CN115521851A - 适于捕获稀有细胞的捕获装置及其制备方法 - Google Patents

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CN115521851A CN202210958851.1A CN202210958851A CN115521851A CN 115521851 A CN115521851 A CN 115521851A CN 202210958851 A CN202210958851 A CN 202210958851A CN 115521851 A CN115521851 A CN 115521851A
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颜菁
侯舒捷
彭靖元
王伟
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Jiangsu Huixian Pharmaceutical Technology Co ltd
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Jiangsu Huixian Pharmaceutical Technology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种适于捕获稀有细胞的捕获装置及其制备方法。一种适于捕获稀有细胞的捕获装置，包括至少表层为金属的基材、设于所述基材表面的涂层及连接于所述涂层的捕获物，所述捕获物能够特异性地和目标稀有细胞结合，所述涂层包括巯基聚乙二醇羧基和巯基化物。本发明能够降低背景细胞、蛋白的非特异性吸附，提高所捕获的靶细胞的纯度。

Description

适于捕获稀有细胞的捕获装置及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种适于捕获稀有细胞的捕获装置及其制备方法。
背景技术
稀有细胞是指生物样本中存在的数量稀少却具有重要生物学功能或临床检测意义的 细胞。稀有细胞的传统捕获方法有Cell Search类的免疫捕获富集、物理富集等。在稀有 细胞的富集过程中，背景/杂细胞干扰稀有细胞的捕获及判断，同时影响到捕获到稀有细 胞的纯度。目前，一些捕获筛等捕获装置上添加有物理涂层和化学涂层来提高细胞的捕获效率，其中，物理涂层的结合强度低；而化学涂层不可逆，捕获的稀有细胞释放困难； 另一方面，在捕获靶细胞的同时，背景细胞也会吸附到捕获筛上，所捕获的稀有细胞的 纯度较低；此外，捕获装置会对稀有细胞有不同程度的损伤；这些因素都会影响捕获细 胞的活性及下游应用。
本申请人于2020年提出了一种捕获筛，参见CN111175503A，该捕获筛包括筛网骨架和设置于所述筛网骨架上的捕获物，所述捕获物能够与目标细胞或生物分子特异性结合，所述筛网骨架具有金属原子，所述的筛网骨架和所述捕获物之间通过巯基化物质连接，其中巯基化物质与所述筛网骨架通过反应形成金属-硫键而结合，巯基化物质与所述捕获物通过反应形成酰胺键而结合；所述巯基化物质为巯基化海藻酸钠和巯基化透明质酸中的一种或两种的组合。该捕获筛能够方便地将捕获的细胞洗脱，但是用于富集稀有 细胞时，背景细胞也会吸附到捕获筛上，捕获的目标稀有细胞的纯度较低。
发明内容
针对上述技术问题中的至少一个，本发明的目的是提供一种适于捕获稀有细胞的捕 获装置及其制备方法，该装置能够降低背景细胞、蛋白的非特异性吸附，提高所捕获的靶细胞的纯度。
本发明的第一个方面提供一种适于捕获稀有细胞的捕获装置，包括至少表层为金属 的基材、设于所述基材表面的涂层及连接于所述涂层的捕获物，所述捕获物能够特异性地和目标稀有细胞结合，所述涂层包括巯基聚乙二醇羧基和巯基化物。
优选地，所述巯基聚乙二醇羧基和巯基化物的投料重量比为12：1～1：2。更优选地， 所述巯基聚乙二醇羧基和巯基化物的重量比为10：1～1：2，进一步为5：1～1：1，更进一步为2：1～1：1。
优选地，所述巯基聚乙二醇羧基的重均分子量为0.11～29kDa。更优选地，所述巯基 聚乙二醇羧基由具有两种或两种以上的重均分子量的巯基聚乙二醇羧基构成。进一步地， 第一种巯基聚乙二醇羧基的重均分子量为11～29kDa，优选为15～25kDa；第二种巯基聚乙 二醇羧基的重均分子量为1.1～2.9kDa，优选为1.5～2.5kDa；第三种巯基聚乙二醇羧基的重 均分子量为0.11～0.29kDa，优选为0.15～0.25kDa。
在一具体且优选的实施例中，所述巯基聚乙二醇羧基包括具有第一重均分子量的巯 基聚乙二醇羧基和具有第二重均分子量的巯基聚乙二醇羧基，第一重均分子量为 11～29kDa，第二重均分子量为1～9kDa。更优选地，具有第一重均分子量的巯基聚乙二醇 羧基和具有第二重均分子量的巯基聚乙二醇羧基的摩尔比为(1～3):(1～3)，更优选为 (1～2)：(1～2)。具有第一重均分子量的巯基聚乙二醇羧基和具有第二重均分子量的巯基 聚乙二醇羧基的摩尔比可以为1:2、1:1、2:1、1:3或3:1。
在另一具体且优选的实施例中，所述巯基聚乙二醇羧基还包括具有第三重均分子量 的巯基聚乙二醇羧基，第三重均分子量为0.1～0.9kDa。进一步地，具有第一重均分子量的 巯基聚乙二醇羧基、具有第二重均分子量的巯基聚乙二醇羧基、及具有第三重均分子量的巯基聚乙二醇羧基的重量比/摩尔比为(1～3)：(1～3)：(1～3)，例如1:1:1、1:2:1、1:2:2、 2:1:1、2:2:1或2:1:2。
优选地，所述巯基化物包括巯基化透明质酸钠或巯基化海藻酸钠。该涂层可被裂解， 从而便于将捕获到的细胞从基材上洗脱下来，且不会损伤到细胞，具有较高的洗脱效率。
优选地，所述巯基化物的巯基化率为5～45％，所述巯基化物的分子量为5～200kDa。
更优选地，所述巯基化物的巯基化率为15～25％，所述巯基化物的分子量为9～39kDa。
可选地，所述基材包括筛网、板或微流控芯片。所述基材的表层为金属；或，所述基材由金属或金属合金制成。
在一具体且优选的实施例中，所述基材为筛网。更优选地，所述筛网的孔径为10 μm～50μm。进一步地，所述筛网的孔径为10μm～20μm，适于免疫细胞的捕获。
在一更优选的实施例中，所述筛网为不锈钢筛网。
在另一更优选的实施例中，所述筛网包括不锈钢筛网骨架及覆于所述筛网骨架上的 保护层，所述保护层为贵金属层。进一步地，所述保护层为金层。
优选地，所述捕获物包括蛋白、核酸中的至少一种。更优选地，所述蛋白包括抗体。进一步地，所述抗体包括panCK抗体、EPCAM抗体、CD3抗体中的至少一种。稀有细 胞等被捕获物能够与抗体特异性结合而被抗体等捕获物捕获到装置中，然后通过对涂层 裂解，将捕获到的稀有细胞从基材上洗脱下来，用于后续分析、下游应用等。
优选地，所述涂层由由巯基聚乙二醇羧基和巯基化物的混合液孵育形成。
优选地，所述巯基化物的固含量为1～20％。更优选地，所述巯基化物的固含量为5％～20％，进一步为8～15％，更进一步为10～15％。调整巯基化物的固含量能够调整涂层的厚度。
优选地，所述巯基化物由如下步骤制得：将透明质酸钠和/或海藻酸钠溶于缓冲溶液 中，加入含氨基的二硫代化合物和羧基活化剂搅拌反应，然后加入二硫键还原剂，制得所述巯基化物。更优选地，将透明质酸钠和/或海藻酸钠溶于2-吗啉乙磺酸溶液中，加入 3,3'-二硫代二(丙酸肼)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌至完全溶解并搅拌反应，反应结束后，加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐。
优选地，所述稀有细胞为免疫细胞。
在一具体且优选的实施例中，所述基材为筛网，所述筛网包括不锈钢筛网骨架和孵 育所述不锈钢筛网骨架表面上的金层，所述筛网的孔径为10μm～50μm；所述涂层包括巯基聚乙二醇羧基和巯基化透明质酸钠，所述巯基聚乙二醇羧基包括重均分子量为 15～25kDa的巯基聚乙二醇羧基、重均分子量为1.5～2.5kDa的巯基聚乙二醇羧基及重均分 子量为0.1～0.9kDa的巯基聚乙二醇羧基；所述捕获物为能够和免疫细胞特异性结合的抗体。
本发明还提供一种上述适于捕获稀有细胞的捕获装置的制备方法，包括如下步骤： 在基材表面上先孵育巯基化物再孵育巯基聚乙二醇羧基，或在基材表面上先孵育巯基聚 乙二醇羧基再孵育巯基化物，以在基材表面上形成涂层；在涂层上连接捕获物。
优选地，孵育时进行振荡，振荡速率为180～220rpm，孵育时间为1～3h。
更优选地，所述捕获物由如下步骤连接至所述涂层上：将覆有所述涂层的基材冻干， 洗涤；将N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶于2-吗啉乙磺酸溶液中得第一溶液，将1-(3-二甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于2-吗啉乙磺酸溶液中得第二溶液，将所述第一溶液和所 述第二溶液混合得共混活化剂溶液；使所述共混活化剂溶液和所述基材接触，静置孵育； 制备含有捕获物的孵育液并进行孵育，将所述捕获物孵育至所述涂层上。
本文中，稀有细胞是指在血液和组织中的含量很少但却很重要的细胞，例如PBMC中的各类免疫细胞、T细胞、CAR-T细胞、循环胎儿细胞、有核红细胞、干细胞、循环 肿瘤细胞等。
本文中，所述装置包括但不限于捕获筛、捕获芯片。
本发明采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：
本发明的捕获装置，在金属基层的表面设置包括巯基聚乙二醇羧基和巯基化物的涂 层，一方面，可以通过降低背景细胞、蛋白的非特异性吸附，从而间接提高靶细胞的纯度；另一方面，该涂层的功能基团可以进一步活化，偶联抗体，与靶细胞上抗原特异性 反应，而特异性捕获靶细胞，直接提高靶细胞的纯度；通过上述两方面协同作用，在保 证靶细胞的捕获效率的前提下，降低背景细胞、蛋白的非特异性吸附，提高所捕获的靶 细胞的纯度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作 简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a、1b、1c、1d分别示出了对比例、实施例1、实施例3、实施例4的捕获筛上吸 附的背景细胞的显微镜照片。
图2示出了实施例11的捕获筛的区域A的荧光及明场图像。
图3示出了对比例2的捕获筛的区域A的荧光及明场图像。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更 易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。
如本说明书和权利要求书中所示，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步 骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其他的步骤或元素。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的组合。
实施例1：细胞捕获筛的制备
(1)取裁剪好的不锈钢镀金筛网先用乙醇泡洗2min，然后将其转移至盛有体积比为5:1:1的水、25％氨水、30％双氧水(清洗溶液现配现用)混合溶液的干净玻璃烧杯中，烧杯封口后放入油浴锅75℃定时加热5min，清洗完成后，去离子水、乙醇、乙醇依次泡洗 筛网，随后将筛网取出后用高纯氮气吹干。
(2)取3mL巯基化透明质酸钠(HA，5mg/mL)，加入5mL EP管内。随后向EP管 内加入18片清洗处理过的不锈钢镀金筛网，振荡器上以200rpm共混孵育2h，取出筛网 备用。
(3)取3mL巯基聚乙二醇羧基(HS-PEG-COOH(分子量Mw＝20K Da))溶液 (5mg/mL)，加入5mL EP管内。随后向EP管内加入上一步处理好的筛网，振荡器上以 200rpm共混孵育1h。
(4)用3mL PBS溶液以反复润洗(3次置换洗涤)的方法，将HA和HS-PEG-COOH 孵育完成的高分子筛网进行清洗。随后吸去筛网表面液体，并放置在24孔板中心位置。
(5)一张高分子筛网的活化需取0.348mg的Sulfo-NHS(中文名：N-羟基硫代琥珀酰亚胺)溶解于20μL 2-吗啉乙磺酸溶液中(0.05M、pH＝6)，再将0.609mg的EDC(1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶于35μL的2-吗啉乙磺酸缓冲液，充分溶解后 将两者共混得55μL共混活化剂溶液。然后，取共混活化剂溶液，滴加在筛网表面，静置 遮光室温孵育30min。用500μL磷酸盐缓冲溶液溶液2次置换洗涤，清洗活化好的芯片。 随后吸去洗涤置换后筛网表面液体，并放置在新的24孔板中。
(6)2μL CD3抗体与50μL MES溶液(0.05M、pH＝6)共混后制备成抗体孵育液。向 芯片所在孔板中加入上述制备的抗体孵育液共52μL，在37℃下孵育1.5h。
实施例2：细胞捕获筛的制备
本实施例基本同实施例1，区别仅在于步骤(2)和(3)不同，这两个步骤具体如 下：
(2)取3mL HS-PEG-COOH(分子量Mw＝2K Da)溶液(5mg/mL)，加入5mL EP管内。 随后向EP管内加入12片清洗处理过的筛网，振荡器上以200rpm共混孵育1h，将筛网取 出备用。
(3)取3mL巯基化透明质酸钠，加入5mL EP管内。随后向EP管内加入上一步处 理好的筛网，振荡器上以200rpm共混孵育2h。
实施例3：细胞捕获筛的制备
本实施例基本同实施例1，区别仅在于步骤(2)和(3)不同，这两个步骤具体如 下：
(2)取3mL巯基化透明质酸钠，加入5mL EP管内。随后向EP管内加入18片清 洗处理过的筛网，振荡器上以200rpm共混孵育2h，筛网取出备用。
(3)取2mL HS-PEG-COOH(分子量Mw＝20K Da)溶液(5mg/mL)和1mL HS-PEG- COOH(分子量Mw＝2K Da)溶液(5mg/mL)共3mL，加入5mL EP管内。随后向EP管内加 入上一步处理好的筛网，振荡器上以200rpm共混孵育1h。
实施例4：细胞捕获筛的制备
本实施例基本同实施例1，区别仅在于步骤(2)和(3)不同，这两个步骤具体如 下：
(2)取3mL巯基化透明质酸钠，加入5mL EP管内。随后向EP管内加入18片清 洗处理过的筛网，振荡器上以200rpm共混孵育2h，筛网取出备用。
(3)取1mL HS-PEG-COOH(分子量Mw＝20K Da)溶液(5mg/mL)和2mL HS-PEG- COOH(分子量Mw＝2K Da)溶液(5mg/mL)共3mL，加入5mL EP管内。随后向EP管内加 入上一步处理好的筛网，振荡器上以200rpm共混孵育1h。
实施例5：细胞捕获筛的制备
本实施例基本同实施例1，区别仅在于步骤(2)和(3)不同，这两个步骤具体如 下：
(2)取3mL自合成并已验证的巯基化透明质酸钠，加入5mL EP管内。随后向EP 管内加入18片清洗处理过的筛网，振荡器上以200rpm共混孵育2h，筛网取出备用。
(3)取1mL HS-PEG-COOH(分子量Mw＝20K Da)溶液(5mg/mL)、1mL HS-PEG- COOH(分子量Mw＝2K Da)溶液(5mg/mL)和1mL HS-PEG-COOH(分子量Mw＝0.2K Da)溶 液(5mg/mL)共3mL，加入5mL EP管内。随后向EP管内加入上一步处理好的筛网，振荡 器上以200rpm共混孵育1h。
实施例6：细胞捕获筛的制备
本实施例基本同实施例1，区别仅在于步骤(2)和(3)不同，这两个步骤具体如 下：
(2)取3mL自合成并已验证的巯基化透明质酸钠，加入5mL EP管内。随后向EP 管内加入18片清洗处理过的筛网，振荡器上以200rpm共混孵育2h，筛网取出备用。
(3)取1mL HS-PEG-COOH(分子量Mw＝20K Da)溶液(5mg/mL)、1mL HS-PEG- COOH(分子量Mw＝2K Da)溶液(0.5mg/mL)和1mL HS-PEG-COOH(分子量Mw＝0.2K Da)溶 液(0.005mg/mL)共3mL，加入5mL EP管内。随后向EP管内加入上一步处理好的筛网， 振荡器上以200rpm共混孵育1h。
实施例7：细胞捕获筛的制备
本实施例基本同实施例1，区别仅在于步骤(6)不同，该步骤具体如下：
(6)7μL CD3抗体与50μL MES溶液(0.05M、pH＝6)共混后制备成抗体孵育液。向 芯片所在孔板中加入上述制备的抗体孵育液共57μL，在37℃下孵育2h。
对比例1
(1)取裁剪好的不锈钢镀金筛网先用乙醇泡洗2min，然后将其转移至盛有体积比为5:1:1的水、25％氨水、30％双氧水(清洗溶液现配现用)混合溶液的干净玻璃烧杯中，烧杯封口后放入油浴锅75℃定时加热5min，清洗完成后，去离子水、乙醇、乙醇依次泡洗 筛网，随后将筛网取出后用高纯氮气吹干。
(2)取3mL巯基化透明质酸钠(HA，2.5mg/mL)，加入5mL EP管内。随后向EP 管内加入18片清洗处理过的不锈钢镀金筛网，振荡器上以200rpm共混孵育2h。
(3)用3mL PBS溶液以反复润洗(3次置换洗涤)的方法，将HA孵育完成的高分子 筛网进行清洗。随后吸去筛网表面液体，并放置在24孔板中心位置。
(5)取0.348mg的Sulfo-NHS(中文名：N-羟基硫代琥珀酰亚胺)溶解于20μL 2- 吗啉乙磺酸溶液中(0.05M、pH＝6)，再将0.609mg的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳 二亚胺盐酸盐)溶于35μL的2-吗啉乙磺酸缓冲液，充分溶解后将两者共混得55μL共混 活化剂溶液。然后，取共混活化剂溶液，滴加在筛网表面，静置遮光室温孵育30min。用 500μL磷酸盐缓冲溶液溶液2次置换洗涤，清洗活化好的芯片。随后吸去洗涤置换后筛网 表面液体，并放置在新的24孔板中。
(6)2μL CD3抗体与50μL MES溶液(0.05M、pH＝6)共混后制备成抗体孵育液。向 芯片所在孔板中加入上述制备的抗体孵育液共52μL，在37℃下孵育1.5h。
稀有细胞捕获实验1
(1)提供背景细胞
将Jurkat细胞(Ca.2400W/mL)用400目筛网过滤，将细胞滤液收集起来并重新计数， 备用。
(2)提供目标稀有细胞
将MCF7(Ca.10W/1mL)细胞用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE、1μL/10mM)37℃孵育染色10min，孵育结束后加入5mL冷的培养基(DMEM)，室温静置5min中和染 色剂，400g离心5min，丢弃上清。用5mL新的培养基重悬，400g离心5min，并重复一 次。最后，用1mL新的培养基重悬，备用。
(3)捕获筛处理
先用600μL磷酸盐缓冲溶液泡洗1min冻干保存实施例1、3、4及对比例制备的捕获筛，用镊子夹取捕获筛，将捕获筛放在捕获夹具上，夹紧固定，连接装配工装管路。
(4)捕获
取3μL稀释好(1:20倍稀释)的MCF7显微镜下477nm通道观察计数，用100μL磷酸 盐缓冲溶液将计数好的MCF7细胞液冲入离心管中，加入200W/200μL的Jurkat细胞，共 约303μL混合细胞液，加入工装中，以50μL/min速度抽滤捕获。
捕获完成后，取下捕获筛，用荧光显微镜观察背景细胞吸附情况，照片计数。图1a所示为对比例的捕获筛，为未封闭情况，吸附的背景细胞较多；图1b所示为实施例1的 捕获筛，图1c所示为实施例3的捕获筛，图1d所示为实施例4的捕获筛，所吸附的背景 细胞依次减少，以实施例4的捕获筛最优。
实施例8～11
实施例8～11的捕获筛的制备与实施例1的区别在于：
(1)HS-PEG-COOH的分子量及比例，具体参见下表1；
(2)芯片表面孵育的抗体为panCK抗体，而非CD3抗体，且荧光染料通过panCK 抗体连接至目标细胞上。具体地，panCK抗体用Alexa
Figure BDA0003790550850000081
488 37℃孵育染色10min。
其他基本同实施例1。
表1
Figure BDA0003790550850000091
对比例2
对比例2的捕获筛的制备与实施例1的区别在于：
(1)无HS-PEG-COOH，即不锈钢镀金筛网上孵育HA形成涂层，清洗后即用 Sulfo-NHS活化；
(2)芯片表面孵育的抗体为panCK抗体，而非CD3抗体，且荧光染料通过panCK 抗体连接至目标细胞上。具体地，panCK抗体用Alexa
Figure BDA0003790550850000092
488 37℃孵育染色10min。
其他基本同实施例1。
稀有细胞捕获实验2
用实施例8～11和对比例制备的捕获筛按照如下步骤进行细胞捕获实验：
(1)提供背景细胞
将Jurkat细胞(Ca.2400W/mL)用400目筛网过滤，将细胞滤液收集起来并重新计数， 备用。
(2)提供目标稀有细胞
将SKBR3(Ca.10W/1mL)细胞用5mL的培养基重悬，400g离心5min，并重复一次。 最后，用1mL新的培养基重悬，备用。
(3)捕获筛处理
先用600μL磷酸盐缓冲溶液泡洗1min冻干保存实施例8～11和对比例制备的捕获筛， 用镊子夹取捕获筛，将捕获筛放在捕获夹具上，夹紧固定，连接装配工装管路。
(4)捕获
取3μL稀释好(1:20倍稀释)的SKBR3细胞在显微镜下观察计数，用100μL磷酸盐缓冲溶液将计数好的SKBR3细胞液冲入离心管中，加入500W/200μL的Jurkat细胞，共约 303μL混合细胞液，加入工装中，以50μL/min速度抽滤捕获。
捕获完成后，取下捕获筛，转移至荧光倒置显微镜下，先用488nm通道观察计数捕获的SKBR3细胞，拍照计数。计数完成后。用60μL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI、 1μg/mL)室温避光原位染色捕获筛10min，将DAPI染色好的捕获筛重新移至荧光倒置显 微镜下，用385nm通道观察背景细胞吸附情况，拍照计数。
实施例11的捕获筛的荧光图像及对比例2的捕获筛的荧光及明场图像分别参见图2 和图3。图2中，I-1和I-2分别为实施例11的捕获筛的某区域(即为区域A)放大10倍 和20倍后的绿色荧光图像，在该区域A存在一个目标细胞；II-1和II-2分别为实施例11 的捕获筛的区域A放大10倍和20倍后的蓝色荧光图像，在该区域A中的所有有核细胞 (包括目标细胞和背景细胞)被蓝色荧光标示出；III-1和III-2分别为实施例11的捕获筛 的区域A放大10倍和20倍后的明场图像。图3中，I-1和I-2分别为对比例2的捕获筛的 某区域(即为区域A)放大10倍和20倍后的绿色荧光图像，在该区域A存在一个目标 细胞；II-1和II-2分别为对比例2的捕获筛的区域A放大10倍和20倍后的蓝色荧光图像， 在该区域A中的所有有核细胞(包括目标细胞和背景细胞)被蓝色荧光标示出；III-1和 III-2分别为对比例2的捕获筛的区域A放大10倍和20倍后的明场图像。对比图2和图3 的蓝色荧光图像(即II-1及II-2)，对比例2的捕获筛的蓝色荧光图像中的蓝色荧光点的 数量多于实施例11的捕获筛的蓝色荧光图像中的蓝色荧光点的数量；可知，对比例2的 捕获筛上存在较多数量的背景细胞，捕获筛上的目标细胞的纯度较低，而实施例11的捕 获筛上的背景细胞数量较少而目标细胞的纯度较高。
经过捕获实验后的实施例8～11及对比例2的捕获筛上的目标细胞和背景细胞的计数 结果参见下表2。
表2
Figure BDA0003790550850000111
由表2可知，在目标细胞的数量远多于背景细胞的情况下，实施例11的捕获筛在保证目标细胞具有较高的捕获率的同时，残余在捕获筛上背景细胞的数量较少，提高了捕 获后目标细胞的纯度，适于捕获稀有细胞。而对比例2的捕获筛的捕获效率较低，且捕获 筛上吸附的背景细胞数量较多，目标细胞的纯度较低。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于 熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护 范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种适于捕获稀有细胞的捕获装置，包括至少表层为金属的基材、设于所述基材表面的涂层及连接于所述涂层的捕获物，所述捕获物能够特异性地和目标稀有细胞结合，其特征在于，所述涂层包括巯基聚乙二醇羧基和巯基化物。
2.根据权利要求1所述的捕获装置，其特征在于，所述巯基聚乙二醇羧基和巯基化物的投料重量比为12：1～1：2。
3.根据权利要求1所述的捕获装置，其特征在于，所述巯基聚乙二醇羧基的重均分子量为0.11～29kDa。
4.根据权利要求1所述的捕获装置，其特征在于，所述巯基聚乙二醇羧基包括具有第一重均分子量的巯基聚乙二醇羧基和具有第二重均分子量的巯基聚乙二醇羧基，第一重均分子量为11～29kDa，第二重均分子量为1～9kDa。
5.根据权利要求4所述的捕获装置，其特征在于，具有第一重均分子量的巯基聚乙二醇羧基和具有第二重均分子量的巯基聚乙二醇羧基的摩尔比为(1～3)：(1～3)。
6.根据权利要求4所述的捕获装置，其特征在于，所述巯基聚乙二醇羧基还包括具有第三重均分子量的巯基聚乙二醇羧基，第三重均分子量为0.1～0.9kDa，具有第一重均分子量的巯基聚乙二醇羧基、具有第二重均分子量的巯基聚乙二醇羧基、及具有第三重均分子量的巯基聚乙二醇羧基的摩尔比为(1～3)：(1～3)：(1～3)。
7.根据权利要求1所述的捕获装置，其特征在于，所述巯基化物为巯基化透明质酸钠或巯基化海藻酸钠；所述巯基化物的巯基化率为5～45％，所述巯基化物的分子量为5～200kDa。
8.根据权利要求1所述的捕获装置，其特征在于，所述基材包括筛网、板或微流控芯片；和/或，所述捕获物包括蛋白、核酸中的至少一种；和/或，所述稀有细胞为免疫细胞；和/或，所述涂层通过先后在基材的表面上孵育巯基化物和巯基聚乙二醇羧基形成。
9.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述基材为筛网，所述筛网包括不锈钢筛网骨架和孵育所述不锈钢筛网骨架表面上的金层，所述筛网的孔径为10μm～50μm；所述涂层包括巯基聚乙二醇羧基和巯基化透明质酸钠，所述巯基聚乙二醇羧基包括重均分子量为15～25kDa的巯基聚乙二醇羧基、重均分子量为1.5～2.5kDa的巯基聚乙二醇羧基及重均分子量为0.1～0.9kDa的巯基聚乙二醇羧基；所述捕获物为能够和免疫细胞特异性结合的抗体。
10.一种如权利要求1至9任一项所述适于捕获稀有细胞的捕获装置的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在基材表面上先孵育巯基化物再孵育巯基聚乙二醇羧基，或在基材表面上先孵育巯基聚乙二醇羧基再孵育巯基化物，以在基材表面上形成涂层；在涂层上连接捕获物。
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