DNA FETALE DA SANGUE MATERNO MEDIANTE dPCR - Google Patents

METODO PER LA DETERMINAZIONE DIRETTA DI ANEUPLOIDIE A CARICO DEL FETO DA ANALISI NON INVASIVA DEL DNA FETALE DA SANGUE MATERNO MEDIANTE dPCR Download PDF

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IT201900006679A1
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probes
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Russo Claudio Dello
Alvaro Mesoraca
Claudio Giorlandino
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Artemisia S P A
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Description

Descrizione dell’invenzione avente per titolo:
“METODO PER LA DETERMINAZIONE DIRETTA DI ANEUPLOIDIE A CARICO DEL FETO DA ANALISI NON INVASIVA DEL DNA FETALE DA SANGUE MATERNO MEDIANTE dPCR”
Descrizione
Settore della tecnica
La presente descrizione si riferisce al settore delle tecniche per l’analisi prenatale non invasiva (NIPT) ed in particolare ad una nuova metodologia diagnostica non invasiva che, basandosi sui principi generali della NIPT, permette di eseguire l’analisi del DNA fetale in maniera più diretta grazie ad un innovativo sistema di analisi diretta e quantitativa dei frammenti di DNA fetale libero circolante (cffDNA) nel sangue materno su piattaforma dropped digital PCR (ddPCR o dPCR). Più in dettaglio la presente descrizione si riferisce ad una innovativa metodica di ricerca di aneuploidie fetali basata su un originale work flow analitico che sfrutta la tradizionale dPCR come piattaforma analitica superando tutti i bias dei precedenti test che hanno tentato di eseguire le stesse indagini su analoghe piattaforme dPCR. Specificatamente, la presente descrizione si riferisce ad un test diagnostico non invasivo per la ricerca di aberrazioni cromosomiche (aneuploidie) fetali nel DNA-fetale libero circolante nel sangue materno (cffDNA) attraverso un innovativo workflow ed una nuova tecnica di analisi informatica dei dati.
Stato dell’arte
I test prenatali non invasivi (NIPT) sono test predittivi e non diagnostici effettuati mediante un prelievo di sangue materno basato sull’identificazione nel sangue materno prelevato di frammenti del DNA fetale e sulla lettura e analisi delle loro sequenze. In alcuni casi (4-5%) il materiale genetico di origine fetale estratto risulta troppo scarso e l’esame non è pertanto eseguibile. La lettura del DNA fetale, oltre a rivelare il sesso del nascituro, oggi, per la maggior parte dei test attualmente in commercio, permette di riconoscere la presenza di anomalie cromosomiche (errori nel numero di cromosomi), in particolare per il cromosoma 21 (sindrome di Down), e per le altre trisomie più comuni (cromosomi 13, Patau, e 18, Edwards). Il NIPT è un esame che può essere eseguito a partire dalla decima settimana di gestazione, presenta un’elevata attendibilità ma variabile sulla base dei tanti test commerciali oggi offerti. La percentuale dei falsi positivi è bassa, attestata tra lo 0,1 e lo 0,5%. Il test non è diagnostico (ovvero il suo risultato non può essere considerato definitivo, principalmente perché alcune possibili differenze tra il DNA del feto e della parte fetale della placenta possono introdurre degli errori) ma è utilissimo per individuare le donne ad alto rischio di avere un bimbo con malattie cromosomiche. Un eventuale risultato positivo del Test sul DNA libero rende necessari esami di diagnostica prenatale invasivi, ovvero amniocentesi o villocentesi.
Per l’esecuzione di tali test le metodiche più diffuse sono quelle di Next Generation Sequencing (NGS), con costi di gestione e tempi diagnostici elevati. Metodi alternativi all’NGS sono rappresentati dall’utilizzo di array, economicamente ancora più svantaggiosi dell’NGS, e dalla digital PCR(dPCR). I work flow finora applicati alla digital PCR non hanno soddisfatto i criteri affidabilità, velocità ed economicità.
Le principali problematiche tecniche riscontrabili nell’esecuzione di tali test, risiedono nel fatto che i test del DNA fetale su sangue materno mediante analisi del cffDNA, presentano alcuni limiti che riguardano la sensibilità (capacità di riconoscere la patologia se presente) e la specificità (capacità di non dare falsi positivi) del test. Dati questi che non sono elevati per tutti i cromosomi. La maggior parte dei test di NIPT presenti in commercio, in tutto il mondo, sono caratterizzati dai seguenti principali limiti:
- sensibilità non elevata per tutti i cromosomi: attualmente, i NIPT identificano circa il 50% delle anomalie identificate di routine con la diagnosi prenatale invasiva.
- Non permettono di distinguere tutte le possibili aneuploidie (presenza di specifici cromosomi in numero anormale).
- Presenza di falsi positivi e negativi. I primi in maggiore misura rispetto ai secondi.
- Il risultato del test è condizionato dalla quantità di DNA fetale presente nel plasma materno, che deve essere superiore al 5%. Nei casi di gravidanza gemellare non è possibile distinguere la condizione del singolo feto.
- La diagnosi di certezza delle aneuploidie fetali può dunque essere ottenuta esclusivamente con l’amniocentesi o la villocentesi.
Ad oggi, i due principali ostacoli alla più ampia applicazione della dPCR in ambito diagnostico sono date dal fatto che non si era mai trovata una metodologia semplice e robusta che potesse esaminare il cffDNA senza dover ricorrere a protocolli che prevedevano diverse migliaia di PCR, amplificazioni su biglie magnetiche, oppure artifizi basati, ad esempio, sui delicati ed imprecisi rapporti di metilazione. Il primo problema è stato risolto dalle recenti scoperte tecniche nel campo della digital PCR (dPCR), come la Droplet digital PCR (ddPCR), in cui migliaia di PCR individuali vengono eseguite nello stesso pozzetto di reazione <(1)>, gli altri metodologici rimangono, fino ad ora, irrisolti. Le limitazioni dei metodi pubblicati e talvolta anche brevettati, sostanzialmente diversi dalla presente invenzione, non hanno mai consentito l’uso industriale e diagnostico di tale metodo.
Le attuali applicazioni di metodiche di Digital PCR alla NIPT risultano essere altamente indaginose, imprecise e presentano costi di realizzazione molto alti.
Precedenti tentativi di applicazione della digital PCR alla NIPT hanno previsto che già in passato numerosi Autori hanno provato a realizzare un test di diagnosi prenatale delle trisomie fetali sulla ricerca di frammenti di DNA libero fetale nel sangue materno mediante digital PCR. Tali studi non hanno permesso di individuare un metodo diagnostico da poter essere utilizzato in clinica nella Diagnosi Prenatale perché troppo imprecisi o totalmente inefficaci.
- Hindson BJ <(2) >e coll. per primi riuscirono solo a dimostrare l’esistenza, con a dPCR, di ffDNA.
- Ge Q,Bai Y e coll. <(3) >ottenevano solo qualche risultato nella ricerca del cromosoma Y senza ottenere nessun valore diagnostico sulle trisomie. - Fan HC e coll. <(4) >dimostravano solo che era possibile usare la dPCR per ricercare, nel sangue materno, la trisomia 21, la loro metodologia era comunque troppo imprecisa e complicata e non fu mai utilizzata in diagnosi.
- Whale AS e coll. <(5) >sperimentarono la possibilità di valutare mediante la dPCR la Copy Number Variation che, normalmente, la si esegue mediante NGS ipotizzandone l’uso in Diagnosi prenatale.
- El Khatthabi L.A. <(6) >con la sua metodica proponeva solo un “concept study” sulla trisomia 21 senza risultati apprezzabili. La tecnica risultava estremamente complessa, su di una piattaforma molto “debole” ed i risultati troppo imprecisi per poter essere utilizzati in clinica giacché le differenze tra feti normali ed aneuploidi erano troppo modeste per poter essere diagnostiche e fino ad ora non è stato possibile tradurlo in un prodotto industriale.
- Recentemente Lee Seung Yong e coll. <(7) >mettevano a punto una tecnica per la ricerca analizzando il cffDNA nel sangue materno, feti con trisomia 21. La metodica permetteva solo risultati parziali. La tecnica era molto complessa e costosa.
- Altrettanto recentemente Chianru Tan, e coll. <(8) >hanno tentato di mettere a punto una nuova metodica basata sullo studio del cffDNA nel sangue materno mediante dPCR ma i risultati furono deludenti e la metodica troppo complessa per essere applicata nella diagnosi prenatale, gli autori non riescono a risolvere il bias rappresentato dalla variabilità presente nel campione di cfDNA ottenuto da sangue materno.
- Anche altri ricercatori, Kadoch per primo e Seung Yong più recentemente, hanno provato a eseguire metodologie diagnostiche brevettando prodotti che, però, stanti le loro limitazioni tecniche e di risultati diagnostici, non hanno di fatto mai trovato applicazione industriale.
Due documenti che descrivono metodi totalmente differenti da quello oggetto della presente invenzione che in comune con i detti metodi noti presenta solo la fase comune di estrazione del cfDNA, (peraltro presente in tutte le metodiche di diagnosi non invasiva) e di lettura finale basata su digital PCR anch’essa comune a molte applicazioni, sono: il documento WO 2016/059601 ed il documento WO2017/074094 A1. Il primo, ovvero il documento WO 2016/059601 tratta della ricerca delle trisomie 21,18 e 13 mediante dPCR. Il metodo oggetto del detto documento differisce totalmente rispetto a quello secondo la presente invenzione giacché si basa su di una metodica completamente differente attraverso la ricerca e comparazione della metilazione dei frammenti di DNA. La dPCR rappresenta solo il comune metodo di analisi del processo. In questa ricerca è stata calcolata un’analisi quantitativa del DNA fetale nel plasma materno per ciascun paziente utilizzando per la ricerca dei feti affetti da aneuploidia del cromosoma 21, la differenza nella metilazione del DNA fetale rispetto al DNA materno. Rapporto impreciso e biologicamente incostante. Questo metodo, pertanto, non è mai stato utilizzato in diagnostica e non è giunto sul mercato perché troppo impreciso, costoso ed indaginoso
Altro limite della metodologia oggetto del sopra citato documento d’arte nota, e che segna la profonda differenza rispetto al metodo secondo la presente invenzione, è la mancanza di ogni analisi matematica che interpreti in modo oggettivo e ripetibile il dato basandosi pertanto su algoritmi precisi.
Il secondo documento, ovvero il detto documento WO2017/074094 A1 HWANG, Seung Yong) tratta di una metodologia che non ha avuto nessun riscontro nella applicazione industriale del prodotto. Infatti, tale workflow aveva bisogno per funzionare dell’utilizzo del metodo trentennale dell’arricchimento del cffDNA mediante Biglie Magnetiche <(9)>. Questa invenzione era quindi poco utilizzabile per scopi diagnostici giacché la metodologia introduceva un’alterazione del campione che determinava artefatti. Inoltre il test utilizza per l’analisi del dato un gene di controllo su cromosoma non coinvolto nell’aneuploidia verso un gene presente nel cromosoma affetto da aneuploidia; tale metodo presenta il rischio che il cromosoma di riferimento sia anch’esso caratterizzato da un’anomalia numerica, come spesso accade nei mosaicismi placentari, introducendo un nuovo elemento di analisi che aumenta il rischio di errore. Fondamentale limite metodologico che distingue profondamente la detta metodologia nota da quella secondo la presente invenzione è la mancanza, in questo caso, di ogni analisi matematica che interpreti, in modo oggettivo e ripetibile, il dato basandosi su algoritmi precisi.
Ad oggi, i test che hanno sfruttato la dPCR prevedevano workflow estremamente più complessi, procedimenti che includevano bias metodologici che poi, nei fatti, si sono rivelati inadatti ad una distribuzione industriale. Pertanto, fino ad oggi, nessun test NIPT dPCR è stato introdotto nella routine diagnostica perché poco affidabile e ripetibile, indaginoso e alla fine anche costoso rispetto alla semplice ddPCR. Specificatamente, i precedenti test, anche brevettati, presentavano i seguenti limiti:
- scarsa attendibilità dovuta ad articolate metodologie di arricchimento del campione, manipolazione dello stesso cfDNA, e assenza di una razionale analisi matematica e bioinformatica;
- tempi di esecuzione lunghi;
- costi elevati.
L’invenzione, qui di seguito dettagliatamente descritta, risiede nell’aver creato un workflow innovativo, estremamente semplice e diretto che non necessita di amplificazione (es. su biglie magnetiche) e non va a correlare differenze biologiche incostanti e delicate come le metilazioni. La metodologia bioinformatica, basata su di un agile algoritmo, ha permesso di disporre di uno strumento di analisi del dato assolutamente preciso.
Descrizione dell’invenzione
La presente descrizione ha ad oggetto una nuova metodologia per la determinazione della presenza di aneuploidie cromosomiche a carico del feto secondo i principi della tecnica NIPT. Più in dettaglio l’invenzione secondo la presente descrizione consiste in una nuova metodologia NIPT che, superando le attuali criticità relative alla mancanza di una totalmente consistente attendibilità dei dati ed alle tempistiche, relativamente lunghe, per l’ottenimento dei risultati dei test, permette di ottenere i detti risultati in tempi relativamente più brevi e con aumentata precisione ed attendibilità.
Più in dettaglio, il core e la struttura centrale di tutto il work flow della presente invenzione risulta decisamente vantaggioso in termini di efficienza, risparmio e velocità di esecuzione del test <(10)>.
Ancor più dettagliatamente, la presente invenzione unica e assolutamente originale, prevede che:
- L’Analisi del DNA sia basata sullo studio diretto e quantitativo del cfDNA, senza prevedere alcun metodo preliminare che possa alterarne i risultati, come l’uso di biglie magnetiche, né mettere in relazione il grado di metilazione tra DNA fetale e materno, ma esamina direttamente attraverso il work flow di cui si parlerà in seguito, la quantità di DNA libero circolante dei cromosomi che si vanno ad indagare e che in seguito un’originale analisi bioinformatica rileverà così da valutare l’eventuale esistenza di una aneuploidia.
- Il dato ottenuto, utilizzando un pool di probe e primer che consentono l’amplificazione di regioni cromosomiche ad alta univocità, garantendo elevata sensibilità e specificità, venga analizzato mediante due diversi sistemi di confronto statistico: il primo sistema utilizza il valore threshold identificato dal rapporto del numero di conte ottenute per campioni positivi e negativi in una coorte di 600 campioni; il secondo, essenziale, si basa sul confronto intracampione, tale analisi è indispensabile per superare i bias dovuti alla variabilità nella qualità e quantità di cfDNA nei diversi campioni, bias che ha reso inutilizzabili i metodi precedentemente proposti. Tale secondo sistema di analisi si basa sul controllo dei tre rapporti di conte ottenute per cromosoma (conte cromosoma 21/ conte cromosoma 18, conte cromosoma 21/ conte cromosoma 13, conte cromosoma 18/ conte cromosoma 13); nel caso di campioni normali i tre rapporti sono nello stesso range, mentre nel caso di presenza di aneuploidia su uno dei cromosomi (la aneuploidia simultanea di due o tre cromosomi non è compatibile con la vita e non consente il raggiungimento della gravidanza fino alla 10 settimana) uno dei rapporti sarà positivo mentre gli altri manterranno il valore del range di normalità, rappresentando il controllo interno necessario all’ottenimento di un risultato affidabile malgrado la variabilità inter campione.
- L’ottimizzazione del disegno dei probe e primer utilizzati nella assay, in grado di coprire regioni univoche dei cromosomi e la cui ridondanza consente l’ottenimento di un elevato grado di specificità; per il mix di primer PCR sono state usate sonde originali un primer assay progettato dal sistema in uso. In particolare sono state usate 13 probe per il cromosoma 21
(ABCG1, APP, BACE2, DOPEY2, DYRK1A, ERG, ETS2, LS5, NCAM2,
OLIG2, PDE9A, RUNX1, WDR4) con un FAM florophore, 7 sonde per il cromosoma 18 (ANKRD12, DCC, DSC1, GATA6, SMAD4, TWSG1, ZNF521) con FAM florophore, 14 sonde per il 13 (ATP7B, BRCA2, FLY1,
FLT3, FOXO1, GPC5, HTR2A, IRS2, LCP1, NBEA, PCDH9, RB1,
SPRY2, TFDP1) con floroscopio HEX.
- il metodo presentato consente la detection dei cromosomi X ed Y e conseguentemente l’esclusione di aneuploidie ad essi associate. Per il cromosoma X sono utilizzati 3 sonde (MED12, AR, ATRX), per il cromosoma Y una sonda (SRY).
- la componente bioinformatica di analisi del dato nel presente metodo risulta in grado di discriminare eventi patologici anche con percentuale di DNA fetale inferiori all’1%, dimostrandosi idonea all’uso diagnostico e superando la variabilità presente nella natura e qualità del campione analizzato.
il test di analisi prenatale non invasiva secondo la presente invenzione risulta pertanto un test diagnostico, non invasivo, per la ricerca di aberrazioni cromosomiche (aneuploidie) fetali nel DNA-fetale libero circolante nel sangue materno (cffDNA) attraverso un innovativo work flow di campionamento e valutazione diretta quantitativa del cffDNA su Digital PCR (dPCR). Le analisi previste da tale testi, differentemente da quanto contemplato dagli studi precedenti, si basano su di una nuova metodologia di analisi del cffDNA sul sangue materno mediante dPCR. La assoluta novità sta nel fatto che tale metodica utilizza un sistema analitico del dato integrato al metodo tecnico. Il saggio è costituito da probe identificanti i cromosomi coinvolti nelle principali aneuploidie. Il risultato diagnostico è ottenuto mediante rapporti reciproci delle conte ottenute per ciascun cromosoma. L’immediatezza dell’elaborazione del dato riduce i bias associati a calcoli biostatistici che risentono della elevata variabilità intercampione, risultando quindi, per la prima volta, utilizzabile in diagnostica clinica con i vantaggi di alta sensibilità e specificità, velocità di esecuzione e basso costo. Tale originale procedimento risulta sensibilmente più preciso e meno costoso della NIPT tradizionale del 21, mediante Massive Parallel Sequencing (MPS) in Next Generation Sequencing (NGS).
Vantaggiosamente l’invenzione consente l’applicazione di metodiche di Digital PCR alla NIPT, favorendo la velocità di esecuzione, l’affidabilità e il ridotto costo di gestione, che consentirà un’offerta altrettanto vantaggiosa verso il paziente. Vantaggiosamente è in grado di consentire il rapido incremento dei test effettuati annualmente. La riduzione del costo al paziente, derivante dalla riduzione di costi di gestione del test da parte del laboratorio, può difatti consentire l’estensione industriale del test alla popolazione con grandi vantaggi per la salute pubblica. Descrizione delle figure
FIG. 1A mostra la rappresentazione delle condizioni di amplificazione utilizzate per l’esecuzione dell’assay. Il valore normale tra i rapporti R1 / R2 / R3 (cffDNA) viene calcolato automaticamente da un algoritmo matematico normalizzato soggetto per soggetto.
FIG. 1B mostra la rappresentazione del metodo utilizzato per l’ottenimento dei rapporti fra le conte ottenute per ciascun cromosoma; A campione normale, B campione patologico. Da tale schema si evince come l’analisi intracampione consenta di superare i bias associati alla variabilità nella quantità e qualità del cfDNA estratto da diversi soggetti, costituendo un valore normalizzante essenziale all’affidabilità del dato. Il valore anormale tra i rapporti R1 e R3 rispetto a R2 viene calcolato automaticamente da un algoritmo matematico normalizzato soggetto per soggetto.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Come più volte ripetuto nel corso della presente descrizione, il test di analisi prenatale non invasiva secondo la presente invenzione trova applicazione nell’analisi delle aneuploidie dei cromosomi 21, 18, 13 e cromosomi sessuali su cfDNA.
Di seguito la presente invenzione sarà descritta nei dettagli analitici; lo stesso approccio tecnico potrà tuttavia essere applicato per ogni obiettivo diagnostico similare.
Ancor più specificatamente il test diretto di analisi prenatale non invasiva secondo la presente invenzione è riconducibile ad un metodo per eseguire la PCR digitale che si basa sulla tecnologia delle gocce d’acqua e olio-emulsione. Un campione viene frazionato in circa 20.000 gocce e l’amplificazione PCR delle molecole modello si verifica in ogni singola goccia (droplet). La tecnologia ddPCR utilizza reagenti e flussi di lavoro simili a quelli utilizzati per la maggior parte dei saggi qPCR standard.
Il massiccio campionamento del campione è un aspetto chiave della tecnica ddPCR. Ogni goccia di un campione viene tracciata su un grafico dell’intensità della fluorescenza rispetto al numero di goccioline. Tutte le goccioline positive (quelle al di sopra dell’intensità della soglia) sono valutate come positive e ad ognuna viene assegnato un valore pari a 1. Tutte le goccioline negative (quelle sotto la soglia) vengono classificate come negative e a ciascuna viene assegnato un valore pari a 0 (zero). Questa tecnica di conteggio fornisce un segnale digitale dal quale calcolare la concentrazione del DNA bersaglio iniziale mediante un’analisi statistica dei numeri di goccioline positive e negative in un dato campione.
Il test di analisi prenatale diretta e non invasiva secondo la presente invenzione si basa su una nuova tecnologia di amplificazione dell’acido nucleico. La tecnologia prevede regole rivoluzionarie di progettazione del primer, che alla fine risolvono la formazione del dimero del primer e problemi di amplificazione non specifici nella tradizionale tecnologia PCR. Il metodo consente l’amplificazione di acido nucleico altamente multiplexata. Nel sistema di analisi diretta prenatale non invasiva secondo la presente invenzione, 34 set di primer e sonde sono multiplexati a target di rivelazione su ciascuno dei cromosomi 21, 18 e 13. Facilitato da ddPCR, il test in oggetto consente una quantificazione accurata di tre cromosomi in una singola reazione ddPCR e fornisce un potente metodo di screening per aneuploidia cromosomica.
Il detto metodo consta sostanzialmente di due fasi: una prima fase, Fase 1, detta di estrazione del DNA, ed una seconda fase, analitica, Fase 2, per l’individuazione dell’eventuale aneuploidia. Quest’ultima fase, ovvero quella comprendente le peculiarità proprie del metodo secondo la presente invenzione comprende a sua volta una pluralità di sotto fasi sequenziali come qui di seguito dettagliatamente descritto secondo un esempio di realizzazione della presente invenzione.
Fase 1 - Estrazione del cfDNA
Il DNA circolante fetale si estrae da un prelievo di campione plasmatico materno utilizzando le provette Stretch tube. L’invenzione prevede l’utilizzo di un protocollo automatizzato utilizzando il sistema QiaSymphony (QIAGEN, Valencia, CA, USA). I kit QIAsymphony sono utilizzati con procedure completamente automatizzate e simultanee di purificazione del DNA totale da sangue fetale, isolato da campioni di sangue materno. La tecnologia impiegata è quella a particelle magnetiche che consente di purificare gli acidi nucleici di alta qualità che sono privi di proteine, nucleasi e altre impurità. Gli acidi nucleici purificati sono direttamente utilizzati in analisi successive.
Fase 2 - Metodo analitico
Ogni campione è stato eseguito in otto repliche seguendo la seguente metodologia: a) Si aggiungono 90 μl di ddPCR ™ Supermix per sonde No dUTP (Biorad), 18 μl di miscela di primer per PCR, a 67,5 μl di campione e 117 μl di acqua.
b) Dopo la miscelazione, si procede alla generazione di gocce seguendo metodi descritti (metodo descritto sul generatore di gocce QX200 ™ e lettore di gocce QX200 ™ e metodo descritto del software QuantaSoft ™). c) Di seguito si procede inserendo la cartuccia DG8 nel supporto con la tacca nella cartuccia in alto a sinistra del supporto. Ogni campione deve essere collocato in una cartuccia e fornito di una guarnizione.
d) Di seguito, delicatamente, si trasferisce il mix di reazione da 20 μl in ciascuno degli 8 pozzetti di reazione (pozzetti intermedi) sulla cartuccia. e) Poi si aggiungono 70μL di olio di gocciolina per le sonde in ciascuno degli 8 pozzi di petrolio (pozzetti inferiori) sulla cartuccia.
f) Dopo si aggancia la guarnizione sul supporto della cartuccia usando i fori su entrambi i lati.
g) Di seguito si posiziona il supporto per cartucce nel generatore di goccioline e quindi si avvia la generazione di goccioline.
h) Al termine della generazione di gocce, si deve rimuovere il supporto della cartuccia dal generatore di gocce. Una volta rimosso il supporto e scartato la guarnizione le goccioline vengono trasferite dalle prime file alla piastra di reazione PCR.
i) In seguito si sigilla la piastra PCR con una piastra di pellicola perforabile e la si colloca nella macchina PCR
j) A questo punto si segue il seguente programma per completare la PCR, con velocità di rampa per ogni passaggio a 2 ° C seguendo questo schema:
Tabella 1.
k) Le piastre sono state incubate a temperatura ambiente per una notte prima di leggere sul lettore di gocce.
Lettura del campione sul lettore di gocce QX200 (Biorad).
Lo strumento è stato impostato selezionando ABS sul tipo di esperimento e ddPCR Supermix For Probes (senza dUTP) sulla supermix. Il target 1 è stato selezionato per chr21 chr18 e target 2 per chr13; FAM / HEX per l’opzione Set di colori. Analisi dei dati con QuantaSoft Analysis Pro
Impostazione manuale della soglia: sull’interfaccia principale si deve impostare la scheda 1D “Ampiezza”, selezionando i pozzetti di reazione e i pozzetti multipli di soglia. Su “Opzioni grafico”, si debbono controllare entrambe le caselle Log. Sono necessarie due soglie per Canale 1 e solo una soglia è necessaria per il canale 2.
In un file Excel si esportano:
Column A = Reaction Well.
Column C = Channel (FAM or HEX).
Column K = Copy Number in the Reaction Well.
Nei dati di soglia 1, il totale dei Copy Number per i cromosomi 18 e 13 (C18 C13) deve essere calcolato sommando il Copy Number (Column K) del Channel 1 (FAM) degli 8 wells. Il totale copy number del cromosoma 21 (C21) si calcola sommando il Copy Number (Column K) del Channel 2 (HEX) degli 8 wells. Nei dati di soglia 2, il totale dei Copy Number del cromosoma 18 (C18) si calcola sommando il Copy Number (Column K) del Channel 1 (FAM) di 8 wells. Il totale dei Copy Number del cromosoma 13 (C13) si calcola sul rapporto (C18 C13) – C18. La ratio tra i cromosomi, C21/C18, C21/C13, e C18/C13, si calcola dividendo I numeri corrispondenti.
Per ciascun campione, i conteggi assoluti per i cromosomi 21, 18 e 13 sono quantificati e calcolati da ddPCR e Quantasoft. Vengono quindi derivati tre rapporti 21/18, 21/13 e 18/13. La media dei rapporti viene tracciata rispetto alle frazioni fetali.
Entrambi i rapporti 21/18 e 21/13 di tutte le frazioni fetali mostrano una differenza statisticamente significativa rispetto ai campioni negativi (0%) come indicato dagli asterischi (p <0.05 da Student t-test). Il rapporto 18/13 di tutte le frazioni fetali non è significativamente diverso dai campioni negativi. Ci basiamo su entrambi i rapporti 21/18 e 21/13 per determinare lo stato di aneuploidia del cromosoma 21, 21/18 e 18/13 per determinare lo stato di aneuploidia del cromosoma 18 e il rapporto 21/13 e 18/13 per determinare lo stato di aneuploidia del cromosoma 13.
BIOINFORMATICA:
Algoritmo matematico alla base del modello bioinformatico:
Sulla base del conteggio dei cromosomi 21, 18 e 13, si rileva la possibilità di evidenziare la presenza di concentrazioni anomale di uno dei suddetti tre cromosomi, basandosi sul seguente algoritmo matematico:
- Si crea un archivio di conteggi che abbiano misurazioni superiori ai 10.000 conteggi per tipo di cromosoma, rilevati su campioni diversi di cui è certa la normalità per tutti e tre i tipi di cromosomi; identifichiamo con i nomi TotalChr21_obs(i), TotalChr18_obs(i) e TotalChr13_obs(i), i totali dei conteggi che si riferiscono ai tre tipi di cromosomi per il campione (ì);
- Per ogni campione (i), si calcolano i rapporti relativi dei conteggi totali, che indichiamo con i nomi 21/18(i), 21/13(i) e 18/13(i):
Tabella 2.
- Per ogni gruppo di rapporti, si calcola il valore medio e la relativa deviazione standard, che indichiamo con i nomi 21/18m, 21/18σ, 21/13m, 21/13σ, 18/13m, 18/13σ.
Il risultato statistico evidenzia che tutti campioni di cui è certa la normalità, rientrano nell’intervallo di due deviazioni standard dal valor medio, nel rispetto simultaneo quindi dei seguenti confronti:
21/18m – 2 * 21/18σ < 21/18(i) < 21/18m 2 * 21/18σ
21/13m – 2 * 21/13σ < 21/13(i) < 21/13m 2 * 21/13σ
18/13m – 2 * 18/13σ < 18/13 (i) < 18/13m 2 * 18/13σ
a) Eccesso Chr21:
21/18(i) > 21/18m 2 * 21/18σ
21/13(i) > 21/13m 2 * 21/13σ
b) Eccesso Chr18:
21/18(i) < 21/18m - 2 * 21/18σ
18/13(i) > 18/13m 2 * 18/13σ
c) Eccesso Chr13:
21/13(i) < 21/13m - 2 * 21/13σ
18/13(i) < 18/13m - 2 * 18/13σ
A supporto della valutazione si è introdotta anche una correlazione tra i tre rapporti dello stesso campionamento, che tiene conto della rettifica che si può operare sulla valutazione di concentrazione del singolo cromosoma in funzione del rapporto misurato per gli altri due cromosomi.
Indicando con % lo scostamento dal valor medio del singolo rapporto, ed imputando un 50% di questo scostamento al numeratore ed un 50% al denominatore il fattore di correzione è calcolato e poi applicato come indicato nelle seguenti tabelle:
Tabella 3.
Tabella 4.
Utilizzando i valori della tabella, si conferma l’eventuale concentrazione anomala al verificarsi della coppia dei seguenti confronti:
a) Eccesso Chr21:
21/18r13(i) > 21/18m 2 * 21/18σ
21/13r18(i) > 21/13m 2 * 21/13σ
b) Eccesso Chr18:
18/21r13(i) < 21/18m - 2 * 21/18σ
18/13r21(i) > 18/13m 2 * 18/13σ
c) Eccesso Chr13:
13/21r18(i) < 21/13m - 2 * 21/13σ
13/18r21(i) < 18/13m - 2 * 18/13σ
La presente invenzione è un metodo di diagnosi prenatale. Tale invenzione può superare il rischio per il feto associato alla diagnosi prenatale invasiva. Le Società Scientifiche Internazionali ritengono che i test prenatali non invasivi debbano essere eseguiti in laboratori selezionati, accreditati per le attività di Genetica Medica e qualificati a svolgere tali indagini. Il test va considerato un metodo di “screening avanzato” per la valutazione del rischio di trisomie.

Claims (6)

  1. Rivendicazioni 1. Metodo per la determinazione della presenza di aneuploidie cromosomiche a carico del feto mediante analisi non invasiva del DNA fetale presente in un campione di sangue materno previamente prelevato dalla gestante, detto metodo essendo caratterizzato dal fatto che l’analisi del DNA sia basata su studio diretto e quantitativo del cfDNA utilizzando la tecnica ddPCR, detto metodo prevedendo l’impiego di un sistema analitico matematico e bioinformatico che riconduce il risultato diagnostico ai rapporti reciproci delle conte ottenute per ciascun cromosoma del DNA fetale.
  2. 2. Metodo per la determinazione della presenza di aneuploidie cromosomiche a carico del feto mediante analisi non invasiva del DNA fetale presente in un campione di sangue materno previamente prelevato dalla gestante secondo la precedente rivendicazione in cui il dato ottenuto, utilizzando un pool di sonde e primer che consentono l’amplificazione delle regioni cromosomiche di interesse, viene analizzato mediante due sistemi di confronto statistico, detto metodo prevedendo che dei detti due sistemi di confronto statistico, il primo sistema utilizza il valore threshold identificato dal rapporto del numero di conte ottenute per campioni positivi e negativi in una coorte di 600 campioni mentre il secondo si basa sul confronto intracampione che prevede il controllo dei tre rapporti di conte ottenute per cromosoma, detti rapporti essendo almeno il rapporto conte cromosoma 21/ conte cromosoma 18, conte cromosoma 21/ conte cromosoma 13, conte cromosoma 18/ conte cromosoma 13, detto metodo prevedendo che nel caso di campioni normali i tre rapporti siano nello stesso range, mentre nel caso di presenza di aneuploidia su uno dei cromosomi uno dei rapporti sarà positivo mentre gli altri manterranno il valore del range di normalità.
  3. 3. Metodo secondo la precedente rivendicazione in cui sono usate: tredici sonde, con un FAM florephore, per il cromosoma 21, dette sonde essendo ABCG1, APP, BACE2, DOPEY2, DYRK1A, ERG ETS2, LS5, NCAM2, OLIG2, PDE9A, RUNX1, WDR4; sette sonde, con un FAM florephore, per il cromosoma 18, dette sonde essendo ANKRD12, DCC, DSC1, GATA6, SMAD4, TWSG1, ZNF521; quattordici sonde, con floroscopio HEX, per il cromosoma 13, dette sonde essendo ATP7B, BRCA2, FLY1, FLT3,FOXO1, GPC5, HTR2A, IRS2, LCP1, NBEA, PCDH9, RB1, SPRY2, TFDP1.
  4. 4. Metodo secondo le precedenti rivendicazioni in cui è ulteriormente prevista la detection dei cromosomi X ed Y e conseguentemente l’esclusione di aneuploidie ad essi associate, detto metodo prevedendo che per il cromosoma X siano utilizzate tre sonde, dette sonde essendo MED12, AR, ATRX e per il cromosoma Y una sonda, detta sonda essendo SRY.
  5. 5. Metodo secondo le precedenti rivendicazioni in cui l’analisi diretta e quantitativa del cfDNA prevede che il campione plasmatico materno, previamente prelevato mediante provette Stretch tube, venga trattato secondo comuni tecniche automatizzate di purificazione del DNA che impiegano particelle magnetiche per la purificazione di acidi nucleici.
  6. 6. Metodo secondo le precedenti rivendicazioni in cui la quantificazione accurata dei cromosomi investigati consegue ad una singola reazione di ddPCR, digital droplet PCR, per la quale ogni goccia di campione viene tracciata su un grafico dell’intensità della fluorescenza rispetto al numero di goccioline, delle dette goccioline quelle al di sopra dell’intensità della soglia vengono valutate come positive e ad ognuna viene assegnato un valore di 1, quelle al di sotto della soglia vengono valutate come negative e a ciascuna vien assegnato un valore pari a 0, detta tecnica di conteggio permettendo di ottenere un segnale digitale dal quale calcolare la concentrazione del DNA bersaglio iniziale mediante analisi statistica dei numeri di goccioline positive e negative in un dato campione.
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