CN110057877A - 可重复修饰的用于检测肿瘤细胞的生物传感器及其制备法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种可重复修饰的用于检测肿瘤细胞的生物传感器及其制备法。四面体‑适配体通Au‑S键自主装固定于金电极上，从而高效、特异地捕获人乳腺癌细胞。随后将合成的PCN‑224‑Pt/辣根过氧化物酶/双适配体/血红素/G‑四联体新型金属有机框架纳米探针通过适配体与细胞的结合引入到细胞传感界面上，通过辣根过氧化物酶、纳米酶(Pt纳米颗粒)和DNA酶(血红素/G‑四联体)三种酶催化过对苯二酚(HQ)‑过氧化氢(H2O2)。本发明可用于肿瘤细胞的检测，具有高选择性、高灵敏度和简便快速、电极可反复修饰等优点。
Description
技术领域
本发明涉及电化学生物传感器及其制备方法，特别是涉及基于新型金属有机框架和四面体连接双适配体三维纳米结构的、可重复修饰的电化学细胞传感器。属于生物医学技术领域。
背景技术
癌症是当今世界威胁人类生命安全最常见的疾病。众所周知，癌症的早期诊断可有效提高癌症病人的治愈率。准确灵敏地识别、检测肿瘤细胞对于癌症的早期诊断和临床治疗具有重要的意义。目前，用于肿瘤细胞检测的常规方法包括免疫组织化学、流式细胞分析法和逆转录-多聚酶链反应等。尽管这些方法具有较高的普及率，但是这些方法大多操作繁琐、实验成本高、需要专业的操作人员以及先进的仪器设备等。到目前为止，较为引人关注的是电化学检测技术实现肿瘤细胞的超灵敏检测。电化学生物传感器具有操作简单、灵敏度高和检测迅速等优点，非常适合用来进行肿瘤细胞检测。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种基于金属有机框架和四面体连接双适配体的可反复修饰的电化学细胞传感器。本发明的目的之二在于该传感器的制备方法及应用于肿瘤细胞的检测。
为了实现以上目的，本发明的可重复修饰的用于检测肿瘤细胞的生物传感器，以金电极作为检测界面，四面体连接双适配体通过金硫键结合在金电极表面，PCN-224-Pt/辣根过氧化物酶/双适配体/血红素/G-四联体新型金属有机框架纳米探针通过适配体捕获细胞而连接到细胞传感界面。
本发明的可重复修饰的用于检测肿瘤细胞的生物传感器的制备方法为：四面体-适配体通Au-S键自主装固定于金电极上，从而高效、特异地捕获人乳腺癌细胞。随后将合成的PCN-224-Pt/辣根过氧化物酶/双适配体/血红素/G-四联体新型金属有机框架纳米探针通过适配体与细胞的结合引入到细胞传感界面上，通过辣根过氧化物酶、纳米酶(Pt纳米颗粒)和DNA酶(血红素/G-四联体)三种酶催化过对苯二酚(HQ)-过氧化氢(H2O2)，进一步实现电化学信号的放大。实验结束后，外加电压破坏Au-S键并重新生成裸的金电极表面，可用于重新、反复修饰。具体以下步骤：
(1)金电极的前处理：金电极首先用食人鱼洗液浸泡15min，然后置于打磨布上进行打磨，超声处理后，再用0.5M的硫酸活化直到信号稳定。
(2)四面体连接的适配体的固定：分别取10μM的四面体单链连接的适配体AS1411-A、四面体单链AS1411-B、AS1411-C和AS1411-D于四支PCR管中，各加入等体积1mM的三氯乙基磷酸酯，反应1h。上述溶液均混合于同一PCR管中，于95℃条件下反应10min，马上降温至4℃条件下反应10min，可得四面体连接的适配体AS1411三维结构。四面体连接的适配体MUC1三维结构用MUC1-A、MUC1-B、MUC1-C和MUC1-D同法可得。取10μL两种适配体溶液滴加到前处理过的金电极，于37℃条件下反应3h。两种适配体通过Au-S键自主装固定于金电极上，可高效、特异性地捕获人乳腺癌细胞MCF-7。
所述的AS1411三维结构的四面体单链连接的适配体AS1411-A的序列为：5’-ACATTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT ATT TTTTTT TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3’。
所述的MUC1三维结构的的四面体单链连接的适配体MUC1-A的序列为：5’-ACA TTCCTA AGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT ATT TTT TTTTTG CAG TTG ATC CTT TGG ATA CCC TGG-3’。
所述的AS1411三维结构和MUC1三维结构的四面体单链B的序列为：5’-HS-TAT CACCAG GCA GTT GAC AGT GTA GCAAGC TGT AAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C-3’。
所述的AS1411三维结构和MUC1三维结构的四面体单链C的序列为：5’-HS-TCA ACTGCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACG TGG GAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C-3’。
所述的AS1411三维结构和MUC1三维结构的四面体单链D的序列为：5’-HS-TTC AGACTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACC CTC GCA T-3’。
(3)多功能纳米探针的固定：随后将合成的DNA酶(G-四联体/血红素)-双适配体-PCN-224-Pt颗粒-辣根过氧化物酶纳米探针引入到不同细胞浓度(20，1×102，1×103，1×104，1×105，1×106和1×107cells/mL)的传感界面上，于37℃反应1h。随后将电极置于含有3mM HQ和1.5mM H2O2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中，反应5min，然后进行差示脉冲伏安法扫描。
所述的AS1411适配体的序列为：5’-HS-(CH2)6-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-TTTTTT-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’。
所述的MUC1适配体的序列为：5’-HS-(CH2)6-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-TTTTTT-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3’。
(4)金电极的重复修饰：实验结束后，外加电压-1.7～-0.9V破坏Au-S键并重新生成裸的金电极表面，可用于重新、反复修饰。
由于本电化学细胞传感器具有双重信号放大作用，因此可以实现乳腺癌细胞的超灵敏检测，在20～1×107cells/mL范围内具有良好的线性、选择性和重现性，检出限为6cells/mL，并且成功运用于血液样本的检测。
本发明的有益效果是：本发明构建了一种可重复修饰的电化学细胞传感器。该传感器利用双重信号放大的策略实现对乳腺癌细胞的检测，具有灵敏度高，选择性好和简便快捷等优点。同时用电化学解脱方法实现金电极的重复修饰，在癌症的前期诊断方面具有很好的响应应用前景。
附图说明
图1为电化学细胞传感器的原理示意图。
图2为金属有机框架PCN-224的透射电镜表征图(A)和金属有机框架PCN-224-Pt颗粒的透射电镜表征图(B)。
图3为金属有机框架PCN-224的电子能谱图(A)和金属有机框架PCN-224-Pt颗粒的电子能谱图(B)。
图4为四面体和适配体的琼脂糖电泳的表征图。
图5为适配体比例优化(A)、细胞孵育时间优化(B)和探孵育时间优化(C)。
图6为修饰电极与癌细胞反应后的DPV响应图：a-g：20，1×102，1×103，1×104，1×105，1×106and 1×107cells/mL(A)、不同细胞浓度与相应峰电流的线性曲线(B)和不同细胞的的DPV响应图(C)。
图7为电化学传感器解脱原理图(A)、解脱后的细胞台盼蓝染色图(B)和裸露的金电极与重新生成的金电极的阻抗图(C)。
图1中，(1)为AS1411适配体，(2)为MUC1适配体，(3)为辣根过氧化物酶，(4)为血红素，(5)为金电极，(6)为DNA四面体-AS1411适配体，(7)为DNA四面体-MUC1适配体，(8)为巯基己醇，(9)为MCF-7细胞。
图7中，(10)为收集的细胞，(11)为显微镜，(12)为再生的电极，(13)为阻抗示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方案进一步阐述本发明，以下实施例有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但并不限制本发明的保护范围。
实施例一：细胞传感器纳米探针的制备
在圆底烧瓶中加入0.15g ZrOCl2·8H2O、0.05g磷酸三氯丙脂(TCPP)、1.4g苯甲酸和50mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，在90℃下搅拌反应5h。之后，在12000rpm离心30min，用DMF彻底洗涤三次。产物保存在DMF溶液中，避光。随后，将1mL H2PtCl6(19.31mM)加入到PCN-224纳米颗粒(2.5mg mL-1)中，在20mL水中搅拌1h。然后，在剧烈搅拌下加入2mL NaBH4(4mgmL-1)，再搅拌3h，得到PCN-224-Pt纳米颗粒。最后将混合物离心并用水洗涤3次。得到的PCN-224-Pt粒子再分散于水中，其中一些用于验证化合物的准确性和催化性能，另一些用于合成杂化纳米探针。利用扫描电子显微镜(SEM)和电子能谱图(EDS)方法对PCN-224-Pt纳米材料的制备进行了验证，结果见图2和图3。通过观察H2O2在PCN-224-Pt中的催化分解生成氧，测定了PCN-224-Pt的催化性能。
将1mg PCN-224-Pt纳米粒子再分散在1mL PBS pH 9缓冲溶液中。然后在溶液中加入50μL HRP(1mg mL-1)、25μL AS1411适配体(5μM)和25μL MUC1适配体(5μM)，在4℃下搅拌反应24h。随后，将血红素(0.1mg)在4℃下与PBS pH 7.4缓冲液混合2h，离心除去上清液后，用PBS缓冲液清洗。制备的PCN-224-Pt/HRP/双适配体/血红素/G-四联体杂化纳米探针，最后保存在PBS缓冲液中，4℃保存。
实施例二：四面体-适配体的制备
分别取10μM的四面体单链连接的适配体AS1411-A、四面体单链AS1411-B、AS1411-C和AS1411-D于四支PCR管中，各加入等体积1mM的三氯乙基磷酸酯，反应1h。上述溶液均混合于同一PCR管中，于95℃条件下反应10min，马上降温至4℃条件下反应10min，可得四面体连接的适配体AS1411三维结构。四面体连接的适配体MUC1三维结构用MUC1-A、MUC1-B、MUC1-C和MUC1-D同法可得。采用3％琼脂糖凝胶对制备的四面体进行表征。在室温下在100V下进行电泳75min。分离后，使用荧光凝胶成像***对凝胶进行成像，结果见图4。
实施例三：传感器的制备
将金电极用食人鱼洗液浸泡15min过后，用水冲洗干净，然后用0.05μm的氧化铝混悬液进行打磨，继而进行超声，乙醇和去离子水各3min。再用0.5M的硫酸活化直到信号稳定，硫酸活化范围为-0.2至1.5V。然后将一定浓度的特异性四面体-适配体溶液滴加到电极上，于4℃条件下，放置过夜。然后取出电极，用超纯水进行冲洗。储存时也要浸泡于超纯水中，置于4℃条件下。
实施例四：肿瘤细胞检测的条件优化
考虑到MCF-7细胞在适配体探针上的多重结合位点，MUC1和AS141适配体都可以作为检测探针。为了获得更高的灵敏度，本发明使用了不同比例的适配体MUC1和AS1411(0∶1、1∶0、1∶1、1∶2、2∶1)进行优化，结果见图5中A图。单一的核酸适配体限制了MCF-7细胞表面结合位点，由于检测探针响应性降低，因此，基于MUC1或者AS1411适配体的传感器表现出相对较低的响应性(1∶0，0∶1)。在使用MUC1和AS1411适配体1∶1时，结果得到了最好的响应。此外，MUC1和AS1411的2∶1或1∶2比例，响应值均低于1∶1的比例。基于这些发现，本发明选择了MUC1和AS1411以1∶1比例制备用于进一步实验。
本发明研究了细胞在金电极上的孵育时间，电极在细胞溶液中孵育不同时间(30、40、50、60和70min)。图5中B图表明，最大信号在60min时达到，因此选择60min作为最佳细胞培养时间。本发明还研究了纳米探针的孵育时间(40、50、60、70和80min)对DPV响应的分析性能。图5中C图表明，随着纳米探针孵育时间从40min增加到70min信号增强，在70min达到转折点，因此，该细胞传感器的最佳纳米探针孵育时间是70min。
实施例五：肿瘤细胞检测过程
随后将合成的DNA酶-适配体-纳米铂-辣根过氧化物酶纳米探针引入到不同细胞浓度的传感界面上，于37℃反应1h。随后将电极置于含有3mM HQ和1.5mM H2O2的PBS溶液中，反应5min，然后进行差示脉冲伏安法扫描。分析结果表明，DPV响应(Δip)与细胞浓度对数在20至1×107cells/mL.呈线性相关，线性回归方程为Δip(μA)＝-2.6776+4.18651gCcell(cells/mL)(R2＝0.9989)。Δip是峰值电流变化值，表示为Δip＝I-I0，其中I和I0分别是存在和不存在癌细胞的细胞传感器的DPV峰值电流。结果如图6中的A图和B图。用3σ的方法计算得MCF-7细胞的检测限为6cells/mL。以HepG2人肝癌细胞、HCT116人结直肠癌细胞、B16鼠黑色素瘤细胞三种细胞系和无细胞溶液作为对照，采用相同的方法在PBS缓冲液中验证细胞传感器的选择性，发现只有含MCF-7细胞时电化学信号变化明显。此外，该方法对血液中MCF-7细胞的可行性进行了验证，结果如图6中的C图。
实施例六：金电极的重复利用
电化学检测后，采用负电压脉冲破坏金电极与DNA四面体之间的化学键，释放被电极捕获的MCF-7细胞，原理见图7中A图。在PBS(10mM，pH 7.4)溶液中从-0.9至-1.7V进行循环伏安法扫描，扫描频率为50mV s-1。将从金电极中释放出来的MCF-7细胞在1000rpm离心5min，测定细胞活力。细胞置于台盼蓝溶液(0.04％，w/w)中染色3min，观察死其在显微镜下的存活情况。活细胞没有被染色，而死细胞由于细胞膜通透性增加，会与台盼蓝作用染成蓝色，结果见图7中B图。用电化学阻抗法对所获得的金电极检测其阻抗的大小来判断是否可以重复利用，结果见图7中C图。
Claims (7)
1.一种可重复修饰的用于检测肿瘤细胞的生物传感器，其特征在于，以金电极作为检测界面，四面体连接双适配体通过金硫键结合在金电极表面，纳米探针通过适配体捕获细胞而连接到细胞传感界面。
2.根据权利要求1所述的一种可重复修饰的用于检测肿瘤细胞的生物传感器，其特征在于，四面体连接双适配体(AS1411-A和MUC1-A)通过金硫键结合在金电极表面。
3.根据权利要求1或2所述的一种可重复修饰的用于检测肿瘤细胞的生物传感器，其特征在于，适配体MUC1和AS1411的比例1∶1时最佳。
4.根据权利要求1所述的一种可重复修饰的用于检测肿瘤细胞的生物传感器，其特征在于，纳米探针集合新型金属有机框架PCN-224-Pt、辣根过氧化物酶、双适配体、血红素、G-四联体于一体。
5.一种可重复修饰的用于检测肿瘤细胞的生物传感器的制备法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)金电极的前处理：金电极首先用食人鱼洗液浸泡15分钟，然后置于打磨布上进行打磨，超声处理后，再用0.5M的硫酸活化直到信号稳定；
(2)四面体连接的适配体的固定：分别取10μM的四面体单链连接的适配体AS1411-A、四面体单链AS1411-B、AS1411-C和AS1411-D于四支PCR管中，各加入等体积1mM的三氯乙基磷酸酯，反应1h。上述溶液均混合于同一PCR管中，于95℃条件下反应10min，马上降温至4℃条件下反应10min，可得四面体连接的适配体AS1411三维结构。四面体连接的适配体MUC1三维结构用MUC1-A、MUC1-B、MUC1-C和MUC1-D同法可得。取10μL两种适配体溶液滴加到前处理过的金电极，于37℃条件下反应3h。两种适配体通过Au-S键自主装固定于金电极上，可高效、特异性地捕获人乳腺癌细胞MCF-7；
所述的AS1411三维结构的四面体单链连接的适配体AS1411-A的序列为：5’-ACA TTCCTA AGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT ATT TTT TTTTTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3’；
所述的MUC1三维结构的的四面体单链连接的适配体MUC1-A的序列为：5’-ACA TTC CTAAGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT ATT TTT TTT TTGCAG TTG ATC CTT TGG ATA CCC TGG-3’；
所述的AS1411三维结构和MUC1三维结构的四面体单链B的序列为：5’-HS-TAT CAC CAGGCA GTT GAC AGT GTA GCA AGC TGT AAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C-3’；
所述的AS1411三维结构和MUC1三维结构的四面体单链C的序列为：5’-HS-TCA ACT GCCTGG TGA TAA AAC GAC ACT ACG TGG GAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C-3’；
所述的AS1411三维结构和MUC1三维结构的四面体单链D的序列为：5’-HS-TTC AGA CTTAGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACC CTC GCA T-3’；
(3)多功能纳米探针的固定：随后将合成的DNA酶(G-四联体/血红素)-双适配体-PCN-224-Pt颗粒-辣根过氧化物酶纳米探针引入到不同细胞浓度的传感界面上，于37℃反应1小时。随后将电极置于含有3mM对苯二酚和1.5mM过氧化氢的PBS溶液中，反应5分钟，然后进行差示脉冲伏安法扫描；
所述的AS1411适配体的序列为：5’-HS-(CH2)6-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-TTTTTT-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’；
所述的MUC1适配体的序列为：5’-HS-(CH2)6-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-TTTTTT-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3’；
(4)金电极的重复修饰：实验结束后，外加电压-1.7～-0.9V破坏Au-S键并重新生成裸的金电极表面，用于重新、反复修饰。
6.根据权利要求5所述的可重复修饰的用于检测肿瘤细胞的生物传感器的制备法，其特征在于，步骤(3)所述的不同细胞浓度为20，1×102，1×103，1×104，1×105，1×106和1×107cells/mL。
7.根据权利要求5所述的可重复修饰的用于检测肿瘤细胞的生物传感器的制备法，其特征在于，步骤(4)所述的缓冲液：10mM PBS(pH 7.4)，扫描速度：50mV/s，扫描范围：-0.9～-1.7V。
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