CN111150752A - 鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，具体为鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用。所述鸡骨草提取物为鸡骨草石油醚提取物、鸡骨草乙酸乙酯提取物、鸡骨草正丁醇提取物和/或鸡骨草水提取物。本发明提供的鸡骨草提取物可促进bax蛋白和抑制bcl‑2表达来使肿瘤细胞发生凋亡，对制备抗癌药物，尤其是胃癌、肝癌、乳腺癌药物具有重要意义。

Description

鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用

【技术领域】

本发明涉及医药领域，具体涉及鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用。

【背景技术】

癌症是人类健康的第二大杀手，目前临床上使用化疗药物的过程中经常出现抗药性，癌细胞往往杀不死，肿瘤经常复发转移而导致死亡。其中很重要的原因之一是这部分癌细胞中的凋亡抑制基因(Bcl2基因)高表达，使肿瘤细胞抗凋亡而不死亡，从而常出现肿瘤复发转移。因此抑制肿瘤Bcl2基因表达的作用是提高药物疗效、彻底杀死癌细胞和防止肿瘤复发转移的重要途径之一。

中草药的天然产物中存在着广泛的生物活性物质,如何从中草药中寻找毒副作用小,作用独特的抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物,发挥我国传统中药的优势将为肿瘤的治疗另辟蹊径。

鸡骨草(Abrus cantoniensis)又名黄头草、黄仔强、大黄草、猪腰草，为豆科Leguminosae，该植物主要在分布于广东、广西等地。鸡骨草全草除其种子外均可入药，具有利湿退黄，清热解毒，疏肝止痛等功效，鸡骨草是一种药食两用植物，在春夏潮湿季节用来煲汤作食疗及制作凉茶等。鸡骨草药理作用是多方面的，它涉及到降脂保肝、抗菌、抗炎镇痛、增强免疫、抗氧化、促进伤口愈合、治疗母儿ABO血型不合等多种生物活性。

在前期试验研究中，发明人发现鸡骨草具有一定的抗肿瘤作用，提示鸡骨草作为传统的民间中草药在肿瘤治疗方面具有广阔的前景。

目前，尚未有鸡骨草提取物通过促进bax蛋白和抑制bcl-2表达使肿瘤细胞发生凋亡的报道。

【发明内容】

本发明的发明目的在于：针对现有技术的不足，提供鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用，所述鸡骨草提取物为鸡骨草石油醚提取物、鸡骨草乙酸乙酯提取物、鸡骨草正丁醇提取物和/或鸡骨草水提取物。

上述鸡骨草提取物的制备方法为：

(1)取鸡骨草全草干燥粉末用95％乙醇进行加热回流提取，滤过，滤液浓缩至膏状得鸡骨草的乙醇粗提取物；

(2)将步骤(1)的乙醇粗提取物溶于水中形成混悬液，分别用石油醚、乙酸乙酯与正丁醇依次萃取，回收萃取溶剂继而得到石油醚部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏、正丁醇部位浸膏和水层部位浸膏，对应标记为鸡骨草石油醚提取物、鸡骨草乙酸乙酯提取物、鸡骨草正丁醇提取物、鸡骨草水提取物。

本发明所述抗癌药物为抗胃癌药物、抗肝癌药物和/或抗乳腺癌药物。

发明人研究发现，所述鸡骨草提取物是通过促进bax蛋白和抑制bcl-2表达使肿瘤细胞发生凋亡的。

本发明所述抗癌药物包括有效量的鸡骨草提取物及药学上可接受的载体或辅料。本领域技术人员可通过常规药剂学手段选择加入载体或辅料将鸡骨草提取物制备成各种制剂，如加入淀粉或糊精制备成颗粒剂、胶囊剂、片剂；加入糖浆制备成糖浆剂，或直接冻干制成冻干制剂。

优选地，所述抗癌药物为冻干制剂。

本发明中，所述95％乙醇指的是体积分数为95％的乙醇。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

(1)本发明通过对裸鼠皮下移植瘤的抑瘤率、免疫指数影响探讨其抗肿瘤作用。体内药效实验显示，鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物均有抑瘤作用，其中乙酸乙酯提取物抑瘤作用最强，正丁醇提取物次之，水提取物最差，乙酸乙酯提取物高剂量组的抑瘤率均可达40％以上，且随着剂量的增加，抑瘤率明显增加，呈现量效关系，且可以降低肝脏指数，但对脾脏及胸腺指数无明显影响。正丁醇和水提取物对肝脏、脾脏和胸腺指数无影响。鸡骨草提取物在体外具有抑制肿瘤细胞增殖作用,其主要有效成分集中在乙酸乙酯、正丁醇和水部位，以乙酸乙酯提取部位最强。

(2)体内抗肿瘤活性研究表明鸡骨草乙酸乙酯提取物对BEL-7404裸鼠皮下移植瘤的抑瘤效果最强，可促进bax蛋白和抑制bcl-2表达来使肿瘤细胞发生凋亡。体外抗肿瘤活性研究表明，鸡骨草乙酸乙酯提取物可阻滞BEL-7404细胞周期于G0/G1期和诱导肿瘤细胞凋亡。

(3)本发明揭示了鸡骨草体内和体外抗肿瘤作用的物质基础，对于进一步分离抗肿瘤单体化合物，药材开发成抗肿瘤创新药物奠定基础。

【附图说明】

图1为鸡骨草提取物对裸鼠移植瘤的影响图；

图2为鸡骨草提取物对BEL-7404裸鼠皮下移植瘤组织形态的影响图(400X)；

图3为鸡骨草提取物对SGC-7901裸鼠皮下移植瘤组织形态的影响图(400X)；

图4为鸡骨草提取物对MCF-7裸鼠皮下移植瘤组织形态的影响图(400X)；

图5为BEL-7404肿瘤组织中bax的表达情况图(400X)；

图6为BEL-7404肿瘤组织中bcl-2的表达情况图(400X)；

其中，A为模型组，B为5-FU，C为乙酸乙酯提取物组，D为正丁醇提取物组，E为水提取物组。

图7为鸡骨草提取物对3种肿瘤细胞株形态的影响图。其中，A－人胃癌细胞SGC-7901；B－人肝癌细胞BEL-7404；C－人乳腺癌细胞MCF-7；a－对照组；b－石油醚提取物(0.6mg·mL-1)；c－乙酸乙酯提取物(0.6mg·mL-1)；d－正丁醇提取物(0.6mg·mL-1)；e－水提取物(0.6mg·mL-1)。

图8为Hoechst 33258荧光染色法观察鸡骨草乙酸乙酯提取物对BEL-7404细胞凋亡形态学的影响图(×200)；其中B—人肝癌细胞BEL-7404；0—0mg·ml-1；1—0.2mg·ml-1；2—0.4mg·ml-1；3—0.6mg·mL-1。

图9为鸡骨草乙酸乙酯提取物对BEL-7404肝癌细胞周期分布的影响图。

图10为鸡骨草乙酸乙酯提取物对BEL-7404细胞凋亡率的影响图。

【具体实施方式】

实施例1鸡骨草提取物的制备及体内抗肿瘤活性的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药材鸡骨草购自广西百色市(经右江民族医学院民族医学教研室覃道光副教授鉴定为豆科相思子属植物广东相思子的全草)。

1.1.2 细胞及实验动物细胞株人胃癌细胞株SGC－7901、人肝癌细胞株BEL-7404和人乳腺癌细胞株MCF-7细胞株购于中国科学院昆明细胞库。细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，在温度为37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱中培养。4-5周龄SPF级BALB/c裸鼠购买于湖南长沙天勤公司。合格证编号：NO.20181012，饲养于右江民族医学院实验动物中心。

1.1.3 主要试剂与仪器DMEM高糖培养基：赛默飞世尔科技公司；优级胎牛血清：AusGeneX；无菌PBS、CCK-8试剂：博士德；二甲基亚枫(DMSO)：Sigma公司；0.25％EDTA-胰酶：北京索来宝公司；兔抗人Bcl-2、Bax多克隆抗体(ABclonal)；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇等其它试剂均为分析纯。RE-3000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；循环水式多用真空泵：SHB-B88型，郑州长城科工贸有限公司；真空干燥箱：DZF-6020型，广州市星烁仪器有限公司；CO2培养箱：上海力康HF90；多功能酶标仪：德国伯托Tri Star LB941；电子天平：FA1204B型，上海天美天平仪器有限公司；ALPHA1-2/LD-Puls冷冻干燥机；德国CHRIST。

1.2 方法

1.2.1 鸡骨草提取物的制备

取鸡骨草全草干燥粉末用95％乙醇进行加热回流提取，滤过，滤液浓缩至膏状即得鸡骨草的乙醇粗提取物。将乙醇粗提取物溶于水中形成混悬液，分别用石油醚、乙酸乙酯与正丁醇依次萃取，回收萃取溶剂继而得到石油醚部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏、正丁醇部位浸膏和水层部位浸膏，对应标记为鸡骨草石油醚提取物、鸡骨草乙酸乙酯提取物、鸡骨草正丁醇提取物、鸡骨草水提取物。最后将浸膏制成冻干粉，准确称取鸡骨草4个不同部位，紫外灭菌，用纯水溶解，配成相应浓度的药液，分装存储。4℃冰箱保存，使用前放置常温，恢复室温。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型检测体内抗肿瘤活性

⑴人SGC－7901、BEL-7404、MCF-7裸鼠皮下移植瘤的建立取处于对数生长期的SGC－7901、BEL-7404、MCF-7细胞，用0.25％的胰酶消化成细胞悬液，用DMEM将细胞浓度配置成1×109/ml，并与Matrigel基质胶等比例混匀。按0.2ml/只接种于裸鼠右侧腋窝皮下，3周后，当肿瘤体积长到50mm3后,造模成功率100％，按随机原则，每种肿瘤细胞模型分11组，即：空白组：生理盐水；阳性组：5-FU 0.2g·kg-1；乙酸乙酯提取物组(0.1,0.4,0.8g·kg-1)；正丁醇提取物组(0.1,0.4,0.8g·kg-1)；水提取物组(0.1,0.4,0.8g·kg-1)。每组6只。每天给药一次，除阳性组腹腔注射给药外，其他组均灌喂给药。给药21天，每隔三天对裸鼠体质量、移植瘤长、短径进行测量，并按公式计算移植瘤的体积(体积V＝a×b2/2，a为长径，b为短径)，治疗结束后隔天采用脱颈处死法处死裸鼠，剥离移植瘤，肝脏、脾、胸腺并称量。

⑵裸鼠肿瘤生长抑制率处死小鼠后，剥离完整移植瘤，称取瘤体质量，计算肿瘤生长抑制率。以每组小鼠的平均瘤重作为疗效指标。分别按下列公式计算。抑瘤率(％)＝(模型组平均瘤质量－给药组平均瘤质量)/给药组平均瘤质量×100％肝、脾、胸腺指数计算，脏器指数＝脏器质量(mg)/体质量(g)。

⑶HE染色

将剥离下来的移植瘤置于4％的多聚甲醛溶液中固定，依次行脱水，石蜡包埋，切成4μm厚的切片。染色前将片子置于60℃培养箱加热过夜，脱蜡，最后进行HE染色并进行显微镜下观察。

⑷免疫组化检测bax蛋白和bal-2蛋白的表达

先进行切片脱蜡，用现配3％过氧化氢封闭15min；PBS洗3次，每次5min；10％正常山羊血清封闭30min；封闭后不洗，加一抗孵育(bax和bal-2均为1∶200)。4℃过夜；在室温平衡30min，用PBS洗3次，每次5min；二抗孵育，37℃1h；PBS洗3次，每次5min；DAB显色；显色完毕置于蒸馏水，梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3 统计数据处理

统计学方法采用SPSS16.0软件进行分析，实验数据以均数±标准差表示。多组间比较为单因素方差分析，数据均数用X±s表示，以P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 鸡骨草提取物对裸鼠皮下移植瘤抑瘤率、肝脏、脾脏、胸腺指数的影响

的影响结合图表1、2、3及图1，与模型组相比，阳性组可以显著抑制瘤重，对BEL-7404、SGC－7901、MCF-7裸鼠皮下移植瘤抑制率达到58.67％、53.42％、56.14％，对免疫脏器指数也表现出明显的抑制活性；鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物组均有抑制瘤重的作用，乙酸乙酯提取物组对BEL-7404、SGC－7901、MCF-7裸鼠皮下移植瘤的抑制率分别为46.67％、38.36％、29.82％；正丁醇提取物组：33.33％、16.43％、22.81％；水提取物组：13.33％、9.58％、7.02％，鸡骨草乙酸乙酯和正丁醇提取物对肝脏器指数表现出明显的抑制活性，但对脾脏及胸腺指数无明显抑制活性，而水提取物对免疫脏器指数无明显影响。

表1鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物对BEL-7404移植瘤体积、抑瘤率及肝、脾、胸腺指数的影响(

n＝6)

T Table 1.Effects of ethyl acetate,n-butanol and water extract ontumor volume,tumor inhibition rate and indexes of liver,spleen and thymus ofBEL-7404transplantation(

n＝6)

注：与模型组比较*P<0.05,**P<0.01

表2鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物对SGC-7901移植瘤体积、抑瘤率及肝、脾、胸腺指数的影响(

n＝6)

Table 2.Effects of ethyl acetate,n-butanol and water extract on tumorvolume,tumor inhibition rate and indexes of liver,spleen and thymus of SGC-7901transplantation(

n＝6)

注：与模型组比较*P<0.05,**P<0.01

表3鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物对MCF-7移植瘤体积、抑瘤率及肝、脾、胸腺指数的影响(

n＝6)

Table 3.Effects of ethyl acetate,n-butanol and water extract on tumorvolume,tumor inhibition rate and indexes of liver,spleen and thymus of MCF-7transplantation(x±s,n＝6)

注：与模型组比较*P<0.05,**P<0.01

2.2 HE染色结果200倍数光镜下观察HE染色。见图2～4从肿瘤组织切片HE染色后可以看出，模型组肿瘤细胞均匀，排列密集，生长状态良好，细胞核深染，呈圆形或卵圆形，大小不一，肿瘤细胞形态正常(图2、3、4－A)；5-FU阳性组肿瘤细胞排列疏松，大面积细胞核固缩、肿瘤细胞破裂，溶解的坏死区域及红染的干酪样坏死区(图2、3、4－B)；试验组肿瘤细胞呈不同程度的弥散性分布、红染、碎片状的干酪样坏死，模糊不清等现象(图2、3、4－C、D、E)。其中乙酸乙酯提取物组出现细胞核固缩、肿瘤细胞破裂，溶解的坏死区最严重。

2.3 鸡骨草乙酸乙酯提取物对BEL-7404裸鼠皮下移植瘤组织中bax、bcl-2两种蛋白表达的影响Bax和bcl-2的阳性反应为细胞膜、胞质和核膜上出现棕黄色或黄色颗粒,图5显示bax的表达情况,模型组中显示较浅的棕黄色的阳性表达,5-FU的阳性组棕黄色的阳性表达最为明显，乙酸乙酯提取物组随着给药剂量的增大，棕黄色的阳性表达越明显。

由图6所示bcl-2的表达情况,模型组中棕黄色表达率最高,5-FU的阳性组棕黄色表达率最低，鸡骨草乙酸乙酯提取物组棕黄色表达率随着剂量的增高而降低。因为实验在前期摸索阶段,故只是选取bax和bcl-2这两个典型的重要凋亡基因进行探索,在以后的项目研究中,需加大样本量,对caspase等更多的凋亡基因都进行深入研究,通过免疫组化以及WB检测其表达,并进行统计学比较,以更进一步深入的研究。

3 讨论

鸡骨草是民间常用于清利肝胆湿热的中药，其复方胶囊在临床上广泛应用，抗肿瘤研究也已有报道，但未具体研究到相应的单体化合物，因此，本实验在课题组前期研究鸡骨草体外抗肿瘤提取物结果的基础上进行体内抗肿瘤实验。目前，抗肿瘤药物机理主要为直接作用于肿瘤细胞及提高机体免疫功能，基于这两种机理，前期课题组采用体外肿瘤生长抑制作用探讨鸡骨草对肿瘤细胞直接杀伤的作用(CCK-8法)，本研究通过对裸鼠皮下移植瘤的抑瘤率、免疫指数影响探讨其抗肿瘤作用。体内药效实验显示，鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物均有抑瘤作用，其中乙酸乙酯提取物抑瘤作用最强，正丁醇提取物次之，水提取物最差，乙酸乙酯提取物高剂量组的抑瘤率均可达40％以上，且随着剂量的增加，抑瘤率明显增加，呈现量效关系。鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇提取物可以降低肝脏指数，但对脾脏及胸腺指数无明显影响。水提取物对肝脏、脾脏和胸腺指数无影响。本次研究发现鸡骨草乙酸乙酯提取物对BEL-7404裸鼠皮下移植瘤的抑瘤效果最强，可促进bax蛋白和抑制bcl-2表达和提高机体免疫功能来使肿瘤细胞发生凋亡。本研究揭示了鸡骨草体内抗肿瘤作用的物质基础，对于进一步分离抗肿瘤单体化合物，药材开发成抗肿瘤创新药物奠定基础。

实施例2鸡骨草提取物的制备及体外抗肿瘤活性的研究

2.1 材料与仪器

鸡骨草购自广西百色市(经右江民族医学院民族医学教研室覃道光副教授鉴定为豆科相思子属植物广东相思子的全草)；所用细胞株人胃癌细胞株SGC－7901、人肝癌细胞株BEL-7404和人乳腺癌细胞株MCF-7细胞株购于中国科学院昆明细胞库；RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基：赛默飞世尔科技公司；优级胎牛血清：AusGeneX；无菌PBS、CCK-8试剂：博士德；二甲基亚枫(DMSO)：Sigma公司；0.25％EDTA-胰酶：北京索来宝公司；Hoeshst33258染色液：凯基生物；PI染色试剂盒:生工生物(上海)有限公司乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等其它试剂均为分析纯。

RE-3000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；循环水式多用真空泵：SHB-B88型，郑州长城科工贸有限公司；真空干燥箱：DZF-6020型，广州市星烁仪器有限公司；CO2培养箱：上海力康HF90；多功能酶标仪：德国伯托Tri Star LB941；电子天平：FA1204B型，上海天美天平仪器有限公司；ALPHA1-2/LD-Puls冷冻干燥机；德国CHRIST；倒置荧光显微镜为尼康公司产品。流式细胞仪：BD公司。

2.2 鸡骨草提取物的制备

取鸡骨草全草干燥粉末用95％乙醇进行加热回流提取，过滤，浓缩至膏状即得鸡骨草的乙醇粗提取物。将乙醇粗提取物溶于水中形成混悬液，分别用石油醚、乙酸乙酯与正丁醇依次萃取，回收萃取溶剂继而得到石油醚部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏、正丁醇部位浸膏和水层部位浸膏，对应标记为鸡骨草石油醚提取物、鸡骨草乙酸乙酯提取物、鸡骨草正丁醇提取物、鸡骨草水提取物。最后将浸膏粉制成冻干粉，准确称取鸡骨草4个不同部位，用1％二甲亚砜(DMSO)溶液溶解，配成相应浓度的母液的浸膏，0.22μm过滤，分装存储。4℃冰箱保存，使用时以完全培养基稀释至所需浓度。

2.3 鸡骨草提取物体外抗肿瘤作用

2.3.1 细胞培养

BEL-7404细胞、SGC－7901细胞在1640培养基，MCF-7细胞在DMEM培养基(含10％胎牛血清，青霉素，链霉素各100U·mL-1)中，于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中常规培养。显微镜下观察细胞生长状态，每天更换一次培养基，每两天传代一次。

2.3.2 CCK-8检测

取对数生长的BEL-7404细胞、SGC－7901细胞、MCF-7细胞以5000个/每孔的密度接种于96孔板内于培养箱中继续培养。将鸡骨草4种萃取部位经0.22μm滤膜过滤后，用二甲亚砜(DMSO)梯度稀释，每孔细胞加入10μL使其在每孔的终浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg·mL-1、，每个浓度组各设5个复孔，于加药培养24h后每孔加入10ul cck-8溶液，继续培养1h，取出于450nm检测吸光度。

2.3.3 形态学观察

将BEL-7404细胞、SGC－7901细胞、MCF-7细胞以1万个/每孔的细胞密度接种于6孔板中，24h后加入200ul浓度为0.6mg·mL-1的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取部位处理24h后在倒置显微镜下观察细胞形态变化。

2.3.4 Hoechst 33258染色检测BEL-7404细胞凋亡

取处于对数生长期的BEL-7404细胞，接种于6孔培养板，每孔加入20×105个细胞。设空白对照组和不同浓度的给药组，细胞贴壁后，加入浓度为0.2、0.4、0.6mg·mL-1的乙酸乙酯提取物。药物作用24h后吸出培养基，用PBS清洗2次，每孔加入1ml的4％甲醛固定液，于4℃冰箱中固定30min，取出PBS洗3次，加500ml Hoechst 33258染液，在37℃培养箱中避光孵育30min。用PBS清洗3次，在激发波长350nm，发射波长460nm的荧光显微镜下随机拍照。

2.3.5 流式细胞仪检测鸡骨草乙酸乙酯萃取部位对BEL-7404细胞周期的影响

取对数生长期细胞以1×105个/每孔的密度接种于6孔板中，细胞贴壁后，加入200ul不同浓度乙酸乙酯提取物(0.2、0.4、0.6mg·mL-1)继续培养24h后，收集细胞用70％预冷乙醇固定，4℃避光过夜，用预冷PBS洗两遍，加入碘化丙啶避光染色30min，上流式细胞仪检测，分析各组样本DNA含量及周期变化。

2.3.6 Annexin V-FITC/PI检测鸡骨草乙酸乙酯提取物对BEL-7404肿瘤细胞凋亡率的影响

取对数生长期细胞以1×106个/每孔的密度接种于6孔板中，细胞贴壁后，加入200ul不同浓度乙酸乙酯提取物(0.2，0.4，0.6mg·mL-1)继续培养24h后，用0.25％胰酶消化离心，加入1×Binding Buffer配置成浓度为1×106个·mL-1的细胞悬液，吸取100ul细胞悬液于ep管中，分别加入5ul FITC和PI常温避光混匀孵育15min，加400ul1×BindingBuffer，并于一小时内上机检测。

2.3.6 数据处理

所有数据均为计量数据，表示为平均值±标准差(Mean±S.D.)。多组均数比较采用单因素方差分析。统计分析采用GraphPad Prism软件，P<0.05认为有统计学差异。

3.实验结果

3.1 鸡骨草提取物对四种细胞增殖的影响

为了确定鸡骨草四种萃取物抗肿瘤活性的主要部位，本文采用了CCK-8法检测鸡骨草四种萃取物对BEL-7404细胞、SGC－7901胃癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞的抗肿瘤活性。与对照组相比，作用24h后，乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位对BEL-7404细胞、SGC－7901胃癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞均有明显的抑制作用且呈浓度依赖关系。从表4可以明显看出，乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位抗肿瘤活性较强，提示鸡骨草抗肿瘤活性部位可能集中在乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。经拟合计算，石油醚部位作用BEL-7404细胞、SGC－7901胃癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞后的IC50值为77.88、39.0、61.1mg·mL-1，乙酸乙酯部位的IC50值为0.41、0.47、0.40mg·mL-1。正丁醇部位的IC50值为0.66、0.68、0.46mg·mL-1。水部位的IC50值为0.64、0.75、0.81mg·mL-1。

表4鸡骨草各部位提取液对SCG-7901、BEL-7404、MCF-7细胞增殖的影响(抑制率，

n＝6)

Table 1 Effects of extracts from different parts of Abruscantoniensis on proliferation of SCG-7901,BEL-7404and MCF-7cells(Inhibitionrate,

n＝6)

注：与0mg·mL^-1组比，**P<0.01，*P<0.05

3.2 鸡骨草提取物对肿瘤细胞形态的影响

在倒置显微镜下观察各组细胞形态，可见对照组的BEL-7404、SGC-7901、MCF-7细胞贴壁生长，大小均匀，胞质透亮，折光性好，增殖旺盛。如图7所示，3种肿瘤细胞经浓度为60mg·mL-1的乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位给药处理24h后，均显著改变了细胞的形态，均显著改变了细胞的形态，表现为细胞密度明显减小，细胞收缩变圆，细胞间距变大，贴壁作用减弱。石油醚部位和阴性对照组对3种细胞株密度影响不明显，形态上石油部位和阴性对照组3种细胞形态几乎没有变化。

3.3 鸡骨草不同提取部位对肿瘤细胞凋亡的促进作用

在倒置显微镜下观察Hoechst 33258荧光染色法染色结果显示，阴性对照组细胞饱满，胞浆丰富，胞核圆形或椭圆形，染色质荧光着色均匀。阳性对照组和加药组明显看到细胞数量减少，细胞核体积变小、皱缩，可见致密浓染荧光，染色体DNA呈浓染的团块状、颗粒状分布，提示出现了明显的凋亡特征，且凋亡细胞数目随着药物浓度的增加而增加，见图8。

3.4 鸡骨草不同浓度乙酸乙酯萃取部位对BEL-7404细胞周期分布的影响

采用流式细胞仪检测各组细胞周期分部情况，结果表明(表5及图9)，鸡骨草乙酸乙酯萃取部位可增加肝癌BEL-7404细胞G1期比例，降低S期及G2/M期比例，能诱导肝癌BEL-7404细胞发生凋亡并呈剂量依赖关系，与正常对照组相比具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

表5鸡骨草乙酸乙酯萃取部位对BEL-7404肝癌细胞周期分部的影响％

Table 2 Effects of ethyl acetate extract from abrus cantoniensis onthe cycle distribution of BEL-7404hepatocellular carcinoma cells％

*与对照组比较P＜0.01

3.5鸡骨草乙酸乙酯部位对BEL-7404细胞凋亡率的影响

采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，结果显示(见表6及图10)：以细胞早期凋亡与晚期调亡和计算细胞平均凋亡率，各浓度鸡骨草乙酸乙酯提取物作用于BEL-7404细胞24小时后，细胞凋亡率随着药物浓度的加大而增大，与正常对照组相比具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

表6鸡骨草乙酸乙酯部位对BEL-7404细胞凋亡率的影响

Table 3 Effect of ethyl acetate extract from abrus cantoniensis onthe apoptosis rate of BEL-7404cells

3.4 讨论

近年来，从中草药中提取的抗肿瘤活性成分越来越受到人们的关注。植物药具有较为显着的疗效和较小的不良反应等特点,在用于癌症治疗的药物中，植物药占比越来越大。我国有丰富的药用植物种质资源，筛选和分离中药抗癌活性成分，阐明其抗癌作用和机制，对抗癌药物的研究和开发以及癌症治疗具有十分重要的意义。

本研究以人的肿瘤细胞为筛选模型，采用CCK-8法，以体外抗肿瘤活性为指标，首次对鸡骨草醇提取物采用***溶剂法分离得到的4个不同萃取部位进行了筛选，实验结果显示鸡骨草的乙酸乙酯、正丁醇和水提取部位都是其抗肿瘤作用的活性部位，显微镜细胞形态观察结果也验证了CCK-8实验的结果。基于此，我们选择体外抗肿瘤最强的乙酸乙酯提取物对作用BEL-7404细胞后对其凋亡及流式周期进行分析研究，Hoechst 33258荧光染色法结果显示BEL-7404细胞呈现出典型的凋亡现象:细胞核固缩，染色质浓缩，断裂呈致密大小不等的蓝色荧光亮点；流式结果显示不同浓度的鸡骨草乙酸乙酯BEL-7404细胞后，细胞周期显著受到影响，处于DNA合成前期和静息期(G0/G1期)的细胞百分比显著升高，且随着鸡骨草乙酸乙酯萃取部位浓度的增加，G0/G1期的细胞百分比显著升高，而DNA合成期(S期)、合成后期及有丝***期(G2/M期)的细胞百分比降低；Annexin V-FITC/PI检测结果显示，鸡骨草乙酸乙酯提取物可以诱导BEL-7404细胞凋亡，凋亡率和鸡骨草乙酸乙酯提取物浓度成正比。

综上所述，鸡骨草在体外具有抑制肿瘤细胞增殖作用,其主要有效成分集中在乙酸乙酯、正丁醇和水部位，以乙酸乙酯提取部位最强。鸡骨草乙酸乙酯提取物可阻滞BEL-7404细胞周期于G0/G1期和诱导肿瘤细胞凋亡。本实验为鸡骨草用于临床治疗癌症提供了实验依据和理论基础，但鸡骨草抗肿瘤的药效物质基础和分子作用机制还有待进一步通过体内实验研究。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (7)

1.鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述鸡骨草提取物为鸡骨草石油醚提取物、鸡骨草乙酸乙酯提取物、鸡骨草正丁醇提取物和/或鸡骨草水提取物。

3.根据权利要求2所述的鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于所述鸡骨草提取物的制备方法为：

(1)取鸡骨草全草干燥粉末用95％乙醇进行加热回流提取，滤过，滤液浓缩至膏状得鸡骨草的乙醇粗提取物；

(2)将步骤(1)的乙醇粗提取物溶于水中形成混悬液，分别用石油醚、乙酸乙酯与正丁醇依次萃取，回收萃取溶剂继而得到石油醚部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏、正丁醇部位浸膏和水层部位浸膏，对应标记为鸡骨草石油醚提取物、鸡骨草乙酸乙酯提取物、鸡骨草正丁醇提取物、鸡骨草水提取物。

4.根据权利要求1所述的鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述抗癌药物为抗胃癌药物、抗肝癌药物和/或抗乳腺癌药物。

5.根据权利要求1所述的鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述鸡骨草提取物是通过促进bax蛋白和抑制bcl-2表达使肿瘤细胞发生凋亡的。

6.根据权利要求1所述的鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述抗癌药物包括有效量的鸡骨草提取物及药学上可接受的载体或辅料。

7.根据权利要求1所述的鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述抗癌药物为冻干制剂。

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