KR20200059737A - 나노카본-당고분자 복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

나노카본-당고분자 복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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KR20200059737A
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Abstract

본 발명은 표면개질된 나노카본-당고분자 복합체, 이의 제조방법 및 단백질 흡착제 또는 제거제로서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

나노카본-당고분자 복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도{Nanocarbon-polysaccaride composite, preparation method thereof and use the same}
본 발명은 나노카본-당고분자 복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 표면개질된 나노카본-당고분자 복합체, 이의 제조방법 및 단백질 흡착제 또는 제거제로서의 이의 용도에 관한 것이다.
바이러스, 병원체와 같은 검체의 측정은 개별 검체의 신속한 분리, 계수 및 특징 규명을 허용하는 기법을 통해서 이루어진다. 검출 대상(예, 수분) 속에 포함된 검체를 충분히 포집하기 어려우며, 포집된 검체의 변형이 쉽게 발생되기 때문에 대부분의 통상적인 방법은 정확한 정량적 결과를 얻기 위해 검체를 48시간 이상 인큐베이션 하는 기간을 필요로 한다. 미국 특허 제4,565,783호 및 미국 특허 제5,681,712호는 호기성 세균을 배양하고 계수하는 장치를 개시하고 있다. 그러나 상기와 같은 방법은 검체 검출에 오랜 시간이 걸리는 문제가 있으며, 검출 대상 속에 포함된 검체의 양만을 알 수 있을 뿐, 검출 대상 속에 포함된 검체를 제거하지는 못하다는 단점이 있다.
따라서, 검출 대상 속에 포함된 검체를 포집할 수 있고, 포집된 검체를 정량할 수 있으며, 검체 용해물 내에서 단백질 성분만을 제거하고, DNA 또는 RNA를 정제할 수 있는 신규한 소재의 개발이 필요하다.
레반은 생체적합성이 우수하고, 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있으나, 분자량의 조절이나, 대량 생산이 어렵기 때문에 덱스트란, 젤라틴과 같은 다른 다당 폴리머에 비해 이들을 이용한 응용은 제한이 있었다.
키토산은 자연에서 쉽게 수득할 수 있다. 게와 같은 갑각류의 껍질, 곤충 껍질 및 진균으로부터 얻을 수 있으며, 대표적으로 가재류 또는 새우의 폐기되는 껍질로부터 용이하게 얻을 수 있다. 키토산은 무독성이며, 생물체의 조직과 피부에 친화적이다.
아가로스, 레반, 덱스트란, 히알루론산, 젤라틴, 셀룰로오스, 전분 및 키틴과 같은 당 고분자를 이용하여 검체를 손상 없이 흡착하고, 방출할 수 있는 신규한 소재의 개발이 요구된다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 단백질 흡착용 표면개질 나노카본-당고분자 복합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 단백질 흡착용 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 포함하는 검체 흡착용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 이용하여 검체 용해물로부터 단백질을 분리 또는 제거하고, DNA 또는 RNA를 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 당고분자 매트릭스; 나노카본; 및 단백질 결합성 화합물;을 포함하고,
상기 나노카본은 당고분자 매트릭스 내에 분산되어 당고분자 매트릭스와 함께 다공성 구조체를 형성하고,
상기 단백질 결합성 화합물은 쿠마시 브릴리언트 블루 유도체, 폰소 S(ponceau S) 및 에오신으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 단백질 결합성 화합물은 복합체의 표면 및 기공 내에 물리적 또는 화학적으로 결합된 것인, 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 당고분자 매트릭스는 아가로스, 셀룰로오스, 키틴, 레반, 덱스트린, 젤라틴 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 나노카본은 그래핀, 그래핀 옥사이드, 환원 그래핀 옥사이드, 카본나노튜브 및 카본나노와이어로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 쿠마시 브릴리언트 블루 유도체는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00001
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 1] 또는 [화학식 2]에서,
R1, R2 및 R3은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, C1 - 6알킬, 페닐, 및 벤질 중에서 선택되고,
Ra, Rb, Rc, Rd, Re 및 Rf는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 SO3H 또는 이의 허용 가능한 염, 할로겐, C1 - 6알킬, C2 - 6알케닐, C3 - 6알키닐, C1 - 6알킬옥시, 히드록시, 트리플루오로C1 - 6알킬, 트리플루오로C1 - 6알킬옥시, 시아노, 니트로, 아미노, 아릴 및 카르복실로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 의하면, 단백질 결합성 화합물은 상기 다공성 구조체와 π-π 결합으로 부착된 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 표면개질 나노카본-당고분자 복합체는 당고분자 매트릭스 100 중량부에 대하여, 나노카본 15 내지 45 중량부를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 표면개질 나노카본-당고분자 복합체는 기공의 크기가 20 내지 500㎛일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 표면개질 나노카본-당고분자 복합체는 단백질을 선택적으로 흡착하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은, 당고분자 매트릭스와 나노카본을 반응시켜, 나노카본이 당고분자 매트릭스 내에 분산된 형태의 다공성 구조체를 제조하는 단계; 및
쿠마시 브릴리언트 블루 유도체, 폰소 S(ponceau S) 및 에오신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합성 화합물을 첨가하여 반응시키는 단계;를 포함하는 표면개질 나노카본-당고분자 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 당고분자 매트릭스 100 중량부에 대하여, 나노카본 15 내지 45 중량부를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 포함하는 검체 흡착용 조성물을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 검체는 바이러스, 세균, 곰팡이, 효모, 조류 및 원생동물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로서 단백질이 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은, 1) 검체를 용해시켜 용해물을 얻는 단계;
2) 용해물에 본 발명에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 첨가하여 교반하는 단계; 및
3) 상기 2) 단계의 혼합물을 여과하고, 여액을 수득하는 단계;를 포함하는, 검체 용해물로부터 단백질을 분리 또는 제거하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 검체는 앞에서 제시한 바와 같다.
또한, 본 발명은 1) 검체를 용해시켜 용해물을 얻는 단계;
2) 용해물에 본 발명에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 첨가하여 교반하는 단계; 및
3) 상기 2) 단계의 혼합물을 여과하고, 여액을 수득하는 단계;를 포함하는, 검체 용해물로부터 DNA 또는 RNA를 정제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 검체를 용해시켜 용해물을 얻는 단계;
2) 용해물에 본 발명에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 첨가하여 교반하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 혼합물을 여과하고, 여액을 수득하는 단계; 및
4) 검체 용해물로부터 DNA 또는 RNA를 수득하는 단계;를 포함하는 검체 정량화 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체는 단백질 또는 단백질이 포함된 검체를 우수한 효율로 흡착할 수 있으며, 단백질과 DNA 또는 RNA와 같은 물질이 혼합된 시료 내에서 단백질을 선택적으로 흡착 및 제거할 수 있다. 따라서, 바이러스, 세균, 곰팡이, 효모, 조류 또는 원생동물과 같이 단백질을 포함하는 검체를 흡착 또는 제거할 수 있으며, 정량화 하는데 이용이 가능하다. 뿐만 아니라, 검체 용해물에서 단백질을 제거하고, DNA 또는 RNA를 정제할 수 있으므로, PCR 전처리에 사용이 가능하며, 산업적으로 유용하게 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체 및 이의 주사전자현미경 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체의 단백질 흡착 여부를 비색법으로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체의 단백질 흡착 웨스턴블롯 결과이다.
도 4는 본 발명에 일 실시예에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체의 DNA 분리 및 증폭에 주는 영향을 확인하기 위한 아가로스겔 전기영동 결과이다.
도 5는 본 발명에 일 실시예에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체의 검체 흡착 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
당고분자 매트릭스; 나노카본; 및 단백질 결합성 화합물;을 포함하고,
상기 나노카본은 당고분자 매트릭스 내에 분산되어 당고분자 매트릭스와 함께 다공성 구조체를 형성하고,
상기 단백질 결합성 화합물은 쿠마시 브릴리언트 블루 유도체, 폰소 S(ponceau S) 및 에오신으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 단백질 결합성 화합물은 복합체의 표면 및 기공 내에 물리적 또는 화학적으로 결합된 것인, 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 제공한다.
본 발명에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체의 형태는 제한이 없으며, 예를 들어, 구형, 타원구형, 큐브형 또는 부정형일 수 있다.
일반 면봉은 수분 흡수를 통해 검체를 수집하는 데에는 우수하나, 용해가 잘 되지 않고, 유전자 추출이 어려워 PCR을 할 수 없는 문제가 있으나, 본 발명에 따른 복합체는 수분 속에 함유된 검체, 바람직하게는 단백질을 포함하는 검체를 효과적으로 흡착할 수 있다. 뿐만 아니라, 수득한 검체를 용해시키고, 용해물을 본 발명에 따른 복합체와 반응시키는 경우, DNA 또는 RNA와 단백질이 혼재되어 있는 검체 용해물 내에서, 선택적으로 단백질 성분만을 흡착/제거할 수 있으므로, DNA 또는 RNA의 PCR에 유리하며, DNA 또는 RNA 정량화가 용이하다.
본 발명에 있어서, 용어 "당고분자"는 폴리사카라이드 또는 다당체를 의미한다.
본 발명에 의하면, 상기 당고분자 매트릭스는 아가로스, 셀룰로오스, 키틴, 레반, 덱스트린, 젤라틴 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 당고분자의 매트릭스 일 수 있으며, 바람직하게는 아가로스 또는 레반일 수 있다. 상기 매트릭스를 사용하는 경우, 빠른 단백질 흡착을 보였으며, 내구성이 특히 우수하였다.
본 발명에 의하면, 상기 나노카본은 그래핀, 그래핀 옥사이드, 환원 그래핀 옥사이드, 카본나노튜브 및 카본나노와이어로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 복합체는 상기 나노카본과 당고분자 매트릭스가 물리적/화학적으로 얽히고, 결합하여 잘 발달된 다공 구조를 가진다. 본 발명에 따른 복합체는 내구성이 우수하며, 시료 속에 포함된 단백질 성분의 포획 및 흡착 효율이 향상되었으며, 제거가 용이하다.
본 발명에 의하면, 상기 단백질 결합성 화합물은 단백질이 본 발명에 따른 복합체의 기공 내로 들어갈 수 있도록 유도하고, 기공에 들어간 단백질이 빠져나가지 않도록 한다. 뿐만 아니라 상기 단백질 결합성 화합물 자체도 복합체의 표면 또는 기공 내에서 단백질과 결합함으로써 단백질을 흡착한다.
본 발명에 의하면, 상기 단백질 결합성 화합물은 쿠마시 브릴리언트 블루 유도체, 폰소 S(ponceau S) 및 에오신으로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 제한되는 것은 아니며, 단백질과의 결합 특성을 나타내는 화합물이면 사용이 가능하다.
본 발명에 의하면, 상기 단백질 결합성 화합물은 바람직하게는 쿠마시 브릴리언트 블루 유도체일 수 있는데, 쿠마시 브릴리언트 블루 유도체를 사용하여 제조된 복합체는 단백질을 흡착 속도가 특히 빠르며, 용액 내에서 흡착된 단백질을 누출시키지 않으므로 바람직하다. 상기 쿠마시 브릴리언트 블루 유도체는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00003
[화학식 2]
Figure pat00004
[화학식 1] 또는 [화학식 2]에서,
R1, R2 및 R3은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, C1 - 6알킬, 페닐, 및 벤질 중에서 선택되고,
Ra, Rb, Rc, Rd, Re 및 Rf는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 SO3H 또는 이의 허용 가능한 염, 할로겐, C1 - 6알킬, C2 - 6알케닐, C3 - 6알키닐, C1 - 6알킬옥시, 히드록시, 트리플루오로C1 - 6알킬, 트리플루오로C1 - 6알킬옥시, 시아노, 니트로, 아미노, 아릴 및 카르복실로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 의하면, 단백질 결합성 화합물은 상기 다공성 구조체와 π-π 결합으로 부착된 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 당고분자 매트릭스 100 중량부에 대하여, 나노카본 15 내지 45 중량부를 포함하는 것일 수 있다.
나노카본의 함량이 상기 범위 미만이면, 단백질 결합성 화합물과의 결합할 수 있는 양이 적어질 수 있으며, 단백질 흡착능이 떨어질 수 있고, 따라서 단백질을 모두 흡착하기 위해서는 다량의 복합체를 필요로 할 수 있으므로 경제성이 떨어질 수 있다. 한편, 나노카본의 상기 범위를 초과하면, 당고분자 매트릭스 대비 나노카본의 함량이 너무 많아 복합체의 형태 조절이 용이하지 않아 볼이나 섬유 형태를 갖기 어려우며, 기공이 너무 커서 흡착된 단백질이 유출될 수 있다.
바람직하게는, 당고분자 매트릭스 100 중량부에 대하여 나노카본이 20 내지 40 중량부, 보다 바람직하게는 나노카본이 25 내지 35 중량부로 포함될 수 있다. 상기 범위인 것이, 단백질 결합성 화합물과의 반응성이 우수하며, 바이오 검체들과 반응시키기 위한 액상의 검출 시료 내에서 핸들링이 용이하고, 제조된 복합체의 기계적 강도가 우수하여 교반이나 볼텍싱 과정에서 복합체가 부서지지 않는다. 본 발명에 따르면, 당고분자 매트릭스 100 중량부에 대하여 나노카본 30 중량부를 사용하였을 때 기계적 강도가 우수하고, 단백질 결합성 화합물과의 반응성이 뛰어나며, 단백질 흡착 효율이 가장 우수한 복합체가 제조되었다.
본 발명에 의하면, 상기 기공의 크기는 20 내지 500 ㎛일 수 있다. 기공의 크기가 상기 범위 미만이면, 기공 내 단백질 흡착이 어려워 흡착 효율이 떨어질 수 있으며, 기공의 크기가 상기 범위를 초과하면 복합체의 내구성이 떨어질 수 있고, 용액 내에서 흡착된 단백질의 유출이 일어날 수 있으므로 바람직하지 않다.
본 발명에 따른 복합체는 시료 중의 단백질 함유 물질, 예를 들어, 바이러스, 세균, 곰팡이, 효모, 조류 및 원생동물과 같은 단백질을 포함하는 검체를 흡착할 수 있으며, 검출 시료로부터 상기 검체를 분리 또는 제거하는데 효과적이다.
또한, 본 발명은, 당고분자 매트릭스와 나노카본을 반응시켜, 나노카본이 당고분자 매트릭스 내에 분산된 형태의 다공성 복합체를 제조하는 단계; 및
쿠마시 브릴리언트 블루 유도체, 폰소 S(ponceau S) 및 에오신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합성 화합물을 첨가하여 반응시키는 단계;를 포함하는 표면개질 나노카본-당고분자 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 당고분자 매트릭스, 나노타본, 및 단백질 결합성 화합물의 정의는 앞에서 제시한 바와 같다.
본 발명에 의하면, 먼저, 당고분자 매트릭스 100 중량부에 대하여, 나노카본 15 내지 45 중량부를 반응시켜 다공성 복합체를 제조한다. 다음으로, 단백질 결합성 화합물을 첨가하여 상기 다공성 복합체의 표면 또는 기공 내부를 개질시킨다. 본 발명에 의하면, 단백질 결합성 화합물은 다공성 구조체의 표면 또는 내부에 π-π 결합을 통해 부착되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기한 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 포함하는 검체 흡착용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 "검체"는 바이러스, 세균, 곰팡이, 효모, 조류 및 원생동물로 이루어진 군으로부터 선택되며, 생물체 내 단백질을 포함하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은, 1) 검체를 용해시켜 용해물을 얻는 단계;
2) 용해물에 본 발명에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 첨가하여 교반하는 단계; 및
3) 상기 2) 단계의 혼합물을 여과하고, 여액을 수득하는 단계;를 포함하는, 검체 용해물로부터 단백질을 분리 또는 제거하는 방법을 제공한다.
검체를 정량 또는 정성 분석하기 위해서는 용해(lysis)시킨 뒤, DNA 또는 RNA를 PCR 등을 사용하여 증폭하는 단계가 필요할 수 있다. 그러나 용해물 내에 불필요한 성분들이 포함되는 경우, PCR이 이루어지지 않거나, 분석 정확도가 떨어질 수 있다. 따라서, 용해물 내의 불필요한 성분, 예를 들어 단백질을 제거하는 전처리 과정이 요구될 수 있다.
본 발명에 따른 복합체는 검체 용해물로부터 단백질을 선택적으로 분리 또는/및 제거함으로써 정제된 DNA 또는 RNA를 얻을 수 있도록 한다. 본 발명에 따른 복합체를 이용하여 단백질을 분리하는 경우, 용해물 내의 검체를 손쉽게 정성 분석 및 정량화가 가능하다.
또한, 본 발명은 1) 검체를 용해시켜 용해물을 얻는 단계;
2) 용해물에 본 발명에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 첨가하여 교반하는 단계; 및
3) 상기 2) 단계의 혼합물을 여과하고, 여액을 수득하는 단계;를 포함하는, 검체 용해물로부터 DNA 또는 RNA를 분리 또는 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
1) 검체를 용해시켜 용해물을 얻는 단계;
2) 용해물에 본 발명에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 첨가하여 교반하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 혼합물을 여과하고, 여액을 수득하는 단계; 및
4) 검체 용해물로부터 DNA 또는 RNA를 수득하는 단계;를 포함하는 검체 정량화 방법을 제공하는 것이다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백하다.
실시예
제조예 1. 나노카본-당고분자 복합체 제조
당고분자와 나노카본을 반응시켜, 당고분자 매트릭스 내에 나노카본이 결합된 3차원 그물구조의 나노카본-당고분자 복합체를 제조하였다. 당고분자로 아가로스를 사용하였으며, 나노카본으로 환원 그래핀 옥사이드(RGO)를 사용하였다. 구체적으로, 아가로스 폴리머와 나노 카본 재료(그래핀, 그래핀 옥사이드, 환원 그래핀 옥사이드, 카본나노튜브 및 카본나노와이어)를 졸-겔 프로세스로 제작하였다. 먼저, 아가로스 분말을 탈이온수에 10~70 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 다음으로 나노카본 재료 500 mg을 물 50 ml에 넣고, 1시간 동안 초음파처리하여 분산시켰다. 준비된 아가로스 용액에 나노카본 재료 분산액을 10~80%의 비율로 첨가한 후, 90℃에서 20분 동안 천천히 교반하였다. 피펫을 사용하여 나노카본-아가로스 용액을 오일조(oil bath) 안에 한 방울씩 떨어뜨려 볼을 형성시킨 후, 형성된 볼을 각 n-헥산, 에탄올, 탈이온수 순으로 세척하고, 동결건조하여 목적하는 볼 형태의 다공성 나노카본-당고분자 복합체를 제조하였다.
오일조에 떨어뜨리는 나노카본-아가로스 용액의 용적량을 조절함으로써 제조되는 다공성 나노카본-당고분자 복합체의 크기를 조절한다. 본 발명에서는 지름이 2 내지 5 mm로 제작하였다.
실시예 1. 표면개질 나노카본-당고분자 복합체 제조
쿠마시 브릴리언트 블루가 포함된 Bradford 시약(Bio-rad 사, Cat# 5000006)을 물에 1/10, 1/5, 1/2로 희석하여 Bradford 시약 희석 용액을 준비하였다. 준비된 Bradford 시약 희석 용액 500 ㎕과 Bradford 시약 원액을 각각 제조예 1의 나노카본-당고분자 복합체 10 mg에 첨가하여 10분 동안 교반하고, 탈이온수로 5회 세척하여 나노카본-당고분자 복합체 표면 및 그물 구조 내에 쿠마시 브릴리언트 블루가 도입된 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 제조하였다.
1/10, 1/5, 1/2로 희석한 Bradford 시약 희석 용액을 사용한 경우, 쿠마시 브릴리언트 블루가 잘 코팅되었으며, 단백질을 효율적으로 흡착하였다. 반면, Bradford 시약 원액을 사용한 경우, 제조된 다공성 복합체가 형태를 유지하지 못하였고, Bradford 시약에 녹아버렸다. 따라서, Bradford 시약은 희석하여 사용하여야 한다. 이하, 추가 실험에서는 Bradford 시약을 1/5로 희석하여 사용하였다.
도 1은 1/5로 희석한 Bradford 시약 희석 용액을 이용하여 제조된 표면개질 나노카본-당고분자 복합체의 이미지이다. 주사전자현미경 사진에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 복합체는 다공성 구조가 잘 발달된 것이 확인되었다.
비교예 1.
쿠마시 브릴리언트 블루가 포함된 Bradford 시약(1/5 희석 용액)에 제조예 1의 당 고분자를 소량 첨가하여 혼합물을 제조하였다.
시료 준비
1.5 ml 마이크로 튜브 3개를 준비하고, 각각 ①, ②, ③으로 표기한 다음, 튜브에 다음과 같이 시료를 준비하였다.
① PBS 완충액
② 인플루엔자 A의 핵단백질 100 ng/물 500 ㎕
③ 1.2 kbp DNA 30 ng/물 500 ㎕
시험예 1. 단백질 흡착능 테스트
1) 비색 테스트
본 발명에서 제조한 복합체에 의한 단백질 흡착 여부를 확인하였다.
1.5 ml 마이크로 튜브에 각각 인플루엔자 NP 단백질을 1, 2, 10 및 20 ㎍/ml의 농도로 첨가한 뒤, 각각의 튜브에 쿠마시 브릴리언트 블루 120 ㎕, PBS 완충액 440 ㎕를 넣어 최종 부피를 1 ml로 만든 뒤 혼합하였다. 각각의 시료를 500 ㎕씩 둘로 나눈 다음, 하나는 무처리, 다른 하나는 실시예 1의 복합체 10 mg을 넣고, 10분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 투명 96웰 플레이트에 분주하여 색변화를 확인하였다.
쿠마시 브릴리언트 블루는 용액 내에서는 무색으로 존재하나, 단백질과 결합하면 푸른색을 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 무처리 상태에서는 단백질 농도 의존적으로 푸른색이 짙은 것이 관찰되었다. 또한, 실시예 1의 복합체 처리에 따라 푸른색이 사라졌는데, 이는 실시예 1의 복합체가 단백질을 흡착에 따른 결과이다.
2) 웨스턴 블롯 테스트
대조군
상기 ①~③의 튜브에 각각 쿠마시 브릴리언트 블루가 포함된 Bradford 시약을 1:1 부피%로 첨가하고, 제조예 1의 나노카본-당고분자 복합체를 10 mg 넣은 후, 10분간 마일드하게 교반하였다.
각각의 튜브에서 용액만을 채취하여 각각 ④, ⑤, ⑥ 시료로 명명하고, 웨스턴 블롯을 실시하였다.
실험군
상기 ①~③을 각각 마이크로 튜브에 250 ㎕씩 넣고, 각각의 튜브에, PBS 완충액 250 ㎕를 첨가하여 총 부피가 대조군과 동일하도록 조절하였다. 각각의 튜브에 실시예 1의 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 대조군과 동일한 양으로 넣은 후, 10분간 마일드하게 교반하였다.
각각의 튜브에서 용액만을 채취하여 각각 ⑦, ⑧, ⑨ 시료로 명명하고, 웨스턴 블롯을 실시하였다.
결과
도 3에 나타낸 바와 같이, 단백질이 있는 ② 시료에서 진한 밴드가 관찰되었다. 한편, ⑤, ⑧ 시료에서는 밴드가 거의 관찰되지 않았다. 이를 통해 단백질을 흡착하는 것으로 알려진 쿠마시 브릴리언트 블루와 비교하여, 본 발명에 따른 실시예 1의 표면개질 나노카본-당고분자 복합체가 단백질 흡수에 효과적임을 확인할 수 있다.
시험예 2. DNA 검출
DNA가 함유된 ③, ⑥, ⑨ 시료를 PCR 한 후, 아가로스 겔에서 전기영동을 실시하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
③, ⑨ 시료에서는 DNA 밴드가 확인되었으나, ⑥ 시료에서는 DNA 밴드가 거의 나타나지 않았다. 이를 통해 본 발명에 따른 실시예 1의 표면개질 나노카본-당고분자 복합체는 DNA의 PCR에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었으며, 검체의 정량화에 적합하다는 것이 확인되었다.
반면, 비교예 1에서와 같이, 나노카본-당고분자 복합체와 쿠마시 브릴리언트 블루가 혼합물로서 존재하는 경우에는, PCR을 저해하는 것으로 나타나 DNA 정제 및 검체의 정량화에 적합하지 않았다.
시험예 3.
실시예 1의 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 이용하여 병원체 흡착이 가능한지 확인하였다. 병원체 시료로 대장균 103 CFU/ml를 준비하였다.
대조군
PBS 완충액 399 ㎕, 쿠마시 브릴리언트 블루가 포함된 Bradford 시약 1 ㎕, 병원체 시료 100 ㎕를 혼합하여 총 500 ㎕ 용액을 제조한 뒤, 제조예 1의 복합체를 수개 첨가하고, 10분간 마일드하게 교반한 뒤, 용액만을 채취하여 배양하였다.
실험군
PBS 완충액 400 ㎕, 병원체 시료 100 ㎕를 혼합하여 총 500 ㎕ 용액을 제조한 뒤, 실시예 1의 복합체를 대조군과 동일한 양으로 첨가하고, 10분간 마일드하게 교반한 뒤, 용액만을 채취하여 배양하였다.
배양 결과를 도 5에 나타내었다.
대조군에 비하여 실험군에서 대장균의 증식이 낮은 것을 알 수 있다. 이를 통해 본 발명의 실시예 1의 복합체가 병원체를 효과적으로 흡착하는 것을 확인하였다.

Claims (15)

  1. 당고분자 매트릭스; 나노카본; 및 단백질 결합성 화합물;을 포함하고,
    상기 나노카본은 당고분자 매트릭스 내에 분산되어 당고분자 매트릭스와 함께 다공성 구조체를 형성하고,
    상기 단백질 결합성 화합물은 쿠마시 브릴리언트 블루 유도체, 폰소 S(ponceau S) 및 에오신으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 단백질 결합성 화합물은 복합체의 표면 및 기공 내에 물리적 또는 화학적으로 결합된 것인, 표면개질 나노카본-당고분자 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 당고분자 매트릭스는 아가로스, 셀룰로오스, 키틴, 레반, 덱스트린, 젤라틴 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 표면개질 나노카본-당고분자 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 나노카본은 그래핀, 그래핀 옥사이드, 환원 그래핀 옥사이드, 카본나노튜브 및 카본나노와이어로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 표면개질 나노카본-당고분자 복합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 쿠마시 브릴리언트 블루 유도체는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물인, 표면개질 나노카본-당고분자 복합체.
    [화학식 1]
    Figure pat00005

    [화학식 2]
    Figure pat00006

    [화학식 1] 또는 [화학식 2]에서,
    R1, R2 및 R3은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, C1 - 6알킬, 페닐, 및 벤질 중에서 선택되고,
    Ra, Rb, Rc, Rd, Re 및 Rf는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 SO3H 또는 이의 허용 가능한 염, 할로겐, C1 - 6알킬, C2 - 6알케닐, C3 - 6알키닐, C1 - 6알킬옥시, 히드록시, 트리플루오로C1 - 6알킬, 트리플루오로C1 - 6알킬옥시, 시아노, 니트로, 아미노, 아릴 및 카르복실로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  5. 제1항에 있어서,
    당고분자 매트릭스 100 중량부에 대하여, 나노카본 15 내지 45 중량부를 포함하는 것인, 표면개질 나노카본-당고분자 복합체.
  6. 제1항에 있어서,
    기공의 크기가 20 내지 500㎛인, 표면개질 나노카본-당고분자 복합체.
  7. 제1항에 있어서,
    단백질을 선택적으로 흡착하는 것인, 표면개질 나노카본-당고분자 복합체.
  8. 당고분자 매트릭스와 나노카본을 반응시켜, 나노카본이 당고분자 매트릭스 내에 분산된 형태의 다공성 구조체를 제조하는 단계; 및
    쿠마시 브릴리언트 블루 유도체, 폰소 S(ponceau S) 및 에오신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합성 화합물을 첨가하여 반응시키는 단계;를 포함하는 표면개질 나노카본-당고분자 복합체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    당고분자 매트릭스 100 중량부에 대하여, 나노카본 15 내지 45 중량부를 포함하는 것인, 표면개질 나노카본-당고분자 복합체의 제조방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 표면 개질 나노카본-당고분자 복합체를 포함하는 검체 흡착용 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 검체는 바이러스, 세균, 곰팡이, 효모, 조류 및 원생동물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로서 단백질이 포함하는 것인, 검체 흡착용 조성물.
  12. 1) 검체를 용해시켜 용해물을 얻는 단계;
    2) 용해물에 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 첨가하여 교반하는 단계; 및
    3) 상기 2) 단계의 혼합물을 여과하고, 여액을 수득하는 단계;를 포함하는, 검체 용해물로부터 단백질을 분리 또는 제거하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 검체는 바이러스, 세균, 곰팡이, 효모, 조류 및 원생동물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 검체 용해물로부터 단백질을 분리 또는 제거하는 방법.
  14. 1) 검체를 용해시켜 용해물을 얻는 단계;
    2) 용해물에 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 첨가하여 교반하는 단계; 및
    3) 상기 2) 단계의 혼합물을 여과하고, 여액을 수득하는 단계;를 포함하는, 검체 용해물로부터 DNA 또는 RNA를 분리 또는 정제하는 방법.
  15. 1) 검체를 용해시켜 용해물을 얻는 단계;
    2) 용해물에 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 표면개질 나노카본-당고분자 복합체를 첨가하여 교반하는 단계;
    3) 상기 2) 단계의 혼합물을 여과하고, 여액을 수득하는 단계; 및
    4) 검체 용해물로부터 DNA 또는 RNA를 수득하는 단계;를 포함하는 검체 정량화 방법.
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