KR20100019220A - 열순환을 포함하는 다중 치환 증폭에 의하여 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 열순환을 포함하는 다중 치환 증폭에 의하여 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의하면, 표적 서열을 효율적으로 증폭할 수 있다.
열순환, 다중 치환 증폭

Description

열순환을 포함하는 다중 치환 증폭에 의하여 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법{Method for amplifying a target nucleic acid sequence by a multiple displacement amplification comprising thermal cycling}
본 발명은 다중 치환 증폭에 의하여 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법으로서, 구체적으로는 열순환을 포함하는 다중 치환 증폭에 의하여 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법에 관한 것이다.
핵산을 증폭하기 위한 다양한 방법이 알려져 있다. 이들 방법에는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 자기 지속 서열 복제 (3SR), 핵산 서열 기초한 증폭 (NASBA), 가닥 치환 증폭 (SDA), Qβ 레플리카제를 사용한 증폭 방법 및 다중 치환 증폭 (MDA)이 포함된다.
상기 다중 치환 증폭 (MDA)은 다중 프라이머에 의하여 표적 핵산 서열의 가닥 치환 복제에 근거한 것이다. 상기 다중 치환 증폭 (MDA)은 복제된 가닥을 생성하고, 하나 이상의 상기 복제된 가닥은 복제 중, 다른 복제된 가닥의 가닥 치환 복제에 의하여 상기 표적 서열로부터 치환되는 것을 포함한다. 상기 다중 치환 증폭 (MDA)에 있어서, 사용되는 프라이머는 표적 서열의 제1 가닥에 상보적인 프라이머 세트와 표적 서열의 제2 가닥에 상보적인 프라이머 세트의 두 개의 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 랜덤 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 모든 프라이머가 표적 서열의 하나의 가닥에만 혼성화하는 것일 수 있다.
미국특허 제6,977,148호에는 프라이머 세트들, DNA 폴리머라제, 및 표적 시료를 접촉시키고, 상기 표적 시료를 표적 서열의 복제를 촉진시키는 조건하에서 배양하는 단계로서, 상기 표적 시료는 변성 조건에 놓여지지 않는 것인 단계를 포함하는 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법으로서, 표적 서열의 복제는 복제된 가닥을 생성하고, 복제 중 상기 복제된 가닥들 중 하나 이상의 가닥이 다른 복제된 가닥의 가닥 치환 복제 (strand displacement replication)에 의하여 상기 표적 서열로부터 치환되는 것인 방법이 개시되어 있다.
이러한 다중 치환 증폭 (MDA) 방법은, 등온에서 이루어지는데, 프라이머가 표적 서열과 혼성화되는 것을 촉진시키기 위하여 충분히 낮은 온도에서 배양한다. 즉, 프라이머의 혼성화를 촉진시키기 위하여 폴리머라제의 최적 활성 온도보다 낮은 온도에서 배양한다. 그 결과, 증폭은 최초의 변성 및 어닐링 단계에서 결합된 프라이머 및 그에 해당하는 위치에서만 증폭이 일어나는 경향으로 인하여, 증폭 편향 (amplification bias)가 생길 수 있으며, 그에 따라 증폭효율이 감소하는 경향이 있다. .
따라서, 종래 알려진 다중 치환 증폭 (MDA) 방법에 의하더라도 증폭 효율을 여전히 개선할 수 있는 여지가 남아 있다.
본 발명은 열순환을 포함하는 다중 치환 복제에 의하여 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예는, 프라이머, DNA 폴리머라제, 및 표적 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 표적 시료를 배양하여 표적 서열을 복제시키는 단계;를 포함하는 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법으로서, 상기 표적 서열의 복제는 복제된 가닥을 생성하고, 하나 이상의 상기 복제된 가닥은 복제 중, 다른 복제된 가닥의 가닥 치환 복제에 의하여 상기 표적 서열로부터 치환되고, 상기 배양은 상기 DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도 범위와 프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화를 촉진시키는 온도 범위 사이를 열 순환시키면서 이루어지는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법은, 프라이머, DNA 폴리머라제, 및 표적 시료를 접촉시키는 단계를 포함한다.
상기 프라이머는 5 내지 20bp의 길이를 갖는 것일 수 있다. 길이가 5 내지 20bp의 프라이머는 뉴클레오티드가 천연 뉴클레오티드인 경우, Tm 값은 사용되는 프라이머의 농도 및 반응액 중의 성분 예를 들면, 양이온의 농도 등에 따라 달라질 수 있으나, 보통 약 10℃ 내지 약 80℃이다. 상기 프라이머는, 바람직하게는, 5 내 지 8bp의 길이, 더욱 바람직하게는 6bp의 길이를 갖는 것이다. 상기 프라이머는 천연 뿐만 아니라, 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머일 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고 있어, 뉴클레아제 저항성인 것일 수 있다. 상기 변형된 뉴클레오티드는 비오틴화된 뉴클레오티드, 형광 뉴클레오티드, 5 메틸 dCTP, BrdUTP, 또는 5-(3-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트인 것일 수 있다. 상기 프라이머는 DNA 또는 RNA 프라이머를 포함한다. 또한, 상기 프라이머는 검출가능한 표지로 표지된 것일 수 있다. 상기 프라이머는 임의의 서열을 가진 프라이머의 풀 (pool)인 랜덤 프라이머 또는 특정한 서열을 가진 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 구체예는, 상기 프라이머는 5bp, 6bp, 7bp, 또는 8bp의 랜덤 프라이머, 또는 이들의 혼합물인 것이다.
상기 DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도는 프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화 온도보다 높은 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도는 표적 서열에 혼성화된 프라이머를 변성시키는 온도보다는 높고, 프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화를 촉진시키는 온도 범위에서 배양, 또는 상기 DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도 범위와 프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화를 촉진시키는 온도 범위 사이의 열 순환 과정에서 복제된 가닥을 변성시키는 온도보다는 낮은 것일 수 있다. 이 경우, 상기 복제된 가닥과 표적 서열 사이의 이중가닥의 "변성 온도"는 대상 이중가닥의 50% 이상이 변성되는 온도, 60% 이상이 변성되는 온도, 70% 이상이 변성되는 온도, 80% 이상이 변성되는 온도, 또는 90% 이상이 변성 되는 온도일 수 있다. 즉, 상기 DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도는 상기 복제된 가닥과 표적 서열 사이의 이중가닥의 일부분 예를 들면, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 이상이 변성되지 않고 남아 있는 경우, 새로운 프라이머의 어닐링에 의하여 증폭이 개선될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, "최적 활성화 온도"는 반응 용액 등의 조건에 따라 달라질 수 있으나, 당업자라면 주어진 버퍼 조건에서 해당 폴리머라제의 최적 온도를 확인할 수 있다. 본 발명에 있어서, "최적 활성화 온도 범위"는 최적 활성화 온도±10℃, 바람직하게는 최적 활성화 온도±5℃, 더욱 바람직하게는 최적 활성화 온도±2.5℃의 온도 범위로서, 프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화를 촉진시키는 온도 범위에서 배양에 의하여 복제된 가닥을 변성시키는 온도보다는 낮은 것을 의미한다. "변성 온도"에 대하여는 상기한 바와 같다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, "혼성화 온도"란 달리 언급이 없으면, 프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화에 의하여, 혼성화 가능한 부위의 절반이 혼성화되는 온도를 의미한다. 혼성화 온도는 당업자에 의하여 용이하게 실험에 의하여 또는 계산에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 상기 혼성화 온도는, SantaLucia. & Hicks (2004) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33:415-40에 개시된 방법에 의하여 계산될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, "프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화를 촉진시키는 온도 범위"는 프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화를 촉진시킬 수 있는 온도이면 되나, 바람직하게는, 상기 DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도보다 5℃이하의 온도, 10℃이하의 온도, 또는 15℃이하의 온도인 것이 될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도 범위는 30℃ 내지 75℃인 것일 수 있다. 또한, 상기 혼성화를 촉진시키는 온도 범위는 0℃ 내지 30℃인 것일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도 범위는 30℃ 내지 75℃이고, 상기 혼성화를 촉진시키는 온도 범위는 0℃ 내지 30℃인 것일 수 있다. 상기 DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도 범위는, 예를 들면, φ29 DNA 폴리머라제는 약 32℃, exo(-) Bst DNA 폴리머라제는 약 65℃, vent exo- DNA 폴리머라제는 약 75℃, 9˚Nm DNA 폴리머라제는 약 75℃, 클레나우 단편은 약 37℃, MMLV 역전사 효소는 약 42℃인 것으로 알려져 있다.
상기 DNA 폴리머라제는 가닥 치환 복제를 할 수 있는 폴리머라제로서, 예를 들면, φ29 DNA 폴리머라제, Tts DNA 폴리머라제, M2 DNA 폴리머라제, VENTTM DNA 폴리머라제, T5 DNA 폴리머라제, PRD1 DNA 폴리머라제, 또는 Bst DNA 폴리머라제인 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
표 1. DNA 폴리머라제 및 그 특성
Bst DNA L 단편 VentR VentR (exo-) Deep VentR Deep VentR (exo-) 9˚Nm
5'->3' 엑소누클레아제 - - - - - -
3'->5' 엑소누클레아제 - ++ - +++ - +
오류율a(x106) ND 57b 190b ND ND ND
가닥 치환 ++++ ++g +++g ++ ++ +++x
닉 치환 - - - - - -
열안정성 + +++ +++ +++ +++ +++
Km dNTPs ND 60μMg 40μMg 50μMg ND 80μMx
Km DNAd ND 0.1nMg 0.1nMg 0.01nMg ND 0.05nMx
RNA 프라이머 연장y + - - - - -
닉으로부터 연장 + + + + + +
표 1 (계속)
Therminator Therminator II 클레나우 단편 polI 클레나우 단편 exo- MMRT
5'->3' 엑소누클레아제 - - - - -
3'->5' 엑소누클레아제 - - ++ - -
오류율a(x106) ND ND 18w 100w ND
가닥 치환 + + ++ ++ +++
닉 치환 - - - - -
열안정성 +++ +++ - - -
Km dNTPs ND ND 4μMk ND 18μMp
Km DNAd ND ND ND ND ND
RNA 프라이머 연장y + + + + ND
닉으로부터 연장 + + + + ND
MMRT: M-MulV reverse transcriptase, ND : 검출되지 않음 (not detected)
Km dNTP 및 Km DNA는 각각 dNTP 및 DNA에 대한 미켈리스 상수 (Michaelis constant)를 나타낸다.
a: Kunkel et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4865-4869
b: Mattila, P., Korpela, J., Tenkanen, T. and Pitkanen, K. (1991) Nucleic Acids Res., 19, 4967-4973
d: DNA에 대한 Km 값이 프라이머-주형 복합체의 몰 (mole)로 표현되어 있다.
g: Kong, H.M., Kucera, R.B. and Jack, W.E., (1993) J. Biol. Chem., 268, 1965-1975.
k: Polesky, A.H., Steitz, T.A., Grindley, N.D.F. and Joyce, C.M. (1990) J. Biol. Chem., 265, 14579-14591.
p: Ricchetti, M. and Buc, H. (1990) EMBO J., 9, 1583-1593
x: Southworth, M.W. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 5281-5285.
w: Bebenek, K., Joyce, C.M., Fitzgerald, M.P. and Kunkel, T.A. (1990) J. Biol. Chem., 265, 13878-13887.
y: dNTP의 도입이 RNA 또는 DNA 프라이머로 단일가닥 M13 DNA 주형을 사용한 것에 비교되었다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 DNA 폴리머라제는 φ29 DNA 폴리머라제이고, 상기 최적 활성 온도 범위는 30℃ 내지 34℃, 바람직하게는 약 32℃ 이고, 상기 혼성화를 촉진시키는 온도 범위는 4℃ 내지 22℃, 바람직하게는 약 20℃인 것이다. 이 경우, 상기 프라이머는 6bp의 랜덤 또는 특정한 서열을 갖는 프라이머인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 DNA 폴리머라제는 exo(-) Bst DNA 폴리머라제이고, 상기 최적 활성 온도 범위는 46℃ 내지 75℃, 바람직하게는 약 65℃ 이고, 상기 혼성화를 촉진시키는 온도 범위는 4℃ 내지 35℃, 바람직하게는 약 30℃인 것이다. 이 경우, 상기 프라이머는 6bp의 랜덤 또는 특정한 서열을 갖는 프라이머인 것일 수 있다.
상기 표적 시료는 혈액, 뇨, 정액, 림프액, 뇌척수액, 양막액, 생검 시료, 바늘 흡입 생검 시료, 암 시료, 종양 시료, 조직 시료, 세포, 세포 파쇄물, 조세포 파쇄물, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 표적 시료는 전체 게놈 (whole genome)을 포함하는 시료일 수 있으며, 표적 서열은 전체 게놈일 수 있다.
프라이머, DNA 폴리머라제, 및 표적 시료를 접촉시키는 것은 적절한 용액 중에서 이루어질 수 있다. 상기 적절한 용액은 핵산의 증폭에 관련된 당업자에 의하여 선택된 폴리머라제의 종류에 따라 적의 선택할 수 있다. 예를 들면, φ29 DNA 폴리머라제에 대하여, 37mM Tris-HCl, pH 8.0, 50mM KCl, 10mM MgCl2, 5mM (NH4)2SO4를 포함하는 용액일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 방법에 있어서, 상기 접촉은 먼저 프라이머, 및표적 서열을 변성, 예를 들면, 고온에서의 열 변성시킨 후 어닐링시키는 초기 단계를 포함한거나 포함하지 않을 수 있다. 그러나, 초기 단계를 제외하고는, 표적 서열을 변성시키는 조건에 놓이지 않는 것이 바람직하다. 상기 폴리머라제가 열 안정성인 경우에는, 상기 변성 및 어닐링은 상기 폴리머라제가 존재하는 조건에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 방법은, 상기 표적 시료를 배양하여 표적 서열을 복제시키는 단계를 포함한다. 상기 배양은 상기 DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도 범위와 프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화를 촉진시키는 온도 범위 사이를 열 순환시키면서 이루어지는 것이다. 상기 "DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도 범위" 및 "프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화를 촉진시키는 온도 범위"에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 열 순환은 상기 "DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도 범위"에서 일정 시간, 예를 들면, 30초 내지 6 시간 동안 배양하고, "프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화를 촉진시키는 온도 범위"에서 일정 시간, 예를 들면, 30초 내지 3분 동안 배양하는 것일 수 있다. 바람직하게는, "프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화를 촉진시키는 온도 범위"에서 먼저 배양하여, 프라이머의 표적 서열에의 어닐링 및 연장을 유도한 다음, 상기 "DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도 범위"에서 배양하는 것이나, 그 반대의 경우 가능하다.
상기 배양은 폴리머라제에 의한 중합 반응에 필요한 반응 성분, 예를 들면, dNTPs, ATP 및 염을 포함하는 조건에 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 방법에 있어서, 상기 배양은 바람직하게는, 표적 핵산을 변성시키지 않는 조건에 이루어지는 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따른 방법에 있어서, 상기 표적 서열의 복제는 복제된 가닥을 생성하고, 하나 이상의 상기 복제된 가닥은 복제 중, 다른 복제된 가닥 의 가닥 치환 복제에 의하여 상기 표적 서열로부터 치환된다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 일 구체예에서 사용되는 DNA 폴리머라제는 단독 또는 적합한 가닥 치환 인자와 조합하여, 복제 중에서 만나는 혼성화된 가닥을 치환할 수 있어야 한다. 이하 이러한 폴리머라제는 가닥 치환 DNA 폴리머라제라고도 한다. 가닥 치환 DNA 폴리머라제는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 것이 바람직하다. 가닥 치환은 표적 서열의 다중 카피를 합성하는데 필요하다. 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성은, 만약 존재하는 경우, 합성된 가닥을 파괴할 것이다. 상기 가닥 치환은 헬리카제와 같은, 가닥 치환 인자에 의하여 촉진될 수 있다. 가닥 치환 DNA 폴리머라제는 고도로 가공성 (processive)인 것이 바람직하다. 이러한 가닥 치환에 의하여 다중 치환 카피로부터 복제가 이루어지며, 이러한 증폭 방법을 다중 치환 증폭 (multiple displacement amplification: MDA)라고 한다. 다중 치환 증폭 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들면, 원용에 의하여 본 명세서에 그 전체로서 포함되어지는 미국특허 제6,124,120호 참조).
본 발명에 있어서, 핵산은 DNA, RNA, 및 PNA를 포함한다. 또한, 천연뿐만 아니라, 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 핵산도 포함한다.
본 발명에 따른 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법에 의하면, 표적 핵산 서열을 고효율로 증폭할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예에는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 열 순환이 다중 가닥 치환 증폭에 미치는 영향
본 실시예에서는 exo(-) Bst DNA 폴리머라제 (New England Biolab)를 Bst DNA 폴리머라제로 사용하고, 헥사머 랜덤 프라이머 (Bioneer 사, 한국) 및 혈액으로부터 혈액 DNA 정제 키트 (Qiagen 사)를 사용하여 정제된 인간 게놈 시료를 Bst DNA 폴리머라제 버퍼 (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100, 25℃에서 pH 8.8) (New England Biolab) 중에서 접촉시키고, 30℃, 60℃ 및 30℃와 60℃에서 열순환시키면서 배양하였다. 30℃와 60℃에서 열순환은 30℃에서 20초 동안 배양하고, 60℃에서 40초 동안 배양하는 과정을, PCR 기기에서 수행하였다.
상기 exo(-) Bst DNA 폴리머라제는 65℃의 범위에서 최적 활성을 갖는 것으로 알려져 있다 (Mead, D.A. et al (1991) Biotechniques, 11, 76-87). 반응 종료 후, 얻어지는 증폭 산물을 전기 영동 기기를 사용하여, 1% 겔에서 전기영동하고, SYBR Green I으로 이중가닥 DNA에 대하여 특이적으로 표지한 후, 480nm에서 여기광을 조사하고, 580nm에서 발광을 검출하였다.
도 1은 30℃, 60℃ 또는 30℃와 60℃에서 열순환시키면서 표적 서열을 증폭 한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 30℃와 60℃에서 열순환시키면서 표적 서열을 증폭한 경우가, 30℃ 또는 60℃에서 등온 증폭한 경우에 비하여, 빠른 시간에 많은 증폭이 일어났다. 도 1에서 M은 크기 마커이며, 0.5h, 1h, 1.5h, 2h는 각각 0.5 시간, 1 시간, 1.5 시간, 2 시간 반응시킨 경우를 나타낸다.
도 2는 도 1에서 30℃와 60℃에서 열순환시켜 표적 서열을 증폭시킨 경우와 대조군 제품을 사용한 경우의 결과를 나타내는 도면이다. 대조군 제품은 REPLI-G ULTRA Kit (Qiagen 사)를 사용하였다. 구체적인 반응 조건은 다음과 같다. 50ng 주형 DNA를 변성 버퍼(denaturation buffer), 및 재활 버퍼 (renaturation buffer)를 각각 2분 동안 처리한 후 1X 반응 버퍼, 1X 효소 믹스를 처리하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 따른, 30℃와 60℃에서 열순환시켜 표적 서열을 증폭시킨 경우가 대조군 제품에 비하여, 원본 주형에 근접하는 증폭 산물을 얻을 수 있었다. 도 2에서, T는 온전한 정제된 인간 게놈을 나타내고, M은 크기 마커이며, 0.5h, 1h, 1.5h, 2h는 각각 0.5 시간, 1 시간, 1.5 시간, 2 시간 반응시킨 경우를 나타낸다. 50ng 주형 DNA, 100μM 랜덤 헥사머 프라이머, 1X 열안정성 (thermo) Bst DNA 폴리머라제 버퍼 (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100, 25℃에서 pH 8.8), 10유니트 Bst DNA 폴리머라제를 혼합하고, 30℃에서 20초, 및 60℃에서 40초를 총 시간이 상기한 바와 같은 시간 동안 반복하였다.
상기한 바와 같은, 본 발명의 방법에 따른 열순환에 의한 증폭 방법에 의하여, 표적 서열의 증폭 효율이 개선되는 것은 다음과 같은 기작에 의하여는 것으로 여겨지나, 본 발명의 범위가 이러한 기작에 한정되는 것은 아니다.
먼저, 랜덤 헥사머 프라이머, exo(-) Bst DNA 폴리머라제 및 인간 게놈을 60℃에서 배양하면, 인간 게놈의 일부 서열이 변성된다. 그러나, 60℃는 랜덤 헥사머 프라이머의 Tm 보다 높은 온도이기 때문에 표적 서열과 혼성화하지 않는다. 상기 배양 온도를 30℃로 낮추면, 랜덤 헥사머가 표적 서열과 혼성화되고 연장된다. 다시, 60℃에서 배양하면, 연장된 랜덤 헥사머는 표적 서열로부터 변성되어 이탈하지 않는다. 60℃에서 30℃로 낮추면, 새로운 랜덤 헥사머가 60℃에서 변성된 표적 서열 부분에 혼성화되어, 연장되게 된다. 이와 같이, 열순환에 의하여, 프라이머의 어닐링이 증가되고, 그에 따라 프라이머 연장이 증가되고, 결과적으로 표적 서열의 증폭 효율이 증가되게 된다.
도 1은 30℃, 60℃ 또는 30℃와 60℃에서 열순환시키면서 표적 서열을 증폭한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 2는 도 1에서 30℃와 60℃에서 열순환시켜 표적 서열을 증폭시킨 경우와 대조군 제품을 사용한 경우의 결과를 나타내는 도면이다.

Claims (13)

  1. 프라이머, DNA 폴리머라제, 및 표적 시료를 접촉시키는 단계; 및
    상기 표적 시료를 배양하여 표적 서열을 복제시키는 단계;를 포함하는 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법으로서, 상기 표적 서열의 복제는 복제된 가닥을 생성하고, 하나 이상의 상기 복제된 가닥은 복제 중, 다른 복제된 가닥의 가닥 치환 복제에 의하여 상기 표적 서열로부터 치환되고,
    상기 배양은 상기 DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도 범위와 프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화를 촉진시키는 온도 범위 사이를 열 순환시키면서 이루어지는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 랜덤 뉴클레오티드 서열 또는 특정한 서열을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 5 내지 20bp의 길이를 갖는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 5 내지 8bp의 길이를 갖는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 6bp의 길이를 갖는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도는 표적 서열에 혼성화된 프라이머를 변성시키는 온도보다는 높고, 프라이머와 표적 서열 사이의 혼성화를 촉진시키는 온도 범위에서 배양에 의하여 복제된 가닥을 변성시키는 온도보다는 낮은 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제의 최적 활성 온도 범위는 40℃ 내지 65℃인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 혼성화를 촉진시키는 온도 범위는 0℃ 내지 35℃인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제는 φ29 DNA 폴리머라제, Tts DNA 폴리머라제, M2 DNA 폴리머라제, VENTTM DNA 폴리머라제, T5 DNA 폴리머라제, PRD1 DNA 폴리머라제, 또는 Bst DNA 폴리머라제인 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제는 exo(-) Bst DNA 폴리머라제이고, 상기 최적 활성 온도 범위는 46℃ 내지 75℃이고, 상기 혼성화를 촉진시키는 온도 범위는 4℃ 내지 35℃인 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 프라이머는 6bp의 랜덤 프라이머 또는 특정 서열을 갖는 프라이머인 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 프라이머는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고 있어, 뉴클레아제 저항성인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드는 비오틴화된 뉴클레오티드, 형광 뉴클레오티드, 5 메틸 dCTP, BrdUTP, 또는 5-(3-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트인 것인 방법.
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