CN111171035B - 4-苯氧基苯基吡唑并嘧啶酰胺衍生物的制备方法和应用 - Google Patents
4-苯氧基苯基吡唑并嘧啶酰胺衍生物的制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种4‑苯氧基苯基吡唑并嘧啶酰胺衍生物的制备方法和应用。该类化合物具有式(I)所示结构：
其中，X、Y为两个连接基团，X选自苄基、取代苄基、哌啶基、C1～6直链或支链的烷基；Y为‑(CH2)n‑，n为选自0～4的任意整数；R选自羟基、羟氨基和邻苯二氨基；式(I)结构包含其消旋体及立体异构体。该类化合物具有BTK/HDAC双靶点抑制作用和对T细胞白血病细胞和套细胞淋巴瘤细胞的生长抑制活性，用于制备抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及有机化合物合成及医药应用领域，尤其涉及一种4-苯氧基苯基吡唑并嘧啶酰胺衍生物的制备方法和应用。
背景技术
套细胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma,MCL)是一种恶性程度高、预后不良的非霍奇金淋巴瘤 (Non-Hodgkin lymphoma,NHL)，其特征为t(11；14)(q13；q32)染色体易位，从而导致细胞周期蛋白D1过度表达。MCL临床多呈侵袭性，迄今为止仍为不可治愈淋巴瘤，目前尚无标准的一线化疗方案，与其他B细胞淋巴瘤相比，MCL通过化疗很难维持长期效果。(参见：Zhou Y,Wang H, Fang W,Romaguer JE,Zhang Y,Delasalle KB,Kwak L,Yi Q,DuXL,Wang M:Incidence trends of mantle cell lymphoma in the United Statesbetween 1992and 2004.Cancer 2008,113(4):791.)近年随着对MCL发病机制研究的深入，分子靶向治疗取得了一定的进展，包括mammalian target of rapamycin(mTOR)抑制剂、Brutons tyrosine kinase(BTK)抑制剂、histone deacetylase(HDAC)抑制剂和cyclin-dependent kinase(CDK)抑制剂。BTK是B细胞受体信号通路下游的一个调节因子，对B 细胞的发育和成熟起到至关重要的作用，BTK的异常表达和激活在MCL细胞普遍存在。(WinerES, Ingham RR,Castillo JJ:PCI-32765:a novel Bruton's tyrosine kinaseinhibitor for the treatment of lymphoid malignancies.Expert Opinion onInvestigational Drugs 2012,21(3):355-361.)依鲁替尼 (Ibrutinib，IBN)是第一个上市的BTK抑制剂，临床上表现出对MCL良好的治疗效果，FDA批准用于治疗复发难治性MCL(Wang ML,Rule S,Martin P,Goy A,Auer R,Kahl BS,Jurczak W, Advani RH,RomagueraJE,Williams ME et al:Targeting BTK with ibrutinib in relapsed or refractorymantle-cell lymphoma.N Engl J Med 2013,369(6):507-516.)随着临床应用的广泛，依鲁替尼的耐药性逐渐显现，表现在BTK481位点的半胱氨酸突变为丝氨酸，另外还有约三分之一的患者对依鲁替尼的治疗无应答，如何提高这部分患者的整体应答率和改善耐药性是目前MCL治疗研究的一个热点。(Woyach JA,Furman RR,Liu TM,Ozer HG,Zapatka M,Ruppert AS,Xue L,Li HH,Steggerda SM, Versele M:Resistance Mechanisms for theBruton's Tyrosine Kinase Inhibitor Ibrutinib.New England Journal of Medicine2014,370(24):2286-2294.)HDAC的异常表达和突变与肿瘤的发生、发展密切相关，HDAC在淋巴瘤中高表达导致组蛋白低乙酰化作用，因此，抑制HDAC能使细胞周期阻滞，从而诱导细胞凋亡。(Noel MS,Friedberg JW,Barr PM:Novel Agents in Mantle CellLymphoma.Best Practice&Research Clinical Haematology 2012,25(2):191-200.)伏立诺他(Vorinostat，SAHA)是第一个上市的HDAC抑制剂，FDA批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤。临床实验表明，应用伏立诺他治疗复发难治性MCL，显示出了一定的治疗效果，但是单药的效果有限。(Kirschbaum MH, Goldman BH,Zain JM,Cook JR,Rimsza LM,Forman SJ,Fisher RI:A Phase 2Study of Vorinostat for Treatment of Relapsed orRefractory Hodgkin Lymphoma:SWOG S0517.Leukemia&Lymphoma 2012, 53(2):259-262.)目前，临床对于MCL患者多采用联合用药的方式治疗。根据报道，HDAC抑制剂与BTK抑制剂联合用药，通过抑制NF-κB通路和下调细胞周期蛋白D1，对MCL细胞生长抑制具有协同作用。(Hagiwara K,Kunishima S,Iida H,Miyata Y,Naoe T,Nagai H:The synergisticeffect of BCR signaling inhibitors combined with an HDAC inhibitor on celldeath in a mantle cell lymphoma cell line.Apoptosis 2015,20(7):975-985.)相比联合用药，单分子双靶点药物可以解决药物之间相互作用、病人的依从性差等问题。因此，设计合成具有BTK/HDAC双重抑制作用的化合物对于改善MCL 的治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种吡唑并嘧啶类化合物及其制备方法和应用。该类化合物具有一定的抑制BTK/HDAC双靶点抑制作用和对T细胞白血病Jurkat细胞和套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞的生长抑制活性，用于制备抗肿瘤药物。本发明的实验数据表明，在浓度为1μM下，本发明的化合物均表现出对BTK较强的抑制活性(抑制率大于80％)，在浓度为50nM下，本发明的化合物仍表现出对BTK一定的抑制活性，且较多化合物与IBN具有相当的BTK抑制活性。以及，本发明的某些化合物对HDAC表现出较强的抑制活性(IC50小于1μM)。以及，本发明的化合物对T细胞白血病Jurkat细胞的生长抑制活性也较强。以及，本发明的化合物对套细胞淋巴瘤细胞Jeko-1表现出了较强的抗增殖活性。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种化合物，其结构如式(I)所示：
其中，X、Y为两个连接基团，X选自苄基、取代苄基、哌啶基、C1～6直链或支链的烷基；Y为-(CH2)n-，n为选自0～4的任意整数；R选自羟基、羟氨基和邻苯二氨基；式(I)结构包含其消旋体及其立体异构体(R-构型和S-构型)。
优选地，Y为-(CH2)n-，n为0或1。
优选地，Y为-(CH2)n-，n为0时，X为苄基或取代苄基。
优选地，Y为-(CH2)n-，n为1时，X为苄基、取代苄基或哌啶基；
如上所述，当X为苄基或取代苄基时，X为
a、b表示连接位置，其中b位置与Y相连；R1选自氢、硝基、卤素和C1～6直链或支链的烷氧基。
其中，X为
时，R1的取代位置为
优选地，X选自
中的任一种；优选为
优选地，X选自
优选地，X为
R1为H时，X选自
优选地，X为
R1为硝基、卤素或C1～6直链或支链的烷氧基时，X选自
优选地，X为
R1为硝基或C1～6直链或支链的烷氧基时，X为
优选地，R1为C1～6直链或支链的烷氧基时，所述烷氧基选自甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基，优选为甲氧基。
优选地，R1为卤素时，所述卤素选自F、Cl、Br和I，优选为Cl或Br。
如上所述，当所述X为哌啶基时，X选自
a、b表示连接位置，其中b位置与Y相连。
其中，
互为异构体，
为消旋体。
本发明发现，当X为哌啶基，且a、b两个连接位置处于对位时，即X为
时，这样的化合物并不能实现本发明的技术效果。
如上所述，本发明所述化合物包含以下结构：
其中，Y为-(CH2)n-，n为0或1；R选自羟基、羟氨基和邻苯二氨基；R1选自氢、硝基、卤素和甲氧基。
优选地，式(II)结构中，根据R1的取代位置，式(II)包含以下结构：
其中，Y为-(CH2)n-，n为0或1；R选自羟基、羟氨基和邻苯二氨基；R1选自氢、硝基、卤素和甲氧基。
优选地，式(II)结构中，根据Y与苯环的连接位置，式(II)包含以下结构：
其中，Y为-(CH2)n-，n为0或1；R选自羟基、羟氨基和邻苯二氨基；R1选自氢、硝基、卤素和甲氧基。
优选地，根据如上所述，本发明包含以下化合物：
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基苯甲酰胺(化合物Y1)
3-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基苯甲酰胺(化合物Y2)
2-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基苯甲酰胺(化合物Y3)
2-(4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)-N-羟基乙酰胺(化合物 Y4)
2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-羟基乙酰胺(化合物 Y5)
(R)2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-羟基乙酰胺(化合物Y6)
(S)2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-羟基乙酰胺(化合物Y7)
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-溴-N-羟基苯甲酰胺(化合物 Y8)
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2-溴-N-羟基苯甲酰胺(化合物 Y9)
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-氯-N-羟基苯甲酰胺(化合物 Y10)
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基-3-硝基苯甲酰胺(化合物 Y11)
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基-3-甲氧基苯甲酰胺(化合物Y12)
4-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙酰氨基)-N-羟基苯甲酰胺(化合物 Y13)
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸(化合物Y14)
3-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸(化合物Y15)
2-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸(化合物Y16)
(4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)乙酸(化合物Y17)
2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)乙酸(化合物Y18)
(R)2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)乙酸(化合物Y19)
(S)2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)乙酸(化合物Y20)
4-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙酰胺基)苯甲酸(化合物Y21)
(4-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙酰氨基)苯基)乙酸(化合物Y22)
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-(2-氨基苯基)苯甲酰胺(化合物Y23)
3-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-(2-氨基苯基)苯甲酰胺(化合物Y24)
2-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-(2-氨基苯基)苯甲酰胺(化合物Y25)
2-(4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)-N-(2-氨基苯基)乙酰胺 (化合物Y26)
2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-(2-氨基苯基)乙酰胺 (化合物Y27)
(R)2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-(2-氨基苯基)乙酰胺(化合物Y28)
(S)2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-(2-氨基苯基)乙酰胺(化合物Y29)。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备上述化合物的方法，其包括以中间体1为起始原料通过以下反应路线制备式(I)化合物：
其中，X、Y、R如上文中所定义，R2为羟基或卤素，优选为羟基或Br。
优选地，本发明所述方法包括以下步骤：以中间体1为起始原料，加热条件下与N-溴代丁二酰亚胺在DMF中发生取代反应得到中间体2；中间体2与4-苯氧基苯硼酸在四(三苯基膦)钯的催化下发生Suzuki反应得到中间体3；中间体3与
在碱性条件下发生亲核取代反应生成中间体4；中间体4在碱性条件下经氨解反应得式(I)化合物，或者中间体4在碱性条件下经水解反应得式(I)化合物，或者中间体4在碱性条件下经水解后再与邻苯二胺反应得式(I)化合物；
其中，X、Y、R如上文所定义，R2为羟基或卤素，优选为羟基或Br。
在本发明的较为具体的实施方式中，本发明的化合物可以通过下述方法制备：
反应路线中试剂及条件：(i)NBS,DMF,80℃；(ii)4-苯氧基苯硼酸,四(三苯基膦)钯,三水磷酸钾,1,4-二氧六环,135℃；(iii)K2CO3,KI,DMF,室温；(iv)盐酸羟胺,KOH,无水甲醇,室温；(v) NaOH,甲醇,60℃；(vi)邻苯二胺,HBTU,Et3N,无水DMF。
根据上述反应路线，以中间体1为起始原料，加热条件下与N-溴代丁二酰亚胺在DMF中发生取代反应得到中间体2；中间体2与4-苯氧基苯硼酸在四(三苯基膦)钯的催化下发生Suzuki反应得到中间体3；中间体3与不同的中间体(a:4-(溴甲基)苯甲酸甲酯，b:3-(溴甲基)苯甲酸甲酯,c: 2-(溴甲基)苯甲酸甲酯，d:2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸甲酯，e:3-羟基哌啶-1-甲酸甲酯，f: (S)-3-羟基哌啶-1-甲酸甲酯，g:(R)-3-羟基哌啶-1-甲酸甲酯，h:3-溴-4-(溴甲基)苯甲酸甲酯，i: 2-溴-4-(溴甲基)苯甲酸甲酯，j:3-氯-4-(溴甲基)苯甲酸甲酯，k:3-硝基-4-(溴甲基)苯甲酸甲酯，l:3-甲氧基-4-(溴甲基)苯甲酸甲酯，m:4-(2-溴乙酰氨基)苯甲酸甲酯，n:2-(4-(2- 溴乙酰氨基)苯基)乙酸甲酯，后续文中中间体a-n的结构均取于此)，在碱性条件下发生亲核取代反应生成中间体4；中间体4在碱性条件下：经氨解反应得羟肟酸衍生物(化合物Y1-Y13)，或经水解反应得羧酸衍生物(化合物Y14-Y22)，或经水解反应得羧酸衍生物(化合物Y14-Y20)后，再与邻苯二胺反应得酰胺衍生物(化合物Y23-Y29)。
优选地，上述方法中，羟肟酸衍生物(化合物Y1-Y13)的制备方法，具体步骤如下：
(1)以中间体1为起始原料溶于DMF中，加入N-溴代丁二酰亚胺，搅拌，80℃油浴加热，溶液颜色由淡黄色变为红色，反应3小时，TLC检测，基本反应完全，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，搅拌，析出大量黄色固体，过滤，滤饼用冰水洗涤，干燥，得中间体2。
(2)取中间体2、4-苯氧基苯硼酸、四(三苯基膦)钯、K3PO4.3H2O，加入250ml两颈瓶中，加入溶剂(1,4-二氧六环：水＝4:1)溶解，氮气保护，超声脱去溶液中的氧气，用氮气置换装置中的空气，135℃油浴加热回流，反应30小时后TLC检测，反应基本完全。将反应液冷却至室温，用硅藻土过滤，将滤液减压蒸除，得黄色固体，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝100:1)，得淡中间体 3。
(3)取中间体3、中间体a-m、K2CO3、KI加入50ml反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入100ml冰水中，搅拌，析出白色固体，加入乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1)，得中间体4a-4m。
(4)取氢氧化钾溶于无水甲醇中，超声助溶，得到溶液a。取盐酸羟胺溶于无水甲醇中，超声助溶，冰浴，得到溶液b冰浴。将溶液a加入恒压滴液漏斗中，缓慢滴入溶液b中，冰浴条件下反应3小时，过滤沉淀(KCl)保留滤液，滤液用无水硫酸钠干燥6小时。将滤液加入反应瓶中，取中间体4a-4m加入，反应一小时，溶液变澄清，继续反应15分钟后，TLC检测基本反应完全。减压蒸除大部分溶剂，加入水，用1M的盐酸调pH为5-6，析出固体，过滤，乙酸乙酯洗两次，滤饼用甲醇重结晶，干燥后得羟肟酸衍生物(化合物Y1-Y13)。
合成路线如下：
反应路线中试剂及条件：(i)NBS,DMF,80℃；(ii)4-苯氧基苯硼酸,四(三苯基膦)钯,三水磷酸钾,1,4-二氧六环,135℃；(iii)K2CO3,KI,DMF,室温；(iv)盐酸羟胺,KOH,无水甲醇,室温。
优选地，上述方法中，羧酸衍生物(化合物Y14-Y22)的制备方法，具体步骤如下：
(1)以中间体1为起始原料溶于DMF中，加入N-溴代丁二酰亚胺，搅拌，80℃油浴加热，溶液颜色由淡黄色变为红色，反应3小时，TLC检测，基本反应完全，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，搅拌，析出大量黄色固体，过滤，滤饼用冰水洗涤，干燥，得中间体2。
(2)取中间体2、4-苯氧基苯硼酸、四(三苯基膦)钯、K3PO4.3H2O，加入250ml两颈瓶中，加入溶剂(1,4-二氧六环：水＝4:1)溶解，氮气保护，超声脱去溶液中的氧气，用氮气置换装置中的空气，135℃油浴加热回流，反应30小时后TLC检测，反应基本完全。将反应液冷却至室温，用硅藻土过滤，将滤液减压蒸除，得黄色固体，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝100:1)，得淡中间体 3。
(3)取中间体3、中间体a-g、m-n、K2CO3、KI加入50ml反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入100ml冰水中，搅拌，析出白色固体，加入乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析 (二氯甲烷：甲醇＝200:1)，得中间体4a-4g、4m-4n。
(4)取中间体4a-4g、4m-4n加入50ml反应瓶中，加入甲醇溶解，加入3M NaOH，油浴60℃加热反应8小时，TLC检测基本反应完全。减压蒸除溶剂，加入水，用1M盐酸调PH为5-6，析出白色固体，过滤，用冰水洗涤两次，滤饼用甲醇重结晶，干燥后得羧酸衍生物(化合物Y14-Y22)。
合成路线如下：
反应路线中试剂及条件：(i)NBS,DMF,80℃；(ii)4-苯氧基苯硼酸,四(三苯基膦)钯,三水磷酸钾,1,4-二氧六环,135℃；(iii)K2CO3,KI,DMF,室温；(v)NaOH,甲醇,60℃。
优选地，上述方法中，酰胺衍生物(化合物Y23-Y29)的制备方法，具体步骤如下：
(1)以中间体1为起始原料溶于DMF中，加入N-溴代丁二酰亚胺，搅拌，80℃油浴加热，溶液颜色由淡黄色变为红色，反应3小时，TLC检测，基本反应完全，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，搅拌，析出大量黄色固体，过滤，滤饼用冰水洗涤，干燥，得中间体2。
(2)取中间体2、4-苯氧基苯硼酸、四(三苯基膦)钯、K3PO4.3H2O，加入250ml两颈瓶中，加入溶剂(1,4-二氧六环：水＝4:1)溶解，氮气保护，超声脱去溶液中的氧气，用氮气置换装置中的空气，135℃油浴加热回流，反应30小时后TLC检测，反应基本完全。将反应液冷却至室温，用硅藻土过滤，将滤液减压蒸除，得黄色固体，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝100:1)，得淡中间体 3。
(3)取中间体3、中间体a-g、K2CO3、KI加入50ml反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入100ml冰水中，搅拌，析出白色固体，加入乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1)，得中间体4a-4g。
(4)取中间体4a-4g加入50ml反应瓶中，加入甲醇溶解，加入3M NaOH，油浴60℃加热反应8小时，TLC检测基本反应完全。减压蒸除溶剂，加入水，用1M盐酸调PH为5-6，析出白色固体，过滤，用冰水洗涤两次，滤饼用甲醇重结晶，干燥后得羧酸衍生物(化合物Y14-Y20)。
(5)取羧酸衍生物(化合物Y14-Y20)、TBTU、三乙胺加入50ml反应瓶中，加入无水DMF，搅拌溶解，冰浴条件下活化30分钟，加入邻苯二胺，室温条件下反应过夜，TLC检测基本反应完全。将反应液倒入冰水中，有灰色固体析出，加入乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和NH4Cl 洗涤，饱和NaCl洗涤，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝300:1)得酰胺衍生物(化合物Y23-Y29)。
合成路线如下：
试剂及条件：(i)NBS,DMF,80℃；(ii)4-苯氧基苯硼酸,四(三苯基膦)钯,三水磷酸钾,1,4- 二氧六环,135℃；(iii)K2CO3,KI,DMF,室温；(v)NaOH,甲醇,60℃；(vi)邻苯二胺,TBTU,Et3N,无水DMF，室温。
在本发明的第三方面，本发明还提供了一种药物组合物，其含有上述的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明化合物的药物组合物，可以以选自以下任意方式施与：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、***给药、局部给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选口服、肌注、腹膜内或静脉内用药方式。
在本发明的第四方面，本发明还提供了一种药物制剂，其包含上述化合物或其药学上可接受的盐或含有上述化合物或其药学上可接受的盐的组合物和药学上可接受的辅料和/或载体。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂等。
本发明的药物组合或药物制剂中还可以含有常用的载体，这里所述可药用载体包括但不局限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酯，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛酯等。载体在药物组合物中的含量可以是1重量％-98重量％，通常大约占到80重量％。为方便起见，局部麻醉剂，防腐剂，缓冲剂等可直接溶于载体中。
口服片剂和胶囊可以含有赋形剂如粘合剂，如糖浆，***胶，山梨醇，黄芪胶，或聚乙烯吡咯烷酮，填充剂，如乳糖，蔗糖，玉米淀粉，磷酸钙，山梨醇，氨基乙酸，润滑剂，如硬脂酸镁，滑石，聚乙二醇，硅土，崩解剂，如马铃薯淀粉，或可接受的增润剂，如月桂醇钠硫酸盐。片剂可以用制药学上公知的方法包衣。
口服液可以制成水和油的悬浮液，溶液，乳浊液，糖浆，也可以制成干品，用前补充水或其它合适的媒质。这种液体制剂可以包含常规的添加剂，如悬浮剂，山梨醇，纤维素甲醚，葡萄糖糖浆，凝胶，羟乙基纤维素，羧甲基纤维素，硬脂酸铝凝胶，氢化的食用油脂，乳化剂，如卵磷脂，山梨聚糖单油酸盐，***树胶；或非水载体(可能包含可食用油)，如杏仁油，油脂如甘油，乙二醇，或乙醇；防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，山梨酸。如需要可添加调味剂或着色剂。
栓剂可包含常规的栓剂基质，如可可黄油或其它甘油酯。
对于胃肠外投药，液态剂型通常由化合物和一种消毒的载体制成。载体首选水。依照所选载体和药物浓度的不同，化合物既可溶于载体中也可制成悬浮溶液，在制成注射用溶液时先将化合物溶于水中，过滤消毒后装入封口瓶或安瓿中。
必须认识到，本发明化合物的最佳给药剂量和间隔是由化合物性质和诸如给药的形式、路径和不为以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。
在本发明的第五方面，本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐或含有上述化合物的组合物在制备BTK抑制剂药物中的应用。
在本发明的第六方面，本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐或含有上述化合物的组合物在制备HDAC抑制剂药物中的应用。
在本发明的第七方面，本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐或含有上述化合物的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤为淋巴瘤或其它血液***肿瘤包括白血病，骨髓瘤等。
在本发明的第七方面，本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐或含有上述化合物的组合物在制备治疗淋巴瘤或白血病的药物中的应用。
本发明的实验数据表明，在浓度为1μM下，化合物均表现出对BTK较强的抑制活性(抑制率大于80％)，在浓度为50nM下，化合物Y1、Y5-Y12、Y17-Y18、Y23、Y27-Y29仍表现出对BTK一定的抑制活性，化合物Y5-Y6，Y27-Y28与IBN具有相当的BTK抑制活性。化合物Y1，Y4和Y23表现出对HDAC较强的抑制活性(IC50小于1μM)。化合物Y1-Y4、Y8-Y13、 Y23-Y26对T细胞白血病Jurkat细胞的生长抑制活性也较强。化合物Y1-Y4、Y8-Y13、Y23-Y24、 Y26对套细胞淋巴瘤细胞Jeko-1表现出了较强的抗增殖活性。因此，本发明还提供含羧酸和酰胺的吡唑并嘧啶类化合物物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为白血病和淋巴瘤。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例
实施例1、中间体2的制备
将4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶(5g,37mmol)溶于30ml DMF中，加入N-溴代丁二酰亚胺(7.9g， 44.4mmol)，搅拌，80℃油浴加热，溶液颜色由淡黄色变为红色，反应3小时，TLC检测，基本反应完全，冷却至室温，将反应液倒入300ml冰水中，搅拌，析出大量黄色固体，过滤，滤饼用冰水洗涤，干燥，得淡黄色固体6.33g，产率79.9％。Mp：270-273℃1H NMR(400MHz,DMSO)δ 13.77(s,1H),8.18(s,1H).
实施例2、中间体3的制备
取3-溴-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(2g，9.34mmol)、4-苯氧基苯硼酸(3.99g，18.68mmol)、四(三苯基膦)钯(531mg，0.46mmol)、K3PO4·3H2O(7.45g，28.02mmol)，加入250ml两颈瓶中，加入100ml溶剂(1,4-二氧六环：水＝4:1)溶解，氮气保护，超声脱去溶液中的氧气，用氮气置换装置中的空气，135℃油浴加热回流，反应30小时后TLC检测，反应基本完全。将反应液冷却至室温，用硅藻土过滤，将滤液减压蒸除，得黄色固体，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝100:1)，得淡黄色固体2.23g，产率78.8％。Mp：251-254℃1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.57(s,1H),8.22 (s,1H),7.67(d,J＝7.8Hz,2H),7.44(t,J＝7.5Hz,2H),7.20(d,J＝7.4Hz,1H),7.14(t,J＝7.7Hz, 4H).
实施例3、中间体4的制备
1、中间体4a的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(250mg，0.82mmol)、4-(溴甲基)苯甲酸甲酯 (224mg，0.98mmol)、K2CO3(170mg，1.23mmol)、KI(13mg，0.08mmol)加入50ml反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入100ml冰水中，搅拌，析出白色固体，加入30ml乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1)，得白色固体287mg，产率77.6％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.28(s,1H),7.66(d,J＝6.8Hz,2H),7.45–7.41(m,2H),7.25–7.20(m, 4H),7.13(t,J＝7.7Hz,5H),5.53(s,2H),3.52(s,3H).
2、中间体4b的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(250mg，0.82mmol)、3-(溴甲基)苯甲酸甲酯 (224mg，0.98mmol)、K2CO3(170mg，1.23mmol)、KI(13mg，0.08mmol)加入50ml反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入100ml冰水中，搅拌，析出白色固体，加入30ml乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1)，得白色固体302mg，产率81.6％。
3、中间体4c的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(250mg，0.82mmol)、2-(溴甲基)苯甲酸甲酯 (224mg，0.98mmol)、K2CO3(170mg，1.23mmol)、KI(13mg，0.08mmol)加入50ml反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入100ml冰水中，搅拌，析出白色固体，加入30ml乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1)，得淡黄色固体254mg，产率68.6％。
4、中间体4d的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(250mg，0.82mmol)、2-(4-(溴甲基)苯基)乙酸甲酯(238mg，0.98mmol)、K2CO3(170mg，1.23mmol)、KI(13mg，0.08mmol)加入50ml 反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入100ml 冰水中，搅拌，析出白色固体，加入30ml乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1)，得白色固体284mg，产率74.5％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.28(s,1H),7.66(d,J＝8.6Hz,2H),7.43(t,J＝7.9Hz,2H),7.23(dd,J ＝14.8,7.8Hz,5H),7.18–7.10(m,4H),5.53(s,2H),3.63(s,2H),3.58(s,3H).
5、中间体4e的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(303mg，1mmol)、3-羟基哌啶-1-甲酸甲酯 (238mg，1.5mmol)、三苯基膦(789mg,3mmol)加入50ml反应瓶中，加入20ml无水THF，冰浴条件下搅拌20分钟，取666mg DIAD逐滴加入反应液中，反应液变澄清，继续反应过夜，TLC 检测反应完全。硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，得白色固体320mg，产率72.1％。
6、中间体4f的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(303mg，1mmol)、(S)-3-羟基哌啶-1-甲酸甲酯(238mg，1.5mmol)、三苯基膦(789mg,3mmol)加入50ml反应瓶中，加入20ml无水THF，冰浴条件下搅拌20分钟，取666mg DIAD逐滴加入反应液中，反应液变澄清，继续反应过夜，TLC 检测反应完全。硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，得白色固体330mg，产率74.5％。
7、中间体4g的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(303mg，1mmol)、(R)-3-羟基哌啶-1-甲酸甲酯(238mg，1.5mmol)、三苯基膦(789mg,3mmol)加入50ml反应瓶中，加入20ml无水THF，冰浴条件下搅拌20分钟，取666mg DIAD逐滴加入反应液中，反应液变澄清，继续反应过夜，TLC 检测反应完全。硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，得白色固体302mg，产率68％。
8、中间体4h的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(250mg，0.82mmol)、3-溴-4-(溴甲基)苯甲酸甲酯(302mg，0.98mmol)、K2CO3(170mg，1.23mmol)、KI(13mg，0.08mmol)加入50ml反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入100ml 冰水中，搅拌，析出白色固体，加入30ml乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1)，得淡黄色固体286mg，产率 74.5％。
9、中间体4i的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(250mg，0.82mmol)、2-溴-4-(溴甲基)苯甲酸甲酯(302mg，0.98mmol)、K2CO3(170mg，1.23mmol)、KI(13mg，0.08mmol)加入50ml反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入100ml 冰水中，搅拌，析出白色固体，加入30ml乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1)，得淡黄色油状物245mg，产率 56.5％。
10、中间体4j的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(250mg，0.82mmol)、3-氯-4-(溴甲基)苯甲酸甲酯(258mg，0.98mmol)、K2CO3(170mg，1.23mmol)、KI(13mg，0.08mmol)加入50ml反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入100ml 冰水中，搅拌，析出白色固体，加入30ml乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1)，得白色固体289mg，产率72.6％。
11、中间体4k的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(200mg，0.66mmol)、3-硝基-4-(溴甲基)苯甲酸甲酯(217mg，0.79mmol)、K2CO3(137mg，0.99mmol)、KI(10mg，0.06mmol)加入50ml 反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入100ml 冰水中，搅拌，析出白色固体，加入25ml乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝300:1)，得淡黄色固体213mg，产率 65.1％。
12、中间体4l的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(200mg，0.66mmol)、3-甲氧基-4-(溴甲基) 苯甲酸甲酯(205mg，0.79mmol)、K2CO3(137mg，0.99mmol)、KI(10mg，0.06mmol)加入 50ml反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入 100ml冰水中，搅拌，析出白色固体，加入25ml乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1)，得白色固体190mg，产率59.7％。
13、中间体4m的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(200mg，0.66mmol)、4-(2-溴乙酰氨基)苯甲酸甲酯(215mg，0.79mmol)、K2CO3(137mg，0.99mmol)、KI(10mg，0.06mmol)加入50ml 反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入100ml 冰水中，搅拌，析出白色固体，加入25ml乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝100:1)，得白色固体201mg，产率61.3％。 Mp：180-183℃1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.69(s,1H),8.28(d,J＝12.4Hz,2H),7.81(d,J＝7.9 Hz,1H),7.68(t,J＝6.8Hz,3H),7.50(d,J＝7.9Hz,1H),7.44(t,J＝7.8Hz,2H),7.20(d,J＝7.4Hz, 1H),7.15(dd,J＝10.8,8.7Hz,4H),5.26(s,2H),3.84(s,3H).
14、中间体4n的制备
取3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(200mg，0.66mmol)、2-(4-(2-溴乙酰氨基) 苯基)乙酸甲酯(226mg，0.79mmol)、K2CO3(137mg，0.99mmol)、KI(10mg，0.06mmol)加入50ml反应瓶中，加入15ml DMF溶解搅拌，室温反应8小时，TLC检测反应完全。将反应液倒入100ml冰水中，搅拌，析出白色固体，加入25ml乙酸乙酯，分液漏斗萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，减压蒸除有机相，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200:1)，得淡黄色固体227mg，产率67.8％。
实施例4、目标化合物Y1-Y13的制备
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基苯甲酰胺(化合物Y1)
取氢氧化钾(2.83g，50.4mmol)溶于7ml无水甲醇中，超声溶解，得到溶液a。取盐酸羟胺 (2.33g，33.5mmol)溶于12ml无水甲醇中，超声溶解，冰浴，得到溶液b冰浴。将溶液a加入恒压滴液漏斗中，缓慢滴入溶液b中，冰浴条件下反应3小时，过滤沉淀(KCl)保留滤液，滤液用无水硫酸钠干燥6小时。将滤液加入50ml反应瓶中，取上一步即实施例3制备得到的中间体4a (120mg，0.26mmol)加入，反应一小时，溶液变澄清，继续反应15分钟后，TLC检测基本反应完全。减压蒸除大部分溶剂，加入10ml水，用1M的盐酸调PH为5-6，析出固体，过滤，乙酸乙酯洗两次，滤饼用甲醇重结晶，干燥后得灰白色固体Y1，197mg，产率80.8％。Mp：168-172℃。 MS(ESI)m/z:451.1[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.20(s,1H),9.09(s,1H),8.28(s,1H), 7.68(dd,J＝12.3,8.4Hz,4H),7.44(t,J＝7.8Hz,2H),7.33(d,J＝8.0Hz,2H),7.20(d,J＝7.4Hz,1H), 7.13(t,J＝8.7Hz,4H),5.60(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ163.10,157.63,156.55,156.52, 155.66,155.46,153.84,143.16,139.32,129.53,129.46,127.15,126.86,126.51,123.20,118.39,118.37, 96.69,48.87.
根据制备化合物Y1的方法，分别使用实施例3制备得到的中间体4b-4m制备得到化合物 Y2-Y13。
3-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基苯甲酰胺(化合物Y2)
淡粉色固体，产率72.5％。Mp：230-235℃。MS(ESI)m/z:451.4[M-H]-.1H NMR(400MHz, DMSO)δ11.23(s,1H),9.03(s,1H),8.29(s,1H),7.66(dd,J＝19.0,10.3Hz,4H),7.42(dd,J＝13.4, 6.8Hz,4H),7.19(d,J＝7.4Hz,1H),7.13(t,J＝8.7Hz,4H),5.60(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO) δ163.36,157.63,156.55,155.67,155.45,153.84,143.15,136.89,132.56,129.74,129.52,129.45,129.17, 128.05,127.17,125.82,125.29,123.19,118.38,96.69,48.94.
2-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基苯甲酰胺(化合物Y3)
淡粉色固体，产率71.8％。Mp：190-194℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.20(s,1H),9.22(s, 1H),8.24(s,1H),7.95(d,J＝7.6Hz,1H),7.69(d,J＝8.6Hz,2H),7.43(t,J＝7.8Hz,3H),7.40–7.35 (m,1H),7.20(d,J＝7.4Hz,1H),7.14(dd,J＝11.6,8.7Hz,4H),6.64(d,J＝7.5Hz,1H),5.96(s,2H). 13C NMR(100MHz,DMSO)δ168.83,158.75,157.64,156.75,156.52,155.29,144.33,138.87,136.24,
132.71,131.03,130.61,130.57,129.98,128.28,127.82,127.61,124.28,119.46,97.78,48.59.
2-(4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)-N-羟基乙酰胺(化合物 Y4)
白色固体，产率71.0％。Mp：180-184℃。MS(ESI)m/z:465.4[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO) δ10.63(s,1H),8.79(s,1H),8.28(s,1H),7.65(d,J＝8.6Hz,2H),7.45–7.41(m,2H),7.21(dd,J＝ 13.4,8.8Hz,5H),7.13(t,J＝7.7Hz,4H),5.51(s,2H),3.23(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ 166.22,157.59,156.50,155.68,155.38,153.69,142.94,134.91,134.71,129.52,129.45,128.84,128.53, 127.23,127.00,126.64,123.18,118.37,96.68,48.96.
2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-羟基乙酰胺(化合物 Y5)
白色固体，产率59.5％。Mp：150-152℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.51(s,1H),8.79(s,1H), 8.26(s,1H),7.66(d,J＝7.6Hz,2H),7.43(d,J＝7.0Hz,2H),7.24–7.08(m,5H),4.86(s,1H),2.98(s, 2H),2.84(d,J＝9.4Hz,1H),2.62(t,J＝10.1Hz,1H),2.24–2.12(m,1H),1.99(s,3H),1.77-1.71(m, 2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ166.16(s),158.64(s),157.53(s),156.81(s),156.07(s),154.25(s), 143.53(s),130.57(d,J＝7.1Hz),128.48(s),124.24(s),119.45(d,J＝5.6Hz),97.77(s),59.56(s), 57.92(s),53.31(d,J＝27.7Hz),29.57(s),24.49(s).
(R)-2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-羟基乙酰胺(化合物Y6)
白色固体，产率62.4％。Mp：151-154℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.51(s,1H),8.79(s,1H), 8.26(s,1H),7.66(d,J＝7.6Hz,2H),7.43(d,J＝7.0Hz,2H),7.24–7.08(m,5H),4.86(s,1H),2.98(s, 2H),2.84(d,J＝9.4Hz,1H),2.62(t,J＝10.1Hz,1H),2.24–2.12(m,1H),1.99(s,3H),1.77-1.71(m, 2H).
(S)-2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-羟基乙酰胺(化合物Y7)
白色固体，产率49.5％。Mp：149-152℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.49(s,1H),8.76(s,1H), 8.25(s,1H),7.65(d,J＝8.5Hz,2H),7.44(t,J＝7.9Hz,2H),7.30–7.09(m,5H),4.95–4.80(m,1H), 2.99(s,3H),2.92–2.80(m,1H),2.74–2.60(m,1H),2.25-2.16(m,1H),1.98(d,J＝3.0Hz,2H), 1.81-1.72(m,2H).
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-溴-N-羟基苯甲酰胺(化合物 Y8)
淡粉色固体，产率74.1％。Mp：182-185℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.14(s,1H),8.28(s,1H), 8.01(s,1H),7.67(d,J＝6.4Hz,3H),7.43(t,J＝7.9Hz,2H),7.20(d,J＝7.3Hz,1H),7.14(dd,J＝11.7, 8.6Hz,4H),6.98(d,J＝8.1Hz,1H),5.65(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ158.73,157.70, 157.54,156.71,156.66,155.26,144.67,139.36,134.39,131.41,130.61,130.57,129.71,128.10,126.95, 124.30,122.39,119.46,99.89,97.78,50.10.
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2-溴-N-羟基苯甲酰胺(化合物 Y9)
灰白色固体，产率65.0％。Mp：226-230℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.91(s,1H),9.24(s, 1H),8.30(s,1H),7.66(d,J＝8.6Hz,2H),7.61(s,1H),7.44(t,J＝7.9Hz,2H),7.32(d,J＝7.8Hz,1H), 7.27(d,J＝7.9Hz,1H),7.20(d,J＝7.4Hz,1H),7.14(t,J＝8.9Hz,4H),5.60(s,2H).13C NMR(100 MHz,DMSO)δ164.18,158.00,157.79,156.66,155.56,154.58,144.79,140.79,136.38,132.28,130.63, 130.55,130.13,127.85,127.23,124.34,120.25,119.52,119.46,97.72,49.34.
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-氯-N-羟基苯甲酰胺(化合物 Y10)
淡黄色固体，产率74.6％。Mp：190-193℃。MS(ESI)m/z:485.5[M-H]-.1H NMR(400MHz, DMSO)δ11.32(s,1H),9.17(s,1H),8.28(s,1H),7.83(s,1H),7.65(t,J＝8.4Hz,3H),7.43(t,J＝7.8 Hz,2H),7.19(d,J＝7.3Hz,1H),7.16–7.10(m,4H),7.07(d,J＝8.0Hz,1H),5.68(s,2H).13C NMR (100MHz,DMSO)δ162.79,158.74,157.69,156.73,156.60,155.23,144.63,137.74,134.34,132.48, 131.98,130.61,130.57,130.27,129.96,128.16,126.42,124.28,119.46,97.75,47.70.
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基-3-硝基苯甲酰胺(化合物 Y11)
黄色固体，产率65.0％。Mp：187-192℃。MS(ESI)m/z:496.5[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO) δ11.55(s,1H),9.29(s,1H),8.46(s,1H),8.26(s,1H),8.00(d,J＝8.1Hz,1H),7.66(d,J＝8.6Hz,2H), 7.43(t,J＝7.9Hz,2H),7.20(d,J＝7.4Hz,1H),7.14(dd,J＝11.5,8.5Hz,4H),7.04(d,J＝8.1Hz,1H), 5.97(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ162.11,158.76,157.74,156.69,155.42,148.00,144.88, 135.13,133.81,132.51,130.62,130.55,130.27,128.02,124.31,123.92,120.85,119.49,119.44,97.87, 47.30.
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基-3-甲氧基苯甲酰胺(化合物Y12)
淡黄色固体，产率68.3％。Mp：198-205℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.21(s,1H),9.05(s, 1H),8.27(s,1H),7.67(d,J＝8.6Hz,2H),7.44(d,J＝7.6Hz,2H),7.39(s,1H),7.24(d,J＝8.3Hz,1H), 7.19(d,J＝7.4Hz,1H),7.14(dd,J＝15.5,6.7Hz,4H),6.78(d,J＝7.8Hz,1H),5.55(s,2H),3.88(s, 3H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ163.08,157.63,156.53,155.68,155.54,155.37,154.09,143.13, 132.76,130.17,129.52,127.48,127.27,127.01,123.19,118.58,118.38,108.67,96.66,55.17,43.96.
4-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙酰氨基)-N-羟基苯甲酰胺(化合物 Y13)
淡粉色固体，产率52.5％。Mp：258-260℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.13(s,1H),10.67(s, 1H),8.97(s,1H),8.26(s,1H),7.68(dt,J＝25.3,8.5Hz,6H),7.44(t,J＝7.8Hz,2H),7.20(d,J＝7.4 Hz,1H),7.15(dd,J＝10.9,8.7Hz,4H),5.26(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ166.01,164.32, 158.66,157.68,156.71,156.40,155.85,144.18,141.55,130.62,130.47,128.29,128.21,128.10,124.32, 119.53,119.43,119.00,97.73,50.17.
实施例5、目标化合物Y14-Y22的制备
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸(化合物Y14)
取上一步即实施例3制备得到的中间体4a(160mg，0.35mmol)加入50ml反应瓶中，加入20ml 甲醇溶解，加入4ml 3M NaOH，油浴60℃加热反应8小时，TLC检测基本反应完全。减压蒸除溶剂，加入10ml水，用1M盐酸调PH为5-6，析出白色固体，过滤，用冰水洗涤两次，滤饼用甲醇重结晶，干燥后得白色固体Y14，140mg，产率91.5％。Mp：306-309℃。MS(ESI)m/z:436.4 [M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.92(s,1H),8.29(s,1H),7.90(d,J＝8.2Hz,2H),7.67(d,J＝ 8.6Hz,2H),7.43(t,J＝7.9Hz,2H),7.37(d,J＝8.1Hz,2H),7.19(d,J＝7.4Hz,1H),7.13(t,J＝9.1Hz, 4H),5.64(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ167.47,158.72,157.65,156.74,156.57,154.99,144.33, 142.49,130.60,130.55,130.12,128.20,128.10,124.27,119.47,119.44,97.76,49.94.
根据制备化合物Y14的方法，分别使用实施例3制备得到的中间体4b-4g、4m-4n制备得到化合物Y15-Y20、Y21-Y22。
3-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸(化合物Y15)
白色固体，产率87.7％。Mp：283-285℃。MS(ESI)m/z:436.5[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO) δ13.02(s,1H),8.30(s,1H),7.86(d,J＝11.7Hz,2H),7.66(d,J＝8.5Hz,2H),7.55(d,J＝7.7Hz,1H), 7.48(d,J＝7.6Hz,1H),7.45–7.40(m,2H),7.19(d,J＝7.4Hz,1H),7.14(dd,J＝15.2,6.6Hz,4H), 5.63(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ167.47,158.71,157.66,156.73,156.57,154.89,144.28, 138.15,132.63,131.54,130.60,130.52,129.44,129.02,128.90,128.19,124.28,119.47,97.75,49.89.
2-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸(化合物Y16)
白色固体，产率86.6％。Mp：262-265℃。1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.24(s,1H),7.91(d,J＝ 7.4Hz,1H),7.69(d,J＝8.5Hz,2H),7.43(t,J＝7.9Hz,2H),7.35(t,J＝6.1Hz,2H),7.19(d,J＝7.3Hz, 1H),7.17–7.10(m,4H),6.56(d,J＝6.9Hz,1H),5.98(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ158.74, 157.76,157.48,156.76,156.49,156.30,155.30,144.25,138.43,131.81,130.83,130.61,130.57,128.32, 127.68,127.53,127.13,124.27,119.46,97.76,48.76.
(4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)乙酸(化合物Y17)
白色固体，产率86.6％。Mp：272-275℃。MS(ESI)m/z:450.4[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO) δ12.29(s,1H),8.28(s,1H),7.66(d,J＝8.5Hz,2H),7.43(t,J＝7.8Hz,2H),7.25(s,1H),7.24–7.18 (m,4H),7.13(t,J＝7.7Hz,4H),5.53(s,2H),3.52(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ173.03, 158.65,157.53,156.75,156.43,154.75,144.06,135.92,134.88,130.60,130.54,130.07,128.29,128.08, 124.26,119.45,97.76,50.03.
2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)乙酸(化合物Y18)
白色固体，产率56.6％。Mp：140-142℃1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.26(s,1H),7.66(d,J＝8.4 Hz,2H),7.44(t,J＝7.7Hz,2H),7.22–7.10(m,6H),4.93–4.84(m,1H),3.24(s,2H),3.12(d,J＝7.6 Hz,1H),2.95(d,J＝10.3Hz,1H),2.85(t,J＝10.4Hz,1H),2.42–2.33(m,1H),1.98(s,2H),1.84– 1.73(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ172.58(s),158.63(s),157.53(s),156.79(s),156.10(s), 154.27(s),143.60(s),130.57(d,J＝6.1Hz),128.44(s),124.24(s),119.44(d,J＝5.8Hz),97.77(s), 56.91(s),53.14(s),52.28(s),29.48(s),24.19(s),21.66(s).
(R)-2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)乙酸(化合物Y19)
白色固体，产率66.4％。Mp：141-143℃1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.26(s,1H),7.66(d,J＝8.4 Hz,2H),7.44(t,J＝7.7Hz,2H),7.22–7.10(m,6H),4.93–4.84(m,1H),3.24(s,2H),3.12(d,J＝7.6 Hz,1H),2.95(d,J＝10.3Hz,1H),2.85(t,J＝10.4Hz,1H),2.42–2.33(m,1H),1.98(s,2H),1.84– 1.73(m,2H).
(S)-2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)乙酸(化合物Y20)
白色固体，产率59.2％。Mp：138-140℃1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.26(s,1H),7.66(d,J＝8.4 Hz,2H),7.44(t,J＝7.7Hz,2H),7.22–7.10(m,6H),4.98–4.89(m,1H),3.25(s,2H),3.18(d,J＝7.6 Hz,1H),3.02(d,J＝10.3Hz,1H),2.87(t,J＝10.4Hz,1H),2.48–2.36(m,1H),1.98(s,2H),1.94– 1.75(m,2H).
4-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙酰胺基)苯甲酸(化合物Y21)
白色固体，产率86.6％。Mp：240-244℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.75(s,1H),8.26(s,1H), 7.90(d,J＝8.5Hz,2H),7.68(d,J＝8.4Hz,4H),7.44(t,J＝7.9Hz,2H),7.20(d,J＝7.3Hz,1H),7.18 –7.11(m,4H),5.27(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ169.71,167.31,166.18,158.64,157.67, 156.71,156.39,155.85,155.31,130.96,130.62,130.46,124.32,119.53,119.42,118.99,97.68,48.42, 46.12,9.05.
(4-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙酰氨基)苯基)乙酸(化合物Y22)
粉色固体，产率71.8％。Mp：280-282℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.47(s,1H),8.26(s,1H), 7.68(d,J＝8.5Hz,2H),7.52(d,J＝8.4Hz,2H),7.44(t,J＝7.9Hz,2H),7.20(d,J＝8.0Hz,3H),7.18 –7.11(m,4H),5.22(s,2H),3.51(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ173.25,165.51,158.66,157.64, 156.73,156.36,155.64,144.08,137.66,130.70,130.61,130.47,130.21,128.27,124.30,119.55,119.52, 119.42,97.72,50.09.
实施例6、目标化合物Y23-Y29的制备
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-(2-氨基苯基)苯甲酰胺(化合物Y23)
取实施例4制备得到的化合物Y14(120mg，0.27mmol)，TBTU(103mg，0.32mmol)，三乙胺(55mg，0.54mmol)加入50ml反应瓶中，加入15ml无水DMF，搅拌溶解，冰浴条件下活化30分钟，加入邻苯二胺(35mg，0.32mmol)，室温条件下反应过夜，TLC检测基本反应完全。将反应液倒入100ml冰水中，有灰色固体析出，加入25ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和NH4Cl洗涤，饱和NaCl洗涤，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝300:1)得灰白色固体Y23 56mg，产率39.4％。Mp：197-200℃。MS(ESI)m/z:526.5[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO) δ9.60(s,1H),8.30(s,1H),7.92(d,J＝8.0Hz,2H),7.67(d,J＝8.6Hz,2H),7.47–7.36(m,4H),7.19 (d,J＝7.4Hz,1H),7.18–7.12(m,4H),7.11(s,1H),6.95(t,J＝8.1Hz,1H),6.76(d,J＝7.7Hz,1H), 6.58(t,J＝7.4Hz,1H),5.64(s,2H),4.88(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ165.48,158.72,157.84, 156.75,156.55,154.96,144.27,143.56,140.90,134.48,130.61,130.54,128.57,128.24,127.93,127.10, 126.94,124.28,123.66,119.46,116.65,116.51,97.78,50.00,46.11.
根据制备化合物Y23的方法，分别使用实施例4制备得到的化合物Y15-Y20制备得到化合物 Y24-Y29。
3-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-(2-氨基苯基)苯甲酰胺(化合物Y24)
灰白色固体，产率34.6％。Mp：175-178℃。1H NMR(600MHz,DMSO)δ9.69(s,1H),8.30(s,1H), 7.93(s,2H),7.67(d,J＝8.5Hz,2H),7.47(d,J＝4.4Hz,2H),7.43(t,J＝7.9Hz,2H),7.18(t,J＝7.4 Hz,1H),7.16–7.12(m,4H),7.11(s,1H),6.96(t,J＝7.5Hz,1H),6.77(d,J＝7.9Hz,1H),6.58(t,J＝ 7.3Hz,1H),5.64(s,2H),4.88(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ165.53,158.71,157.63,156.74, 156.55,154.92,144.29,143.63,137.89,135.43,131.08,130.81,130.54,129.06,128.24,127.75,127.34, 127.18,127.00,124.28,123.63,119.46,116.67,116.54,97.77,50.06,46.10.
2-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-(2-氨基苯基)苯甲酰胺(化合物Y25)
灰色固体，产率33.6％。Mp：205-209℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.84(s,1H),8.26(s,1H), 7.68(d,J＝8.5Hz,3H),7.47–7.39(m,5H),7.26(d,J＝7.6Hz,1H),7.20(d,J＝7.2Hz,1H),7.14– 7.10(m,4H),6.99(d,J＝7.1Hz,1H),6.78(d,J＝7.7Hz,1H),6.58(t,J＝7.4Hz,1H),5.83(s,2H), 5.07(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ167.67,158.72,157.62,156.73,156.47,154.97,144.23, 143.55,136.35,135.71,130.60,128.63,128.22,127.87,127.13,127.06,124.28,123.37,119.46,119.40, 116.52,116.36,97.83,52.47,47.66,46.06,7.64.
2-(4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)-N-(2-氨基苯基)乙酰胺 (化合物Y26)
灰色固体，产率24.8％。Mp：209-212℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.34(s,1H),8.28(s,1H), 7.66(d,J＝8.4Hz,2H),7.43(t,J＝7.8Hz,2H),7.28(dd,J＝16.8,8.1Hz,4H),7.19(d,J＝6.9Hz,1H), 7.13(t,J＝7.3Hz,5H),6.88(t,J＝7.5Hz,1H),6.69(d,J＝8.1Hz,1H),6.50(t,J＝7.5Hz,1H),5.53(s, 2H),4.81(s,2H),3.61(s,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ169.42,158.67,157.58,156.77,156.45, 154.77,152.86,152.04,144.04,142.34,136.21,130.60,130.55,129.79,128.32,128.12,125.75,124.25, 123.74,119.45,116.61,116.30,97.77,46.08,42.72,9.04.
2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-(2-氨基苯基)乙酰胺 (化合物Y27)
白色固体，产率36.6％。Mp：135-139℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.22(s,1H),8.26(s,1H), 7.65(d,J＝8.6Hz,2H),7.44(t,J＝7.9Hz,2H),7.24-7.11(m,6H),6.91(t,J＝7.6Hz,1H),6.76(d,J ＝7.5Hz,1H),6.57(t,J＝7.4Hz,1H),5.02–4.93(m,1H),4.80(s,2H),3.25–3.09(m,3H),2.95(d,J ＝11.5Hz,1H),2.77–2.70(m,1H),2.35–2.23(m,1H),2.02(d,J＝4.1Hz,2H),1.84(d,J＝0.5Hz, 2H).
2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-(2-氨基苯基)乙酰胺 (化合物Y28)
白色固体，产率48.1％。Mp：137-139℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.22(s,1H),8.26(s,1H), 7.65(d,J＝8.6Hz,2H),7.44(t,J＝7.9Hz,2H),7.24-7.11(m,6H),6.91(t,J＝7.6Hz,1H),6.76(d,J ＝7.5Hz,1H),6.57(t,J＝7.4Hz,1H),5.02–4.93(m,1H),4.80(s,2H),3.25–3.09(m,3H),2.95(d,J ＝11.5Hz,1H),2.77–2.70(m,1H),2.35–2.23(m,1H),2.02(d,J＝4.1Hz,2H),1.84(d,J＝0.5Hz, 2H).
2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-(2-氨基苯基)乙酰胺 (化合物Y29)
白色固体，产率32.5％。Mp：134-136℃。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.22(s,1H),8.26(s,1H), 7.65(d,J＝8.6Hz,2H),7.44(t,J＝7.6Hz,2H),7.24-7.11(m,6H),6.91(t,J＝7.6Hz,1H),6.76(d,J ＝7.9Hz,1H),6.57(t,J＝7.0Hz,1H),5.01-4.80(m,1H),4.80(s,2H),3.20(d,J＝9.5Hz,2H),3.12 (dd,J＝10.4,3.5Hz,1H),2.94(d,J＝11.5Hz,1H),2.73(t,J＝10.6Hz,1H),2.27(td,J＝10.8,2.6Hz, 1H),2.02(d,J＝4.1Hz,2H),1.86-1.79(m,2H).
实验例
BTK抑制活性测试、对HDAC的抑制活性、对Jurkat细胞的生长抑制和对JEKO-1细胞的生长抑制活性测定实验
1、化合物对BTK激酶抑制活性实验：
本实施例实验由英国公司Eurofins Pharma协助完成。
表1.目标化合物对BTK的抑制活性
注：ND：Not determined；IBN：依鲁替尼(Ibrutinib)。
在浓度为1μM下，化合物均表现出对BTK较强的抑制活性(抑制率大于80％)，在浓度为 50nM下，化合物Y1、Y5-Y12、Y17-Y18、Y23、Y27-Y29仍表现出对BTK一定的抑制活性，化合物Y5-Y6，Y27-Y28与IBN具有相当的BTK抑制活性。
2、化合物对HDAC抑制活性实验：
实验材料和方法：Boc-Lys(acetyl)-AMC(HeLa细胞核提取荧光底物)购于瑞士Bachem AG 公司，Tris-HCl、Trypsin和EDTA购于Sigma-Aldrich公司，TSA购于阿拉丁科技生化有限公司，甘油、NaCl、96孔平底荧光板购于鸿飞试剂公司。
缓冲液：15mM Tris-HCl(PH8.0)，250mM NaCl，250μM EDTA，10％甘油
HDAC酶溶液：按试验要求用Buffer稀释。
荧光底物溶液：底物用DMSO溶解配成30mM储备液于-20℃保存，使用时用HDACBuffer 稀释至300μM。
终止液：10mg/mL Trypsin，50mM Tris-HCl(PH8.0)，100mM NaCl，2μM TSA。
酶标仪：Varioskan Flash光谱扫描多功能读数仪。
实验步骤：
100％对照组：将10μL HDACs酶溶液与50μL HDAC Buffer混合，在37℃下孵育5min，加入40μL底物溶液后，继续在37℃孵育30min，加入100μL终止液，继续在37℃孵育20min,使用酶标仪测定反应液在390nm/460nm的荧光强度，数值为100％组荧光度。
空白对照组：将40μL底物溶液与60μL HDAC Buffer混合，在37℃下孵育30min，加入100 μL终止液后，继续在37℃孵育20min,使用酶标仪测定反应液在390nm/460nm的荧光强度，数值为空白组的荧光度。
实验组：将10μL HDACs酶溶液与50μL用HDAC Buffer稀释的待测化合物混合，在37℃下孵育5min，加入40μL底物溶液后，继续在37℃孵育30min，加入100μL终止液后，继续在37℃孵育20min,使用酶标仪测定反应液390nm/460nm的荧光强度，数值为待测化合物该浓度的荧光度。
根据公式计算不同浓度下的抑制率，用origin软件进行S曲线拟合，计算待测化合物IC50值，如表2所示。
表2.目标化合物对HDAC的抑制活性
注：ND：Not determined；SAHA：伏立诺他(Vorinostat)；IBN：依鲁替尼(Ibrutinib)。
表2结果说明，化合物Y1，Y4，Y10，Y11，Y13和Y23表现出对HDAC较强的抑制活性(IC50小于1μM)。
3、化合物对Jurkat和Jeko-1细胞生长抑制活性实验：
实验材料和方法：人套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1和Jurkat(美国典型培养物保藏中心-American Type Culture Collection，ATCC)，F-12培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)。药物溶于DMSO，初始浓度为20mM。
实验步骤：
采用细胞计数法考察化合物对Jurkat和Jeko-1细胞的生长抑制作用。将一定密度(10×104个 /mL)的细胞悬液接种于24孔培养板,2mL/孔，加入不同浓度药物于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中共同孵育72小时后，取细胞悬液50μL和台盼蓝工作液50μL等体积混合，取10μL混合液用血球计数板分别于显微镜下计数对照孔和加药孔的细胞数，用公式求得细胞生长抑制率，所得数值与空白对照组进行归一化处理，采用GraphPad 5.0来软件计算GI50值，如表3所示。
化合物存活率(％)＝给药组细胞数/空白组细胞数×100％
表3.目标化合物对Jurkat和Jeko-1细胞生长抑制活性
注：ND：Not determined；SAHA：伏立诺他(Vorinostat)；IBN：依鲁替尼(Ibrutinib)。
实验数据表明，化合物Y1-Y4、Y8-Y13、Y23-Y26对T细胞白血病Jurkat细胞的生长表现出了较强的抑制活性，活性优于依鲁替尼。化合物Y1-Y4、Y8-Y13、Y23-Y24、Y26对套细胞淋巴瘤细胞Jeko-1表现出了较强的抗增殖活性。Y1和Y23在两种细胞中的抑制生长作用都强于依鲁替尼和伏立诺他。
Claims (27)
1.化合物，其结构如式(I)所示：
其中，X、Y为两个连接基团，X选自取代或未取代的苄基，所述取代基选自硝基、卤素和C1～6直链或支链的烷氧基；
a、b表示连接位置，其中b位置与Y相连；哌啶-3-基；
Y为-(CH2)n-，n为选自0～4的任意整数；R选自羟基、羟氨基和邻苯二氨基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，Y为-(CH2)n-，n为0或1；
Y为-(CH2)n-，n为0时，X选自取代或未取代的苄基，所述取代基选自硝基、卤素和C1～6直链或支链的烷氧基；
a、b表示连接位置，其中b位置与Y相连；
Y为-(CH2)n-，n为1时，X选自取代或未取代的苄基，所述取代基选自硝基、卤素和C1～6直链或支链的烷氧基；
a、b表示连接位置，其中b位置与Y相连；哌啶-3-基。
3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，
当X为取代或未取代苄基，X为
a、b表示连接位置，其中b位置与Y相连；R1选自氢、硝基、卤素和C1～6直链或支链的烷氧基。
4.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于，X选自
5.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于，X选自
中的任一种。
6.根据权利要求5所述的化合物，其特征在于，X选自
7.根据权利要求5所述的化合物，其特征在于，X选自
8.根据权利要求5所述的化合物，其特征在于，R1为H时，X选自
R1为硝基、卤素或C1～6直链或支链的烷氧基时，X选自
9.根据权利要求8所述的化合物，其特征在于，R1为硝基或C1～6直链或支链的烷氧基时，X为
10.根据权利要求8所述的化合物，其特征在于，R1为C1～6直链或支链的烷氧基时，所述烷氧基选自甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基。
11.根据权利要求10所述的化合物，其特征在于，R1为甲氧基。
12.根据权利要求8所述的化合物，其特征在于，R1为卤素时，所述卤素选自F、Cl、Br和I。
13.根据权利要求12所述的化合物，其特征在于，R1为卤素时，所述卤素选自Cl或Br。
14.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述X为哌啶-3-基时，X选自
a、b表示连接位置，其中b位置与Y相连。
15.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自以下结构：
其中，Y为-(CH2)n-，n为0或1；R选自羟基、羟氨基和邻苯二氨基；R1选自氢、硝基、卤素和甲氧基。
16.根据权利要求15所述的化合物，其特征在于，式(II)结构中，根据R1的取代位置，式(II)选自以下结构：
其中，Y为-(CH2)n-，n为0或1；R选自羟基、羟氨基和邻苯二氨基；R1选自氢、硝基、卤素和甲氧基。
17.根据权利要求15所述的化合物，其特征在于，式(II)结构中，根据Y与苯环的连接位置，式(II)选自以下结构：
其中，Y为-(CH2)n-，n为0或1；R选自羟基、羟氨基和邻苯二氨基；R1选自氢、硝基、卤素和甲氧基。
18.根据权利要求1或2中任一项所述的化合物，其特征在于，其选自以下化合物：
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基苯甲酰胺；
3-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基苯甲酰胺；
2-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基苯甲酰胺；
2-(4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)-N-羟基乙酰胺；
2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-羟基乙酰胺；
(R)2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-羟基乙酰胺；
(S)2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-羟基乙酰胺；
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-溴-N-羟基苯甲酰胺；
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-2-溴-N-羟基苯甲酰胺；
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-氯-N-羟基苯甲酰胺；
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基-3-硝基苯甲酰胺；
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-羟基-3-甲氧基苯甲酰胺；
4-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙酰氨基)-N-羟基苯甲酰胺；
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸；
3-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸；
2-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸；
(4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)乙酸；
2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)乙酸；
(R)2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)乙酸；
(S)2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)乙酸；
4-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙酰胺基)苯甲酸；
(4-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙酰氨基)苯基)乙酸；
4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-(2-氨基苯基)苯甲酰胺；
3-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-(2-氨基苯基)苯甲酰胺；
2-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-N-(2-氨基苯基)苯甲酰胺；
2-(4-((4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)苯基)-N-(2-氨基苯基)乙酰胺；
2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-(2-氨基苯基)乙酰胺；
(R)2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-(2-氨基苯基)乙酰胺；
(S)2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-N-(2-氨基苯基)乙酰胺。
19.权利要求1至18中任一项所述的化合物的制备方法，其包括以中间体1为起始原料通过以下反应路线制备式(I)化合物：
其中，X、Y、R如权利要求1至18中任一项所定义，R2为羟基或卤素。
20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，R2为羟基或Br。
21.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以中间体1为起始原料，加热条件下与N-溴代丁二酰亚胺在DMF中发生取代反应得到中间体2；中间体2与4-苯氧基苯硼酸在四(三苯基膦)钯的催化下发生Suzuki反应得到中间体3；中间体3与
在碱性条件下发生亲核取代反应生成中间体4；中间体4在碱性条件下经氨解反应得式(I)化合物，或者中间体4在碱性条件下经水解反应得式(I)化合物，或者中间体4在碱性条件下经水解后再与邻苯二胺反应得式(I)化合物；
其中，X、Y、R如权利要求1至5中任一项所定义，R2为羟基或卤素。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，R2为羟基或Br。
23.药物组合物，其含有权利要求1至18中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
24.药物制剂，其包含权利要求1至18中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求23所述的组合物和药学上可接受的辅料和/或载体。
25.权利要求1至18中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求23所述的组合物在制备BTK抑制剂药物或HDAC抑制剂药物中的应用。
26.权利要求1至18中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求23所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
27.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为淋巴瘤或白血病。
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