CN111175503B - 捕获筛及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种捕获筛,包括筛网骨架和设置于所述筛网骨架上的捕获物,所述捕获物能够与目标细胞或生物分子特异性结合,所述筛网骨架具有金属原子,所述的筛网骨架和所述捕获物之间通过巯基化物质连接,其中巯基化物质与所述筛网骨架通过反应形成金属‑硫键而结合,巯基化物质与所述捕获物通过反应形成酰胺键而结合;所述巯基化物质为巯基化海藻酸钠和巯基化透明质酸中的一种或两种的组合。本发明的捕获筛在筛网骨架表面通过金属‑硫键连接有巯基化物质,并通过在巯基化物质与捕获物之间形成酰胺键,实现将捕获物通过巯基化物质连接至筛网骨架上,且采用了巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸,在保证了较高的捕获效率的前提下,后续很方便的将捕获的物质洗脱。
Description
技术领域
本发明属于医疗器械技术领域,具体涉及一种通过巯基化物质连接捕获物的捕获筛以及该捕获筛的制备方法。
背景技术
微流控芯片技术是把生物学、化学等实验室的基本操作过程集成到一块芯片上,具有集成性、高通量、检测快速、操作便利、所需样本量少、低耗能优点,近年来在药物研究等众多科研与生活领域拥有越来越多的广阔应用前景。用于芯片上细胞分离和捕获的手段涉及光、电、声、磁、流体力学、机械加工以及化学方法等众多领域。微机械加工技术结合流体力学控制用于整体及单个细胞、细菌样本的捕获是目前最有效的固定方式。这种技术往往通过加工尺寸与细胞相匹配的微井、微孔、微坝、微狭缝及微管道等几何陷阱或障碍来捕获细胞,不仅可形成开放阵列体系,还可以在微通道中实现对细胞的控制。
随着微加工技术的不断进步,微流控芯片在生物分析中的优势愈显突出,在疾病诊断、药物筛选和细胞分子生物学研究等多个领域里显示出巨大的发展潜力和应用价值。在生物分析领域,捕获筛所采用的高分子聚合物主要有二甲基硅氧烷(PDMS)和聚乙烯(PC)等,其中PDMS因具有良好的生物相容性、光透性和易加工制作等特点,成为最常用的材料之一。然而,现有的捕获筛对生物样本中的蛋白质等生物大分子、细菌和细胞等物质易发生非特异性吸附,影响芯片的生物分析效能。且聚合物表面能量低,缺乏功能化反应所需要的活性基团,捕获效率较低。
本申请人于2018年提出了一种用于捕获生物分子、细胞或细菌的捕获筛,参见CN109609336A,该捕获筛包括基体层、形成于所述基体层上的保护层及形成于所述保护层上的高分子层,所述高分子层的原料包括:聚乙烯醇和/或聚乙二醇;透明质酸;羟乙基纤维素;琼脂糖和/或葡聚糖等。该捕获筛通过在保护层表面覆着上高分子聚合物涂层,引入聚乙二醇和/或聚乙烯醇、透明质酸、羟乙基纤维素、聚乳酸、聚酰胺、琼脂糖和/或葡聚糖等进行聚合,活化材料表面,使得高分子材料膜具有很好的亲水性提高了目标分子的捕获效率。然而,该捕获筛的结构和制备工艺较为复杂。另一方面,现有的捕获筛在进行特定细胞捕获之后,特定细胞的洗脱较为复杂或者洗脱率较低,对后续细胞的处理影响较大。
发明内容
本申请所要解决的技术问题是,提供一种改进的捕获筛,其不仅具有高的捕获效率,而且结构和制备工艺较为简单,且在捕获后能够方便地将捕获的细胞洗脱。
本申请同时提供一种捕获筛的制备方法,其工艺简单且制备得到的捕获筛具有高的捕获效率以及高的洗脱效率。
有鉴于此,为了克服上述缺陷以及达到上述目的,本发明采用以下的技术方案:
一种捕获筛,包括筛网骨架和设置于所述筛网骨架上的捕获物,所述捕获物能够与目标细胞或生物分子特异性结合,所述筛网骨架具有金属原子,所述的筛网骨架和所述捕获物之间通过巯基化物质连接,其中巯基化物质与所述筛网骨架通过反应形成金属-硫键而结合,巯基化物质与所述捕获物通过反应形成酰胺键而结合;所述巯基化物质为巯基化海藻酸钠和巯基化透明质酸中的一种或两种的组合。
根据本发明的一些优选的实施方面,所述捕获物上具有氨基,所述巯基化物质上具有羧基,所述捕获物与所述巯基化物质通过氨基和羧基反应形成酰胺键而结合。
根据本发明的一些优选的实施方面,所述巯基化物质的巯基化率为20~30%,即海藻酸钠或透明质酸中羧基总量的20~30%变成了巯基。巯基化率过低,巯基化物质与筛网骨架之间的结合不够牢固;巯基化率过高,巯基化物质可捕获的捕获物相对比例减少,使得后续制备的捕获筛的捕获率降低。
在一些实施例中,所述巯基化物质的巯基化率优选为25~30%。
根据本发明的一些优选的实施方面,所述巯基化物质的分子量为5kDa~35kDa。巯基化物质分子量过大,进行过滤或者透析时容易堵塞,同时分子链过长蜷曲,会使得巯基化物质在金属表面的连接效果降低,影响捕获率。
在一些实施例中,所述巯基化物质的分子量为6kDa~34kDa。优选地,所述巯基化物质的巯基化率为25~30%,所述巯基化物质的分子量为6kDa~34kDa。根据本发明申请的优选实施例,最优选巯基化物质的巯基化率为26%,巯基化物质的分子量为6~34kDa。
根据本发明的一些优选的实施方面,所述金属原子为金原子,所述金属-硫键为金-硫键。
根据本发明的一些优选的实施方面,所述捕获物为上皮细胞粘附分子(EPCAM)抗体,制备得到的所述捕获筛用于捕获循环肿瘤细胞。
根据本发明的一些优选的实施方面,所述巯基化物质是由海藻酸钠和/或透明质酸与含有氨基的二硫代化合物在羧基活化剂的存在下反应后的产物经二硫键还原剂还原后得到。
根据本发明的一些优选的实施方面,所述海藻酸钠和/或透明质酸的分子量为5kDa~40kDa,所述的含有氨基的二硫代化合物为3,3'-二硫代二(丙酸肼),所述羧基活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺,所述二硫键还原剂为三(2-羰基乙基)磷盐酸盐。
即所述巯基化海藻酸钠通过如下步骤制得:将海藻酸钠和3,3'-二硫代二(丙酸肼)溶解于缓冲液中;先加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应后,继续加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐反应,得到巯基化海藻酸钠;
所述巯基化透明质酸通过如下步骤制得:将透明质酸和3,3'-二硫代二(丙酸肼)溶解于缓冲液中;先加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应后,继续加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐反应,得到巯基化透明质酸。
其中,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的作用是用于活化海藻酸钠或透明质酸上的羧基即羧基活化剂,使其与3,3'-二硫代二(丙酸肼)发生反应;三(2-羰基乙基)磷盐酸盐即二硫键还原剂的作用是为了将连接在海藻酸钠或透明质酸上的3,3'-二硫代二(丙酸肼)中的二硫键打开,以暴露出巯基,方便后续将巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸连接到捕获筛的筛网骨架上。
优选地,含有氨基的二硫代化合物即3,3'-二硫代二(丙酸肼)与海藻酸钠和/或透明质酸的摩尔比为3~5:1;所述二硫键还原剂即三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、羧基活化剂即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与海藻酸钠和/或透明质酸的摩尔比为15~16:1.5~2.5:1。
以巯基化海藻酸钠的制备为例,根据本发明的一些优选的实施方面,巯基化海藻酸钠的制备方法包括如下步骤:
1)将海藻酸钠溶解于缓冲液中,随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼),搅拌至完全溶解;
2)加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺,保持溶液的pH为2~7,反应5~15h;之后加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐,继续反应10~40h,得到巯基化海藻酸钠;
为了进一步保证巯基化海藻酸钠的纯度、去除小分子和杂质,还需要包括步骤3)用滤菌器过滤反应后的巯基化海藻酸钠溶液,并将过滤后的溶液进行透析;透析的目的一方面是为了去除溶液中的小分子和杂质,另一方面是为了保证产品的分子量。
为了方便后续的保存、运输,在一些实施例中上述步骤还包括将巯基化海藻酸钠进行冷冻干燥的步骤:4)将透析后得到的巯基化海藻酸钠溶液转移至冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
上述步骤中,步骤1)中3,3'-二硫代二(丙酸肼)与海藻酸钠之间的摩尔比为3~5:1,优选为4:1;步骤2)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与海藻酸钠之间的摩尔比为1.5~2.5:1,优选为2:1;步骤2)中三(2-羰基乙基)磷盐酸盐与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺之间的摩尔比为7.5~8.0:1,优选为7.85:1。
根据本发明的一些优选的实施方面,步骤3)中采用的透析袋的孔径匹配选用的原料的分子量,如5kDa、30kDa、40kDa等;透析1~10次,每次1~10h;且步骤3)中采用的透析液为浓度0.1~10mol/L的盐酸溶液。步骤1)采用的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液为pH 2~7,浓度为0.1~10mol/L。步骤3)中采用的滤菌器的滤膜孔径为0.1~10um,优选为0.2μm。
以巯基化海藻酸钠的制备为例,在本发明的一些具体的实施例中,巯基化海藻酸钠的制备方法包括如下步骤:
a. 将海藻酸钠溶于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液(pH:2~7,0.1~10mol/L)中,随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼),搅拌至完全溶解;
b. 加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺,保持溶液的pH:2~7,反应5~15h;
c. 加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐,继续反应10~40h,得到巯基化海藻酸钠;
d. 用0.1~10um孔径的滤膜滤菌器过滤反应后巯基化海藻酸钠溶液,并将过滤后溶液注入透析袋内,透析袋优选孔径为5~40kDa,透析袋截留的分子量为5~40kDa;
e. 配制透析液,透析液为浓度0.1~10mol/L的盐酸溶液;
f. 透析1~10次,每次1~10h;
g. 将透析后得到的巯基化海藻酸钠溶液转移至冷冻干燥机中冷冻干燥,并转移至离心管中,0℃~60℃保存。
巯基化透明质酸的制备方法与以上步骤基本相同。
海藻酸钠或透明质酸的结构单元上含有羧基,本发明中巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸的制备方法,采用3,3'-二硫代二(丙酸肼)为巯基化试剂,将海藻酸钠或透明质酸在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的作用下,羧基可以被活化并与3,3'-二硫代二(丙酸肼)发生脱水缩合反应,并在三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的作用下打开二硫键,制备得到巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸,反应过程快,巯基引入量可控,且反应产物均一。且巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸上的巯基,用于后续将巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸连接至筛网骨架的表面,如与筛网骨架表面的金原子形成牢固的金-硫键。同时,巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸上活化的羧基可以与捕获物的氨基结合从而实现通过巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸连接捕获物和筛网骨架的目的,以形成捕获筛。
本发明还提供了一种如上所述的捕获筛的制备方法,包括如下步骤:将筛网骨架与含有巯基化物质的溶液接触,所述筛网骨架上的金属原子与巯基化物质反应,使巯基化物质与筛网骨架上的金属原子连接;之后将连接有巯基化物质的筛网骨架与含有捕获物的溶液接触,使捕获物与巯基化物质连接,得到用于捕获特定生物分子、细胞或细菌的捕获筛。得到的捕获筛能够用于捕获特定的的物质,如生物分子、细胞等,且在捕获之后,能够通过裂解酶如海藻酸钠裂解酶或透明质酸裂解酶将捕获的物质洗脱,且洗脱条件温和,对捕获的物质损害小。
根据本发明的一些优选的实施方面,所述含有巯基化物质的溶液还包含三(2-羰基乙基)磷盐酸盐,即所述巯基化物质溶液为将巯基化海藻酸钠和/或巯基化透明质酸和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶解于缓冲液后得到,且所述巯基化物质与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的质量比为1~2.5:1,优选为2:1。所述缓冲液为PBS溶液。
根据本发明的一些优选的实施方面,在加入捕获物溶液前,向连接有巯基化物质的筛网骨架上加入活化试剂并进行孵育;所述活化试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或两种的组合。
根据本发明的一些优选的实施方面,所述捕获物溶液为将捕获物加至2-(N-吗啉)乙磺酸溶液中得到。
以巯基化海藻酸钠为例,在本发明的一些优选的实施方面,捕获筛的制备方法具体包括如下步骤:
步骤一:取巯基化海藻酸钠和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶解于PBS溶液中,得到巯基化海藻酸钠溶液;
步骤二:将筛网骨架放入步骤一的巯基化海藻酸钠溶液中,并进行恒温振荡,使巯基化海藻酸钠连接至筛网骨架上;
步骤三:取出步骤二中连接有巯基化海藻酸钠的筛网骨架,清洗后备用;
步骤四:向清洗后的筛网骨架上滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液即活化试剂,静置孵育后,清洗备用;
步骤五:将捕获物加至2-(N-吗啉)乙磺酸溶液中得到捕获物溶液,随后将该捕获物溶液滴加至步骤四中孵育后的筛网骨架上,静置孵育后,捕获物与巯基化海藻酸钠连接,得到捕获筛。
采用巯基化透明质酸进行捕获筛的制备方法与以上步骤基本相同。
与现有技术相比,本发明的有益之处在于:本发明的捕获筛在筛网骨架表面通过金属-硫键连接有巯基化物质如巯基化海藻酸钠和/或巯基化透明质酸,并通过在巯基化物质与捕获物之间形成酰胺键,实现将捕获物通过巯基化物质连接至筛网骨架上,使得捕获筛能够有效捕获携带特异性抗原的细胞,从而起到捕获细胞或其他物质的作用,且由于采用了巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸,使得在保证了较高的捕获效率的前提下,后续很方便的将捕获的物质洗脱,洗脱效率高,对捕获的物质破坏小。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明优选实施例中巯基化海藻酸钠冷冻干燥后的产品示意图;
图2为本发明优选实施例4中捕获到的循环肿瘤细胞的捕获筛的荧光检测示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
实施例1-1 巯基化海藻酸钠的制备
步骤一、取200mg,分子量34KDa海藻酸钠加入250mL单口烧瓶内,加入120mL MES缓冲液(pH=3),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)17mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺50mg,保持体系pH=3,反应持续12h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.5g,反应12h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为0.2um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入30kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在500mL的纯化水中加入200mL、10mol/L HCl作为透析液加入到2000mL的烧杯中;透析1次,每次5h,得到巯基化海藻酸钠。透析袋截留的分子量大于或等于30kDa。制备得到的巯基化海藻酸钠的巯基占巯基和羧基总数的15%。
步骤六、透析后得到的巯基化海藻酸钠溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥50h。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,25℃保存。
实施例1-2 巯基化海藻酸钠的制备
步骤一、取150mg,分子量20kDa的海藻酸钠加入250mL单口烧瓶内,加入100mL MES缓冲液(pH=4.5),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)16.5mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺50mg,保持体系pH=4.5,反应持续5h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.05g,反应40h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为5um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入20kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在1000mL的纯化水中加入100mL、23mol/L HCl作为透析液加入到5000mL的烧杯中;透析6次,每次2h,得到巯基化海藻酸钠。透析袋截留的分子量大于或等于20kDa。制备得到的巯基化海藻酸钠中的巯基占巯基和羧基总数的20%。
步骤六、透析后得到的巯基化海藻酸钠溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥10h。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,0℃保存。
实施例1-3 巯基化海藻酸钠的制备
步骤一、取200mg,分子量34KDa海藻酸钠加入250mL单口烧瓶内,加入120mL MES缓冲液(pH=6),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)30mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺120mg,保持体系pH=6,反应持续5h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.5g,反应10h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为0.2um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入30kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在1000mL的纯化水中加入100mL、1mol/L HCl作为透析液加入到5000mL的烧杯中;透析6次,每次2h,得到巯基化海藻酸钠。透析袋截留的分子量大于或等于30kDa。制备得到的巯基化海藻酸钠中的巯基占巯基和羧基总数的26%。
步骤六、透析后得到的巯基化海藻酸钠溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥50h。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,37℃保存。
实施例1-4 巯基化海藻酸钠的制备
步骤一、取200mg,分子量20kDa海藻酸钠加入250mL单口烧瓶内,加入50mL MES缓冲液(pH=6),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)33mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺120mg,保持体系pH=6,反应持续5h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.5g,反应10h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为0.2um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入20kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在1000mL的纯化水中加入100mL、1mol/L HCl作为透析液加入到5000mL的烧杯中;透析6次,每次2h,得到巯基化海藻酸钠。透析袋截留的分子量大于或等于20kDa。制备得到的巯基化海藻酸钠中的巯基占巯基和羧基总数的30%。
步骤六、透析后得到的巯基化海藻酸钠溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥50h。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,25℃保存。
实施例1-5 巯基化海藻酸钠的制备
步骤一、取150mg,分子量20kDa的海藻酸钠加入250mL单口烧瓶内,加入120mL MES缓冲液(pH=3),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)33mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺50mg,保持体系pH=3,反应持续12h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.1g,反应12h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为5um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入20kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在500mL的纯化水中加入200mL、10mol/L HCl作为透析液加入到2000mL的烧杯中;透析1次,每次5h,得到巯基化海藻酸钠。透析袋截留的分子量大于或等于20kDa。制备得到的巯基化海藻酸钠中的巯基占巯基和羧基总数的40%。
步骤六、透析后得到的巯基化海藻酸钠溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥10h,产品如图1所示。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,0℃保存。
实施例1-6 巯基化海藻酸钠的制备
步骤一、取200mg,分子量34kDa海藻酸钠加入250mL单口烧瓶内,加入50mL MES缓冲液(pH=6),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)60mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺25mg,保持体系pH=6,反应持续15h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.5g,反应10h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为0.2um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入30kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在280mL的纯化水中加入500mL、8mol/L HCl作为透析液加入到1000mL的烧杯中;透析10次,每次1h,得到巯基化海藻酸钠。透析袋截留的分子量大于或等于30kDa。制备得到的巯基化海藻酸钠的巯基占巯基和羧基总数的54%。
步骤六、透析后得到的巯基化海藻酸钠溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥50h。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,25℃保存。
实施例1-7 巯基化透明质酸的制备
步骤一、取200mg,分子量3kDa透明质酸加入250mL单口烧瓶内,加入50mL MES缓冲液(pH=6),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)30mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺120mg,保持体系pH=6,反应持续5h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.5g,反应10h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为0.2um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入3kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在1000mL的纯化水中加入100mL、1mol/L HCl作为透析液加入到5000mL的烧杯中;透析6次,每次2h,得到巯基化透明质酸。透析袋截留的分子量大于或等于3kDa。制备得到的巯基化透明质酸的巯基占巯基和羧基总数的26%。
步骤六、透析后得到的巯基化透明质酸溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥50h。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,25℃保存。
实施例1-8 巯基化透明质酸的制备
步骤一、取150mg,分子量5kDa透明质酸加入250mL单口烧瓶内,加入50mL MES缓冲液(pH=6),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)22.5mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺120mg,保持体系pH=6,反应持续5h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.5g,反应10h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为0.2um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入5kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在1000mL的纯化水中加入100mL、1mol/L HCl作为透析液加入到5000mL的烧杯中;透析6次,每次2h,得到巯基化透明质酸。透析袋截留的分子量大于或等于5kDa。制备得到的巯基化透明质酸的巯基占巯基和羧基总数的26%。
步骤六、透析后得到的巯基化透明质酸溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥50h。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,25℃保存。
实施例1-9 巯基化海藻酸钠的制备
步骤一、取200mg,分子量6521Da的海藻酸钠加入250mL单口烧瓶内,加入50mL MES缓冲液(pH=6),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)30mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺120mg,保持体系pH=6,反应持续5h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.5g,反应10h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为0.2um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入5kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在1000mL的纯化水中加入100mL、1mol/L HCl作为透析液加入到5000mL的烧杯中;透析6次,每次2h,得到巯基化海藻酸钠。透析袋截留的分子量大于或等于5kDa。制备得到的巯基化海藻酸钠中的巯基占巯基和羧基总数的26%。
步骤六、透析后得到的巯基化海藻酸钠溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥50h。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,25℃保存。
实施例1-10 巯基化透明质酸的制备
步骤一、取200mg,分子量10kDa透明质酸加入250mL单口烧瓶内,加入50mL MES缓冲液(pH=6),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)30mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺120mg,保持体系pH=6,反应持续5h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.5g,反应10h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为0.2um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入10kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在1000mL的纯化水中加入100mL、1mol/L HCl作为透析液加入到5000mL的烧杯中;透析6次,每次2h,得到巯基化透明质酸。透析袋截留的分子量大于或等于10kDa。制备得到的巯基化透明质酸的巯基占巯基和羧基总数的26%。
步骤六、透析后得到的巯基化透明质酸溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥50h。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,25℃保存。
实施例1-11 巯基化海藻酸钠的制备
步骤一、取200mg,分子量20kDa的海藻酸钠加入500mL单口烧瓶内,加入300mL MES缓冲液(pH=3),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)30mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺50mg,保持体系pH=3,反应持续12h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.1g,反应12h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为5um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入20kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在500mL的纯化水中加入200mL、10mol/L HCl作为透析液加入到2000mL的烧杯中;透析1次,每次5h,得到巯基化海藻酸钠。透析袋截留的分子量大于或等于20kDa。制备得到的巯基化海藻酸钠中的巯基占巯基和羧基总数的26%。
步骤六、透析后得到的巯基化海藻酸钠溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥10h,产品如图1所示。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,0℃保存。
实施例1-12 巯基化透明质酸的制备
步骤一、取200mg,分子量40kDa透明质酸加入100mL单口烧瓶内,加入100mL MES缓冲液(pH=4.5),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)30mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺50mg,保持体系pH=4.5,反应持续5h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.05g,反应40h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为5um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入40kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在280mL的纯化水中加入500mL、8mol/L HCl作为透析液加入到1000mL的烧杯中;透析10次,每次1h,得到巯基化透明质酸。透析袋截留的分子量大于或等于40kDa。制备得到的巯基化透明质酸中的巯基占巯基和羧基总数的26%。
步骤六、透析后得到的巯基化透明质酸溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥84h。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,37℃保存。
实施例1-13 巯基化透明质酸的制备
步骤一、取150mg,分子量65kDa透明质酸加入250mL单口烧瓶内,加入50mL MES缓冲液(pH=6),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)22.5mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺25mg,保持体系pH=6,反应持续15h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.5g,反应10h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为0.2um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入65kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在280mL的纯化水中加入500mL、8mol/L HCl作为透析液加入到1000mL的烧杯中;透析10次,每次1h,得到巯基化透明质酸。透析袋截留的分子量大于或等于65kDa。制备得到的巯基化透明质酸的巯基占巯基和羧基总数的26%。
步骤六、透析后得到的巯基化透明质酸溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥50h。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,25℃保存。
实施例1-14 巯基化透明质酸的制备
步骤一、取200mg,分子量100kDa透明质酸加入250mL单口烧瓶内,加入120mL MES缓冲液(pH=6),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)30mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺25mg,保持体系pH=6,反应持续15h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.5g,反应10h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为0.2um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入100kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在1000mL的纯化水中加入100mL、23mol/L HCl作为透析液加入到5000mL的烧杯中;透析6次,每次2h,得到巯基化透明质酸。透析袋截留的分子量大于或等于100kDa。制备得到的巯基化透明质酸中的巯基占巯基和羧基总数的26%。
步骤六、透析后得到的巯基化透明质酸溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥50h。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,25℃保存。
实施例1-15 巯基化海藻酸钠的制备
步骤一、取200mg,分子量1460kDa海藻酸钠加入250mL单口烧瓶内,加入50mL MES缓冲液(pH=6),玻璃棒搅拌溶解。随后加入3,3'-二硫代二(丙酸肼)30mg,继续搅拌至体系内均匀。
步骤二、向单口烧瓶内加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺120mg,保持体系pH=6,反应持续5h。
步骤三、向单口烧瓶内加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.5g,反应10h。
步骤四、取出单口烧瓶内溶液,使用孔径为0.2um的滤膜过滤反应后溶液,并将过滤后溶液注入1000kDa孔径的透析袋内。
步骤五、在1000mL的纯化水中加入100mL、1mol/L HCl作为透析液加入到5000mL的烧杯中;透析6次,每次2h,得到巯基化海藻酸钠。透析袋截留的分子量大于或等于1000kDa。制备得到的巯基化海藻酸钠的巯基占巯基和羧基总数的26%。
步骤六、透析后得到的巯基化海藻酸钠溶液放入冷冻干燥机中,冷冻干燥50h。随后将冻干得到的产品转移至离心管中,25℃保存。
实施例2 捕获筛
本实施例中的捕获筛,包括筛网骨架和设置于筛网骨架上的捕获物,捕获物能够与目标细胞或生物分子特异性结合,如抗体等。筛网骨架的尺寸为2~10mm×2~10mm,根据实际使用情况进行选择。
其中,筛网骨架包括不锈钢基体和覆盖于不锈钢基体表面上的保护层,保护层的材料为贵金属或其合金。本实施例中的保护层为金,即筛网骨架表面具有金原子。
筛网骨架和捕获物之间通过巯基化物质连接,其中巯基化物质与筛网骨架表面的金原子通过反应形成金-硫键而结合;捕获物上具有氨基,巯基化物质上具有羧基,捕获物与巯基化物质通过氨基和羧基的脱水缩合反应形成酰胺键而结合。
其中,本实施例中的巯基化物质所采用是实施例1-1~1-15中的方法制备得到的巯基化海藻酸钠和/或巯基化透明质酸。
实施例3-1 捕获筛的制备
步骤一:取15mg实施例1中冻干后的巯基化海藻酸钠溶解于1mL PBS溶液里,加入30mg三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)溶解,得到巯基化海藻酸钠溶液。
在本发明的其他一些实施例中,为了方便操作,可以在制备巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸的过程中,将筛网骨架直接放置于制备得到的巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸的溶液中,并在磁力搅拌子带动下旋转孵育过夜,进行巯基化海藻酸钠与筛网骨架之间的连接。
步骤二:向步骤一中的巯基化海藻酸钠溶液加入1片或多片清洗后的筛网骨架,恒温振荡器作用下100rpm振荡2h,让巯基化海藻酸钠连接至筛网骨架上,筛网骨架和巯基化海藻酸钠之间形成金-硫键。
步骤三:取出筛网骨架,用PBS清洗两遍后放置在12孔板内。
步骤四:配制活化试剂,其中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺:0.609mg/片(35uL),N-羟基琥珀酰亚胺:0.348mg/片(20uL),活化试剂总用量55uL,溶剂为MES(pH=6)。滴加在筛网骨架表面,使其均匀浸润筛网骨架,室温下静置活化孵育30min。
步骤五:用PBS溶液或MES溶液清洗两遍。
步骤六:加入7uL的EPCAM抗体至50uL MES(pH=6)溶液中得到捕获物溶液。随后将该捕获物溶液滴加至步骤五中清洗后的筛网骨架上,将放置有筛网骨架的12孔板放入CO2培养箱中,37℃静置避光孵育2h,使EPCAM抗体与巯基化海藻酸钠之间通过酰胺键连接,得到捕获筛。
在本发明的其他实施例中,可以在步骤六中添加其他的抗体或将步骤六中的抗体替换为其他的抗体以捕获对应的特定生物分子、细胞或细菌。
步骤七:将步骤六中的捕获筛用PBS清洗两遍后备用,得到用于捕获循环肿瘤细胞的捕获筛,该捕获筛上通过巯基化海藻酸钠将EPCAM抗体连接在筛网骨架上。
本实施例中的筛网骨架包括不锈钢基体和覆盖于不锈钢基体表面上的保护层,保护层的材质为金。巯基化海藻酸钠可与捕获筛表面的金原子形成牢固的金-硫键。同时,活化后的羧基可以与抗体的氨基结合形成酰胺键从而实现通过巯基化海藻酸钠连接抗体和筛网骨架的目的。
得到的捕获筛能够用于捕获特定的的物质,如生物分子、细胞等,且在捕获之后,能够通过裂解酶如海藻酸钠裂解酶或透明质酸裂解酶将捕获的物质洗脱,且洗脱条件温和,对捕获的物质损害小。
实施例3-2~3-15 捕获筛的制备
实施例3-2~3-15中捕获筛的制备方法与实施例3-1基本一致,区别点在于实施例中对应采用的是实施例1-2~1-15中制备得到的巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸,如实施例3-2中采用的巯基化物质为实施例1-2中制备得到的巯基化海藻酸钠,实施例3-7中采用的巯基化物质为实施例1-7中制备得到的巯基化透明质酸。
实施例4 循环肿瘤细胞的捕获和洗脱
步骤一:从12孔板中取出实施例3-1~3-15中制备得到的捕获筛,捕获筛的表面通过巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸偶联有EPCAM抗体。加入0.05M,pH=6.0的MES溶液润洗后,将捕获筛转移至24孔板内,每孔加入300uL,1%的BSA溶液,封闭1h。
步骤二:封闭反应结束后,用PBS清洗捕获筛。清洗后的捕获筛放入与捕获筛适配的夹具中,向夹具注入300uL含有明确数量的循环肿瘤细胞以及背景细胞的PBS溶液。其中循环肿瘤细胞已经采用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)进行了染色,便于后续显微镜下观察。
步骤三:在夹具的下端施加负压,用蠕动泵以50uL/min的以固定速率缓慢抽取样本,此为本领域常规的手段与条件。
步骤四:循环肿瘤细胞的捕获计数。取出步骤三中的捕获筛,在荧光显微镜下以蓝色激发光观察捕获筛捕获的细胞并计数,如图2所示。捕获结果如表1所示。捕获率为捕获筛捕获到的循环肿瘤细胞占一开始注入的循环肿瘤细胞总数的比率。
步骤五:循环肿瘤细胞的洗脱。加入海藻酸钠裂解酶或透明质酸裂解酶至捕获了循环肿瘤细胞(CTC)的捕获筛上,静置作用1-5h;反应结束后,用移液器吹打捕获筛使其上的循环肿瘤细胞脱落。洗脱结果如表1所示。洗脱率为洗脱下来的循环肿瘤细胞占捕获筛捕获到的循环肿瘤细胞数的比率。
表1 循环肿瘤细胞的捕获结果和洗脱结果
实施例 | 巯基化物质 | 巯基化率(%) | 海藻酸钠或透明质酸的分子量(kDa) | 平均捕获率(%) | 平均洗脱率(%) |
3-1 | 巯基化海藻酸钠 | 15 | 34 | 85.4 | 87.6 |
3-2 | 巯基化海藻酸钠 | 20 | 20 | 89.5 | 90.6 |
3-3 | 巯基化海藻酸钠 | 26 | 34 | 96.3 | 98.3 |
3-4 | 巯基化海藻酸钠 | 30 | 20 | 90.5 | 89.5 |
3-5 | 巯基化海藻酸钠 | 40 | 20 | 85.2 | 83.4 |
3-6 | 巯基化海藻酸钠 | 54 | 34 | 66.5 | 80.3 |
3-7 | 巯基化透明质酸 | 26 | 3 | 88.5 | 85.3 |
3-8 | 巯基化透明质酸 | 26 | 5 | 93.2 | 92.5 |
3-9 | 巯基化海藻酸钠 | 26 | 6.521 | 96.5 | 98.2 |
3-10 | 巯基化透明质酸 | 26 | 10 | 96.5 | 94.6 |
3-11 | 巯基化海藻酸钠 | 26 | 20 | 97.0 | 98.2 |
3-12 | 巯基化透明质酸 | 26 | 40 | 88.3 | 85.3 |
3-13 | 巯基化透明质酸 | 26 | 65 | 75.8 | 80.5 |
3-14 | 巯基化透明质酸 | 26 | 100 | 68.8 | 75.3 |
3-15 | 巯基化海藻酸钠 | 26 | 1460 | 57.5 | 60.2 |
从表1中可以看出,通过上述方法制备得到的捕获筛在进行循环肿瘤细胞捕获的时候,捕获效率高,后续洗脱方便、洗脱效率高。其中,当巯基化率在20~30%之间、原料分子量在5kDa~35kDa之间时,即实施例3-2~3-4以及实施例3-8~3-11,制备得到的捕获筛的捕获效率以及洗脱效率明显优于其他巯基化率和分子量制备得到的捕获筛的捕获效率和洗脱效率。且当巯基化率为26%,原料分子量在6kDa~34kDa时,捕获效率以及洗脱效率更好。
需要说明的是以上物质的巯基化只是在海藻酸钠或透明质酸的支链上进行了部分基团的取代,所以分子量的变化不会很大。所以上述以原料的分子量进行说明,并通过控制原料的分子量以及透析袋的截留分子量来进一步保证巯基化物质的分子量。
现有技术中的捕获筛用的是Traut's试剂,本发明中用巯基化的海藻酸钠或巯基化的透明质酸偶联筛网骨架和捕获物形成捕获筛,能够用于捕获特定的的物质,如生物分子、细胞等,可以降低捕获筛对白细胞等的非特异性吸附,同时在捕获之后,能够通过裂解酶如海藻酸钠裂解酶或透明质酸裂解酶对巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸进行裂解,将捕获的目标物质洗脱下来,洗脱方便,洗脱效率高,且洗脱条件温和,对捕获的物质破坏小。
以上实施例中未有特别说明的原料均通过商购获得。没有特别提及温度的操作在室温下进行。未有特别说明的操作方法与条件可采用本领域的公知或常规的手段与条件。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围,凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种捕获筛,包括筛网骨架和设置于所述筛网骨架上的捕获物,所述捕获物能够与目标细胞或生物分子特异性结合,其特征在于,所述筛网骨架具有金属原子,所述的筛网骨架和所述捕获物之间通过巯基化物质连接,其中巯基化物质与所述筛网骨架通过反应形成金属-硫键而结合,巯基化物质与所述捕获物通过反应形成酰胺键而结合;所述巯基化物质为巯基化海藻酸钠和巯基化透明质酸中的一种或两种的组合;所述巯基化物质的巯基化率为20~30%。
2.根据权利要求1所述的捕获筛,其特征在于,所述捕获物上具有氨基,所述巯基化物质上具有羧基,所述捕获物与所述巯基化物质通过氨基和羧基反应形成酰胺键而结合。
3.根据权利要求1所述的捕获筛,其特征在于,所述巯基化物质的巯基化率为25~30%。
4.根据权利要求1所述的捕获筛,其特征在于,所述巯基化物质的分子量为5kDa~35kDa。
5.根据权利要求3所述的捕获筛,其特征在于,所述巯基化物质的分子量为6kDa~34kDa。
6.根据权利要求5所述的捕获筛,其特征在于,所述巯基化物质的巯基化率为25~30%,所述巯基化物质的分子量为6kDa~34kDa。
7.根据权利要求1所述的捕获筛,其特征在于,所述金属原子为金原子,所述金属-硫键为金-硫键。
8.根据权利要求1所述的捕获筛,其特征在于,所述巯基化物质是由海藻酸钠和/或透明质酸与含有氨基的二硫代化合物在羧基活化剂的存在下反应后的产物经二硫键还原剂还原后得到。
9.根据权利要求8所述的捕获筛,其特征在于,所述海藻酸钠和/或透明质酸的分子量为5kDa~40kDa,所述的含有氨基的二硫代化合物为3,3'-二硫代二(丙酸肼),所述羧基活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺,所述二硫键还原剂为三(2-羰基乙基)磷盐酸盐。
10.根据权利要求8或9所述的捕获筛,其特征在于,含有氨基的二硫代化合物与海藻酸钠和/或透明质酸的摩尔比为3~5:1;所述二硫键还原剂、羧基活化剂与海藻酸钠和/或透明质酸的摩尔比为15~16:1.5~2.5:1。
11.根据权利要求1所述的捕获筛,其特征在于,所述捕获物为上皮细胞粘附分子抗体,所述捕获筛用于捕获循环肿瘤细胞。
12.一种如权利要求1-11任意一项所述的捕获筛的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将筛网骨架与含有巯基化物质的溶液接触,所述筛网骨架上的金属原子与巯基化物质反应,使巯基化物质与筛网骨架上的金属原子连接;之后将连接有巯基化物质的筛网骨架与含有捕获物的溶液接触,使捕获物与巯基化物质连接,得到捕获筛。
13.根据权利要求12所述的捕获筛的制备方法,其特征在于,所述含有巯基化物质的溶液还包含三(2-羰基乙基)磷盐酸盐,且所述巯基化物质与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的质量比为1~2.5:1。
14.根据权利要求12所述的捕获筛的制备方法,其特征在于,在加入捕获物溶液前,向连接有巯基化物质的筛网骨架上加入活化试剂并进行孵育;所述活化试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或两种的组合。
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