CN115433068A - 一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸的方法及应用，该方法首次从鸡骨草中分离并提取得到大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸四种物种，可实现鸡骨草中特定化学成分的药理研究，并为其在制备抗肿瘤药物以及抑制剂药物中的应用奠定了基础。

Description

一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原 儿茶酸的方法及应用
技术领域
本发明属于中药材提取技术领域，具体的说，是一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸的方法及应用。
背景技术
鸡骨草(Abrus cantoensis)是豆科相思子属的干燥全株植物，主产于我国岭南地区，主要分布于广东、广西等地，属于壮药药材之一。鸡骨草在我国具有悠久的用药历史，是一种药食同源的中草药，其富含多种生物活性成分，可全草入药。在民间，由于鸡骨草药理作用广泛，廉价且易栽培，人们常把鸡骨草用以煲凉茶、煲汤等方式食用，用于解暑祛湿，具有舒肝止痛、祛湿退黄、清热解毒等功效。鸡骨草富含多种生物活性，如具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌抗病毒、抗炎镇痛、降脂保肝、增强免疫力、促进伤口愈合的作用，是源于其含有多糖类、黄酮类、生物碱类、三萜类、蒽醌类化合物、微量元素和其他种类等多种化学成分，临床上常用于肝炎、湿热黄疸、胁肋不舒、胃脘胀痛、乳痈肿痛、跌打内伤等疾病的治疗，在食品、保健品、药品及化妆品等行业均具有较好的应用潜力。
鸡骨草虽具有多种生物活性，但其主要以抗肿瘤、抗氧化的药理作用被广泛研究。例如：公开号为CN111150752A的发明专利公开了鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用，其中分别研究了鸡骨草石油醚提取物、鸡骨草乙酸乙酯提取物、鸡骨草正丁醇提取物和/或鸡骨草水提物在制备抗癌(尤其是胃癌、肝癌、乳腺癌)药物中的应用，可促进bax蛋白和抑制bcl-2 表达来使肿瘤细胞发生凋亡。又如，公开号为CN107334688A的发明专利公开了一种具有抗氧化活性的鸡骨草黄酮及其提取方法和应用，主要采用酶促催化和乙醇超声提取的方式来提取其中的鸡骨草黄酮，可用于多种护肤品中，具有抗氧化功能。
现有研究表明，鸡骨草不仅具有多种生物活性，还含有丰富的化学成分，具有丰富的药理作用，但目前针对鸡骨草开展的研究仅仅停留在其中某一类化合物的药效作用上，例如：公开号为CN106265865A的发明专利公开的一种从鸡毛骨草叶或鸡骨草叶中提取酰胺酸类成分的方法，公开号为CN104069154A的发明专利公开的一种鸡骨草总皂苷的提取方法，以及公开号为CN103989733A的发明专利公开的一种鸡骨草游离氨基酸的粗提方法，等等，并未能深层次开展的针对特定单体化合物的药效学研究。众所周知，对中药材中提取并分离得到的活性单体化合物对研究其作用机制及其与药效关系均具有重要的意义，因此，为进一步促进鸡骨草在食品、保健品、药品甚至临床的推广和应用，本发明应运而生。
发明内容
本发明旨在获取鸡骨草中未知活性单体化合物并研究其药效，提供了一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸的方法，该方法首次从鸡骨草中分离并提取得到大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸四种物种，并对其进行研究，获得了其在制备抗癌药物、抗肿瘤药物以及抑制剂药物中的应用。
本发明通过下述技术方案实现：一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸的方法，包括以下步骤：
S1.将鸡骨草全草干燥且粉碎后，用8～10倍量的95％乙醇浸泡后于70～80℃回流提取 1h，重复2～3次，合并提取液后，经过滤、脱除乙醇后，即得提取浓缩液；
S2.将所述提取浓缩液加水稀释后，采用乙酸乙酯进行萃取，萃取比例为1～2∶2～4，萃取2～3次，分别合并萃取相和萃取液，萃取相和萃取液分别经减压浓缩制得乙酸乙酯部位浸膏和水部位浸膏；
S3.将所述乙酸乙酯部位浸膏用甲醇溶解后，采用硅胶柱层析法分离得到Fr.1-3组分、 Fr.4-7组分和Fr.8-10组分，
S4.取所述Fr.1-3组分用乙酸乙酯溶解并过滤，经浓缩、冷冻结晶、干燥后，即得大黄酚；
S5.取所述Fr.4-7组分用C18柱制备分离，再经浓缩、干燥后，即得木犀草素；
S6.取所述Fr.8-10组分用C18柱制备分离，再经浓缩、干燥后，即得相思子碱；
S7.取所述水部位浸膏溶解后，用C18柱制备分离，再经浓缩、干燥后，即得原儿茶酸。
进一步的，所述步骤S3中，硅胶柱层析法满足以下条件：
拌样硅胶：200～300目；
脱洗剂：二氯甲烷-甲醇；
梯度脱洗：40∶1→30∶1→20∶1→10∶1。
进一步的，所述步骤S5中，C18柱制备分离满足以下条件：
流动相：乙腈-0.1％甲酸水，体积比为30∶70；
波长：350nm。
进一步的，所述步骤S6中，C18柱制备分离满足以下条件：
流动相：0.4％三乙胺-0.2％磷酸，体积比为18∶82；
波长：280nm。
进一步的，所述步骤S7中，C18柱制备分离满足以下条件：
流动相：甲醇-0.1％PA，体积比为15∶85；
波长：260nm。
以及上述方法在制备抗肿瘤药物中的应用。
以及上述方法在制备DNA Topo I抑制剂药物中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
(1)本发明首次在鸡骨草中分离并提取得到了四种活性单体化合物，分别为大黄酚、木犀草素、相思子碱和原儿茶酸，实现了鸡骨草在抗肿瘤及抑制剂药物制备中的应用。
(2)本发明是以鸡骨草全草为原材料，乙酸乙酯为萃取剂，分别针对其乙酸乙酯萃取部位和水部位，结合硅胶柱层析和C18柱制备分离的方式，提取并分离得到大黄酚、木犀草素、相思子碱和原儿茶酸，可实现鸡骨草中特定化学成分的药理研究，为鸡骨草的临床应用奠定基础。
附图说明
图1为化合物1的1H-NMR谱图。
图2为化合物1的13C-NMR谱图。
图3为化合物1的红外光谱图。
图4为化合物1的紫外光谱图。
图5为化合物1的质谱图。
图6为化合物2的1H-NMR谱图。
图7为化合物2的13C-NMR谱图。
图8为化合物2的红外光谱图。
图9为化合物2的紫外光谱图。
图10为化合物2的质谱图。
图11为化合物3的质谱图。
图12为化合物3的1H-NMR谱图。
图13为化合物4的1H-NMR谱图。
图14为化合物4的13C-NMR谱图。
图15为化合物4的质谱图(1)。
图16为化合物4的质谱图(2)。
图17为木犀草素对MCF-7细胞作用48h的流式结果(Comp-FITC-A∶Annexin-V-FITC-A)。
图18为木犀草素对SGC-7901细胞作用48h的流式结果(Comp-FITC-A∶Annexin-V-FITC-A)。
图19为木犀草素对BEL-7404细胞作用48h的流式结果(Comp-FITC-A∶Annexin-V-FITC-A)。
图20为喜树碱对DNA Topo I的抑制作用结果。
图21为木犀草素对DNA Topo I的抑制作用结果
其中，图17至图19中，Control指不加药的空白对照组的流式结果；0.1％DMSO指0.1％二甲基亚砜的流式结果；Reagent指50μL 0.1M NaCl的流式结果。
图20中，从左到右顺序为：M：λ-Hind III marker，第1泳道：添加pBR322，不添加DNA Topo I，第2泳道：添加pBR322和DNA Topo I，第3、4、5、6、7、8、9泳道：加入喜树碱的药物浓度分别为200、100、50、25、10、5、2.5μM。
图21中，从左到右顺序为：M：λ-Hind III marker，第1泳道：添加pBR322，不添加DNA Topo I，第2泳道：加入阳性对照药喜树碱200μM；第3泳道：添加pBR322和DNA Topo I，第4、5、6、7、8泳道：加入木犀草素的药物浓度分别为240、120、60、30、15μM。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
本实施例是一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸的方法，其步骤包括：
步骤一，将干燥且粉碎后的鸡骨草全草约44Kg，用10倍量的95％乙醇浸泡后于75℃回流提取1，重复2次，合并提取液后，用滤布过滤，再经减压浓缩后，即得提取浓缩液。
步骤二，将上述提取浓缩液加纯水稀释后，采用乙酸乙酯进行萃取，萃取比例为1∶2，萃取3次，分别合并萃取相和萃取液，将萃取相经减压浓缩制得乙酸乙酯部位浸膏，萃取液采用相同方法制得水部位浸膏。
步骤三，将上述乙酸乙酯部位浸膏用甲醇溶解后，用200目硅胶干法拌样，硅胶湿法上柱，以二氯甲烷-甲醇为脱洗剂，按40∶1→30∶1→20∶1→10∶1进行梯度脱洗，收集组分，利用TLC对化合物进行跟踪检测，合并Rf值相同流分，即可得到Fr.1-组分、Fr.4-7组分和Fr.8-10组分。
进一步的，将Fr.1-3组分用乙酸乙酯溶解并过滤，经浓缩、冷冻结晶、干燥后，即得化合物1(500mg)；将Fr.4-7组分以乙腈-0.1％甲酸水(体积比30∶70)为流动相，在350nm 波长下，用C18柱制备分离，再经浓缩、干燥后，即得化合物2(500mg)；将Fr.8-10组分以 0.4％三乙胺-0.2％磷酸(体积比18∶82)为流动相，在280nm波长下，用C18柱制备分离，再经浓缩、干燥后，即得化合物3(300mg)。
步骤四，将上述水部位浸膏溶解后，以甲醇-0.1％磷酸(体积比15∶85)为流动相，在260nm波长下，用C18柱制备分离，再经浓缩、干燥后，即得化合物4(300mg)。
实施例2：
本实施例是一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸的方法，其步骤包括：
步骤一，将干燥且粉碎后的鸡骨草全草约44Kg，用8倍量的95％乙醇浸泡后于70℃回流提取1h，重复2次，合并提取液后，用滤布过滤，再经减压浓缩后，即得提取浓缩液。
步骤二，将上述提取浓缩液加纯水稀释后，采用乙酸乙酯进行萃取，萃取比例为1∶3，萃取2次，分别合并萃取相和萃取液，将萃取相经减压浓缩制得乙酸乙酯部位浸膏，萃取液采用相同方法制得水部位浸膏。
步骤三，将上述乙酸乙酯部位浸膏用甲醇溶解后，用300目硅胶干法拌样，硅胶湿法上柱，以二氯甲烷-甲醇为脱洗剂，按40∶1→30∶1→20∶1→10∶1进行梯度脱洗，收集组分，利用TLC对化合物进行跟踪检测，合并Rf值相同流分，即可得到Fr.1-组分、Fr.4-7组分和Fr.8-10组分。
进一步的，将Fr.1-3组分用乙酸乙酯溶解并过滤，经浓缩、冷冻结晶、干燥后，即得化合物1(500mg)；将Fr.4-7组分以乙腈-0.1％甲酸水(体积比30∶70)为流动相，在350nm 波长下，用C18柱制备分离，再经浓缩、干燥后，即得化合物2(500mg)；将Fr.8-10组分以 0.4％三乙胺-0.2％磷酸(体积比18∶82)为流动相，在280nm波长下，用C18柱制备分离，再经浓缩、干燥后，即得化合物3(300mg)。
步骤四，将上述水部位浸膏溶解后，以甲醇-0.1％磷酸(体积比15∶85)为流动相，在 260nm波长下，用C18柱制备分离，再经浓缩、干燥后，即得化合物4(300mg)。
实施例3：
本实施例是一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸的方法，其步骤包括：
步骤一，将干燥且粉碎后的鸡骨草全草约44Kg，用10倍量的95％乙醇浸泡后于75℃回流提取1h，重复3次，合并提取液后，用滤布过滤两次，使用旋转蒸发仪在55℃下，对滤液进行减压浓缩至接近无醇的半流动状态的提取物，富集旋蒸得到的提取物继续于水浴锅将残留的乙醇蒸出直至无醇味，最后得到深褐色的粘稠状的提取浓缩液。
步骤二，将上述提取浓缩液加纯水稀释后，采用乙酸乙酯进行萃取，萃取比例为1∶1，萃取3次，分别合并萃取相和萃取液，将萃取相经减压浓缩制得乙酸乙酯部位浸膏，萃取液采用相同方法制得水部位浸膏。
步骤三，将上述乙酸乙酯部位浸膏用甲醇溶解后，用300目硅胶干法拌样，取15倍量硅胶湿法上柱，以二氯甲烷-甲醇为脱洗剂，按40∶1→30∶1→20∶1→10∶1进行梯度脱洗，收集组分，利用TLC对化合物进行跟踪检测，合并Rf值相同流分，即可得到Fr.1-组分、Fr.4-7 组分和Fr.8-10组分。
进一步的，将Fr.1-3组分用乙酸乙酯溶解并过滤，经浓缩、冷冻结晶，然后使用50℃鼓风干燥，40℃减压干燥，即得化合物1(500mg)；将Fr.4-7组分以乙腈-0.1％甲酸水(体积比 30∶70)为流动相，在350nm波长下，用C18柱制备分离，将其产物制备液于50℃浓缩至固体析出，经50℃鼓风干燥，40℃减压干燥，即得化合物2(500mg)；将Fr.8-10组分以0.4％三乙胺-0.2％磷酸(体积比18∶82)为流动相，在280nm波长下，用C18柱制备分离，将其产物制备液于45℃浓缩至干，经40℃鼓风干燥，40℃减压干燥，即得化合物3(300mg)。
步骤四，将上述水部位浸膏溶解后，以甲醇-0.1％磷酸(体积比15∶85)为流动相，在 260nm波长下，用C18柱制备分离，将其产物制备液于50℃浓缩，经冷冻干燥、40℃减压干燥，即得化合物4(300mg)。
实施例4：化合物1的结构鉴定
化合物1采用实施例3的方法提取并分离得到，化合物1为橙黄色固体，熔点196.0℃～ 198.0℃。溶于DMSO，难溶于甲醇、乙腈、水。用石油醚-乙酸乙酯-甲酸(10∶1∶0.2)，环己烷-丙酮-甲酸(8∶0.5∶0.1)，环己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶1∶0.1)在硅胶G薄层板上分别展开，在365nm紫外光下检视荧光，化合物1的斑点清晰单一。
由化合物1的1H-NMR(400MHz，CDCl3)谱图(见图1)中显示δH 12.07(1H,s)和δH11.96(1H,s)是2个与羰基共轭的活泼氢信号，δH 7.80～7.75(1H,m)，δH 7.64(1H,t,J＝8.0Hz)，δH 7.60(1H,s)，δH 7.28～7.25(1H,m)，δH 7.06(1H,s)是5个苯环氢信号，δH 2.44(3H,s)是一个甲基基团，其化学位移值高达δH 2.44，说明其连接在苯环上。
由化合物1的13C-NMR(100MHz，CDCl3)谱图(见图2)中显示δC 192.4，δC 181.8 是2个羰基碳信号，δC 162.3，δC 124.5，δC 149.3，δC 121.3，δC 119.8，δC 136.9，δC 124.3，δC162.6，δC 133.2，δC 133.5，δC 115.8，δC 113.6是12个苯环碳信号，说明该化合物1有2个苯环，δC 22.2是苯环上的甲基的碳信号。从氢谱和碳谱结合来看，该化合物有2个苯环，2个羰基，1个甲基。
此外，在红外光谱图(见图3)中显示分子结构中存在羟基(3448cm-1)、双键(1676cm-1)、芳环(1605cm-1)等特征峰信号；其UV吸收峰λmax＝224，256，287，430nm(见图4)显示为醌样结构，结构中有增色基团。ESI-MS m/z(见图5)：253.2[M-H]─，分子量M＝254.24。
结合1H-NMR、13C-NMR、IR、UV等数据，推断该化合物1的分子式为：C15H10O4，计算不饱和度为Ω＝11。综上所述，鉴定单体化合物1为大黄酚(Chrysophanol)。其化学结构见下式(1)，化合物氢信号和碳信号分别见表1和表2。
Figure RE-GDA0003718003120000071
表1化合物1的核磁共振氢谱(1H-NMR)数据与参考文献数据对照
Figure RE-GDA0003718003120000072
注：实际测试条件：1H NMR(400MHz,CDCl3)；
文献测试条件：1H NMR(400MHz,CDCl3)。
表2化合物1的核磁共振碳谱(13C-NMR)数据与参考文献数据对照
Figure RE-GDA0003718003120000073
Figure RE-GDA0003718003120000081
注：实际测试条件：13C-NMR(100MHz,CDCl3)；
文献测试条件：13C-NMR(100MHz,CDCl3)。
实施例5：化合物2的结构鉴定
化合物2采用实施例3的方法提取并分离得到，化合物2为黄色固体，溶于DMSO、甲醇，不溶于乙腈、水。用甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(5∶4∶1∶0.2)，氯仿-甲醇-甲酸-水(5∶1∶0.5∶0.2)，石油醚-乙酸乙酯-甲酸-水(4∶7∶0.3∶0.2)为展开剂在硅胶G薄层板上分别展开，取出，晾干。1％AlCl3乙醇溶液，晾干，置于365nm紫外灯下检视荧光。化合物2的斑点清晰单一，原点无痕迹。
由化合物2的1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)谱图(见图6)中显示δH 6.19(1H,d,J＝2.0Hz)，δH 6.44(1H,d,J＝2.0Hz)，δH 6.67(1H,s)，δH 6.89(1H,d,J＝8.3Hz)，δH 7.44～7.37 (2H,m)是6个苯环氢信号，δH 12.97(1H,s)是1个与羰基共轭的活泼氢信号，是黄酮5位的特征羟基氢信号，说明该化合物2是黄酮类化合物。
由化合物2的13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)谱图(见图7)中显示δC 164.0，δC 103.0，δC181.7，δC 161.6，δC 98.9，δC 164.2，δC 93.9，δC 157.4，δC 103.8，δC 121.6，δC 113.4，δC145.8，δC 149.7，δC 116.1，δC 119.0是15个苯环碳或烯碳信号，说明该化合物2是黄酮类化合物。
此外，在红外光谱图(见图8)中显示结构中存在羟基(3418cm-1)、羰基(1655cm-1)、芳香基团(1501cm-1)等特征信号峰。其UV吸收峰λmax＝207，253，351nm(见图9)显示结构中存在碳碳双键(207nm)。ESI-MS m/z(见图10)：285.0[M-H]-，分子量M＝286.24。
结合1H-NMR、13C-NMR、IR、UV数据，推断该化合物2的分子式为：C15H10O6，计算不饱和度为Ω＝11。综上所述，鉴定单体化合物2为木犀草素(Luteolin)，其化学结构见下式(2)，化合物2的氢信号和碳信号分别见表3和表4。
Figure RE-GDA0003718003120000091
表3化合物2的核磁共振氢谱(1H-NMR)数据与参考文献数据对照
Figure RE-GDA0003718003120000092
注：实际测试条件：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)；
文献测试条件：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)。
表4化合物2的核磁共振碳谱(13C-NMR)数据与参考文献数据对照
Figure RE-GDA0003718003120000093
Figure RE-GDA0003718003120000101
注：实际测定条件：13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)；
文献测试条件：13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)。
实施例6：化合物3的结构鉴定
化合物3采用实施例3的方法提取并分离得到，化合物3为类白色固体，ES-TOF MS+m/z(见图11)：219.3[M+H]+，分子量M＝218.26，分子式为：C12H14N2O2，计算不饱和度为Ω＝7。
由化合物3的1H-NMR结构数据显示：存在δH 10.87(1H,s,1-NH)，δH 7.58(1H,m,H-4)，δH 7.33(1H,m,H-7)，δH 7.22(1H,s,H-2)，δH 7.05(1H,m,H-6)，δH 6.98(1H,m,H-5)，δH3.33～3.50(3H,m,H-10,H-11)，δH 2.36(3H,s,N-CH3)。在1H-NMR谱图(见图12) 中显示δH10.87(1H,s)是活泼氢信号，推测是NH信号，δH 7.58(1H,m)，δH 7.33(1H,m)，δH 7.22(1H,s)，δH 7.05(1H,m)，δH 6.98(1H,m)是5个苯环或双键氢信号，δH 3.33～3.50 (3H,m,H-10,H-11)是脂肪氢或者连氮碳上的氢信号，δH 2.36(3H,s)是甲基氢信号。
结合1H-NMR、MS数据，推断该化合物3的分子式为：C12H14N2O2，综上所述，鉴定单体化合物3为相思子碱(Abrine)，其化学结构见下式(3)。
Figure RE-GDA0003718003120000102
实施例7：化合物4的结构鉴定
化合物4为白色粉末，化合物4的ES-TOF MS+m/z(见图15和图16)：[M+Na]+：m/z177.01；[M+K]+：m/z 193；两倍峰[2M+Na]+：m/z 331.04；三倍峰[3M+Na]+：m/z 485.36，分子量M＝154.12。
由化合物4的1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)谱图(见图13)中显示δH 7.35(1H,d,J ＝2.0Hz)，δH 7.30(1H,dd,J＝8.2,2.1Hz)，δH 6.79(1H,d,J＝8.2Hz)是3个苯环氢信号，根据氢的峰型和耦合常数，可以得知这3个氢是ABX耦合***。
由化合物4的13C-NMR(100M Hz，DMSO-d6)谱图(见图14)在13C-NMR中显示δC 169.2是一个羧酸或酯羰基碳信号，δC 117.0，δC 118.4，δC 123.5，δC 123.7，δC 146.7，δC 151.8是6 个苯环碳信号，说明该化合物4存在一个苯环和一个羧基基团。
结合1H-NMR、13C-NMR、MS数据，推断该化合物4的分子式为：C7H6O4，计算不饱和度为Ω＝5。综上所述，鉴定单体化合物4为原儿茶酸(Protocatechuic acid)，其化学结构见下式(4)，化合物4的氢信号和碳信号分别见表5和表6。
Figure RE-GDA0003718003120000111
表5化合物4的核磁共振氢谱(1H-NMR)数据与参考文献数据对照
Figure RE-GDA0003718003120000112
注：实际测试条件：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)；
文献测试条件：1H NMR(300MHz,DMSO-d6)。
表6化合物4的核磁共振碳谱(13C-NMR)数据与参考文献数据对照
Figure RE-GDA0003718003120000113
Figure RE-GDA0003718003120000121
注：实际测试条件：13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)；
文献测试条件：13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)。
实施例8：抗肿瘤活性实验
一、单体化合物对肿瘤细胞的增值抑制作用
(1)细胞的培养和铺板
人乳腺癌MCF-7细胞、人胃癌SGC-7901细胞、人肝癌BEL-7404细胞，3种癌细胞的培养：MCF-7、BEL-7404细胞株：含DMEM+10％FBS+1％P/S；SGC-7901细胞株： RPMI-1640+10％FBS+1％P/S，3株癌细胞均置于5％CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。取正常培养且处于对数生长期的3种细胞株，用PBS缓冲液漂洗2～3遍，取0.8～1mL 0.25％胰蛋白酶消化后，用完全培养基终止消化，吸取细胞悬液转移至离心管，并置于离心机1000 rpm离心3min，弃去上清液，收集细胞，进行细胞计数，分别调整细胞浓度为3×103cell/ 孔，接种于96孔板，每孔90μL分别放入培养箱中静置培养24h。
(2)药物的溶解于稀释
大黄酚(分子量：254.24)，母液：DMSO 5mg/mL(19.67mM)。1mM：1.867mL细胞完全培养基+10μL母液；
相思子碱(分子量：218.25)，母液：0.1M NaOH溶解后再用1M HCl中和至PH＝7，8.73mg/mL(40mM)；
(3)药物干预
实验设定调零组(仅加培养基)，0加药组即Control对照组(含细胞液及培养液，不含药物)，DMSO组(含细胞液、培养液及药物溶剂DMSO，不含药物)，实验组(含细胞液、培养液以及药物)，药物为大黄酚、木犀草素，待细胞贴壁培养24h后，更换为含不同浓度的药物的DMEM/RPMI-1640完全培养基且继续置于5％CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。药物干预3种肿瘤细胞的时间分别为24h、48h和72h，其中药物大黄酚在3个时间段干预3种肿瘤细胞的浓度为：5、10、50、100、200、300μM；药物木犀草素在24h、48h和 72h时间段干预3种肿瘤细胞的浓度为:5、10、20、40、60、80、100μM。每孔加入100μL 含不同浓度药物的培养基，每种浓度设6个复孔。
(4)MTT法比色法检测
药物干预3个不同时间点后，在实验终止前，每孔加入MTT溶液100μL，继续放入培养箱中37℃避光孵育4h。孵育结束时甩去培养液，各孔加入150μL DMSO终止反应，随后放入摇床震荡摇匀使结晶物充分溶解，溶解时间根据结晶的大小以及溶解情况决定。使用多功能酶标仪测定各孔在波长490nm处的吸光度值(Optical Density,OD)，实验结果按以下公式A计算，计量资料以均数±标准差
Figure RE-GDA0003718003120000133
表示，并计算药物在3个时间点干预3种细胞株的IC50值，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
公式A：细胞存活率(％)＝(实验组-调零组)/(0加药组-调零组)×100％。
(5)实验结果
分别以不同浓度的大黄酚干预MCF-7、SGC-7901和BEL-7404三种肿瘤细胞24、48、72h的活力的影响结果见表7，实验数据表明大黄酚在3个时间点对3种肿瘤细胞体外增殖均有抑制作用，其肿瘤细胞存活率随着药物浓度减小而增大；抑制作用随着药物浓度增大而增加，呈浓度依赖性。通过计算大黄酚对3种肿瘤细胞干预的3个时间点的IC50值，发现大黄酚对3种肿瘤细胞细胞干预72小时的IC50值分别为108.5μM，39.21μM，46.30μM。比较大黄酚对3种细胞作用72h的IC50值，发现大黄酚对3种细胞的敏感程度为：SGC-7901 ＞BEL-7404＞MCF-7。由此可知，大黄酚对SGC-7901细胞较为敏感。
表7大黄酚对3种细胞增值的影响(存活率，
Figure RE-GDA0003718003120000131
n＝6)
Figure RE-GDA0003718003120000132
Figure RE-GDA0003718003120000141
注：与Control(空白对照)组比，**P<0.01，*P<0.05。
分别以不同浓度的木犀草素干预MCF-7、SGC-7901和BEL-7404细胞24、48、72h 的活力的影响结果见表8，实验数据表明木犀草素对3种肿瘤细胞体外增殖均有抑制作用，其肿瘤细胞存活率随着药物浓度减小而增大；抑制作用随着药物浓度增大而增加。通过计算木犀草素对3种肿瘤细胞干预的3个时间点的IC50值，发现大黄酚对3种肿瘤细胞在干预72小时的IC50值分别为：29.47μM，32.66μM，36.29μM。比较木犀草素对3种细胞作用72h的IC50值，发现木犀草素对3种细胞的敏感程度为：MCF-7＞SGC-7901＞BEL-7404。由此可知，木犀草素对MCF-7细胞较敏感。
表8木犀草素对3种细胞增值的影响(存活率，
Figure RE-GDA0003718003120000142
n＝6)
Figure RE-GDA0003718003120000143
Figure RE-GDA0003718003120000151
注：与Control(空白对照)组比，**P<0.01，*P<0.05。
由上述实验数据显示，大黄酚和木犀草素对3种肿瘤细胞的体外增值均产生抑制作用，具有明显的抗肿瘤活性，细胞存活率随着药物浓度增加而减小，抑制作用与药物浓度呈依赖性。其中，对大黄酚对人肝癌细胞BEL-7404较敏感；木犀草素对人乳腺癌细胞MCF-7较敏感。2个单体化合物对3种细胞株的3个时间点的IC50值见表9。
表9 5个单体化合物对3种细胞株的3个时间点的IC50值(单位：μM)
Figure RE-GDA0003718003120000152
二、单体化合物对肿瘤细胞的促凋亡作用
(1)肿瘤细胞的培养
人乳腺癌MCF-7、人胃癌SGC-7901、人肝癌BEL-7404细胞株的培养条件分别是：MCF-7、BEL-7404细胞株：含DMEM+10％FBS+1％P/S；SGC-7901细胞株：RPMI-1640+10％ FBS+1％P/S，置于5％CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。详见上述肿瘤细胞的培养。
(2)药物母液配制
木犀草素(分子量：286.24)，母液：DMSO 57mg/mL(199.13mM)。
(3)肿瘤细胞铺板以及药物干预浓度
取正常培养并处于对数生长期的3种肿瘤细胞株，用0.8～1mL 0.25％胰蛋白酶消化， 800rpm离心3min收集细胞，于计数仪计数，每种细胞铺一个6孔板，每孔均加入3.0～4.0 ×105个细胞(根据不同细胞株可调整相应细胞铺板浓度)，分别放入培养箱中静置24h[12]。根据之前MTT的结果选择适合药物浓度进行细胞凋亡检测实验，药物分组的浓度如下：药物大黄酚干预3种细胞的的浓度是19.67μM；药物木犀草素干预3种细胞的浓度分别为20、40、61μM；药物相思子碱干预3种细胞的的浓度是：1mM；药物原儿茶酸干预3种细胞的浓度是：194.65μM。次日，将生长状态良好且融合度达到70％～80％的细胞，添加配制好的含有木樨草素药物的培养基2mL，放入培养箱中培养48h。
(4)流式细胞术检测细胞凋亡(Annexin V/PI双染检测细胞凋亡)
药物处理48h后观察细胞状态，开始流式分析处理，首先将6孔板中的细胞的上清液吸于5mL EP管中(因为在细胞上清中有部分已经漂浮凋亡的细胞)，使用在冰上提前预冷的PBS清洗细胞两遍后加入无EDTA的胰酶进行处理消化3-5min(不同的细胞消化时间不同，根据显微镜里观察的细胞状态进行终止消化)，终止消化后收集细胞至之前的5mL EP 管中，800rpm 3min离心后去除上清液并用预冷的PBS吹打清洗细胞并转移至1.5mL EP 管中，1000rpm 5min离心后去除上清液，之后再重复一次清洗细胞的步骤。
事先用无菌dd H2O将10×Binding buffer稀释成1×Binding buffer并放置室温，再取 100μL的1×Binding buffer重悬细胞，之后在避光情况下往每管细胞中分别加入5μL FITC-Annexin V和5μL PI，轻弹混匀后，室温避光静置15min，之后加入400μL的1×Binding buffer，吹打均匀后用400目的滤布过滤成团细胞(防止堵塞流式细胞分析仪)。将处理好的细胞放入冰盒中避光保存，在1h内上机分析完毕。用FlowJo软件分析数据并根据对照组细胞分析结果做图。
(5)实验结果
采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测其发生凋亡情况。
以细胞早期与晚期调亡之和统计细胞凋亡率，单体化合物木犀草素对MCF-7、SGC-7901、BEL-7404三种肿瘤细胞的促凋亡作用的详细结果见图17、图18和图19。木犀草素对人乳腺癌细胞MCF-7干预48h的凋亡率为15.71％，空白对照组凋亡率为2.49％。木犀草素对人胃癌细胞SGC-7901干预48h的凋亡率为17.00％，空白对照组凋亡率为1.07％。木犀草素对人肝癌细胞BEL-7404干预48h的凋亡率为30.54％，空白对照组凋亡率为2.1％。
由此可以明显看出，木犀草素对BEL-7404细胞的促凋亡效果较有优势，其凋亡率为30.54％。实验结果表明，木犀草素具有诱导3种肿瘤细胞发生凋亡的作用。
实施例9：DNA Topo I抑制实验
(1)药物母液的配制与药物的稀释
喜树碱(分子量：348.34)，母液：DMSO 3.4834mg/mL(10mM)。用有机溶剂DMSO 进行稀释，取10μL 10mM喜树碱母液加入15μL的DMSO中得到4mM喜树碱溶液，之后按照倍比稀释，得到喜树碱阳性对照药2.5、5、10、25、50、100、200μM等一系列浓度的溶液。
木犀草素(分子量：286.24)，母液：DMSO 57mg/mL(199.13mM)。用有机溶剂DMSO 进行稀释，取4.8μL 199.13mM木犀草素母液加入194.33μL的DMSO中得到4.8mM木犀草素溶液，之后按照倍比稀释，得到15、30、60、120、240μM等一系列浓度的溶液。
(2)电泳相关试剂的配制
反应体系(50×TAE溶液配方):Tris-Base 242g；Na2 EDTA·2H2O 37.2g；冰醋酸57.1 mL；dd H2O up to 1L(使用时用dd H2O稀释成1×)。
琼脂糖凝胶的制备：锥形瓶中加入适量(天平秤取实验需要的用量)和适宜浓度的缓冲液，将其加热煮沸边摇匀至完全融化，当液体无气泡即可。
胶板的制备：将所用的器具、模具清洗干净晾干待用，将梳子放入制胶槽，并使其固定在对应的卡槽中，将温度降到65℃的琼脂糖凝胶液倒入托盘，使凝胶液均匀平铺在表面，室温下静置至凝胶液冷却并凝固，轻柔的将梳子垂直并向上拔出，将凝胶及制胶槽缓慢放入电泳槽中，在电泳槽内添加电泳缓冲液，直至缓冲液没过胶板为止。
(3)酶反应Mixture配制
反应体系1：pBR322 DNA 0.5μg/1μL；10×DNA Topo I Buffer 2μL；0.1％BSA 2μL；药物/DMSO 1μL；DNA Topo I 1μL(U)；dd H2O up to 20μL。如果在10×DNA Topo IBuffer 中直接加入0.1％BSA，会产生大量的白色沉淀。因此，在反应液调制时需按以下顺序添加试剂：dd H2O→10×DNA Topo I Buffer→0.1％BSA→底物DNA→药物/DMSO→DNATopo I。
反应体系2：λ-Hind III digest 1μL；6×loading Buffer 1μL；TE Buffer up to6μL。λDNA digest DNA Markers的原始末端之间经常由COS末端结合在一起，在电泳前进行热处理 (60℃,5min)，能使Marker的电泳图像变得更为清晰，热处理前使用TE buffer稀释可以防止片段降解。因此，在反应液调制时需按以下顺序添加试剂：TE Buffer→λ-HindIII digest →热处理(60℃,5min)→6×loading Buffer。
(4)药物对DNA Topo I的抑制作用
根据上述反应体系加入木犀草素，最后加入1μL DNA Topo I，混匀后放置于37℃水浴反应30min，然后迅速加入含有SDS的10×loading buffer(2.22μL)混匀中止反应，以λ-Hind III digest为marker，1％琼脂糖凝胶(1×TAE buffer配置)，85V电泳90min，溴化乙啶(EB)染色30min，纯水脱色30min，凝胶成像仪成像分析。
质粒DNA与溴化乙啶在跑胶的过程当中会发生反应，使质粒DNA重新超螺旋，所以在琼脂糖凝胶配置的过程当中不能添加EB，只能通过后续浸泡凝胶的方式进行染色。
(5)实验结果
用阳性对照药物喜树碱验证DNA Topo I活性筛选体系的有效性，实验结果可见图20。图中第2泳道是DNA topo I对照(加了pBR322 DNA和DNA Topo I)，可以有效的使超螺旋DNA解螺旋，加入喜树碱后可以有效抑制DNA topo I的活性，导致超螺旋DNA增加。从图中可以明显看出，与Topo I对照组相比，喜树碱对DNA Topo I的解旋作用从200μM-25 μM的浓度(即第3、4、5、6泳道)均产生抑制作用，其抑制作用与浓度成正比，即抑制作用随着药物干预的浓度增大而增强。
木犀草素对DNA Topo I的抑制作用实验结果如图21，图中第3泳道是DNA Topo I对照(加了pBR322 DNA和DNA Topo I)，从图中可以明显看出，与Topo I对照组和第2泳道的喜树碱(200μM)相比，木犀草素对DNA Topo I的解旋作用从240μM-60μM的药物干预浓度(即第4、5、6泳道)均产生抑制作用，其抑制作用与浓度成正比，即抑制作用随着药物干预的浓度增大而增强；干预浓度为240μM(第4泳道)的木犀草素对DNA Topo I的抑制作用与第2泳道的干预浓度为200μM(第2泳道)的喜树碱对DNA Topo I的抑制作用相比，木犀草素呈现的抑制作用稍弱；但与阳性对照100μM(图20，第4泳道)的喜树碱对DNA Topo I的抑制作用较接近。说明木犀草素对DNA Topo I的活性具有一定的抑制作用，但其抑制作用比喜树碱稍弱。
对DNA Topo I的抑制作用的实验结果表明，木犀草素对DNA Topo I的活性具有一定的抑制作用，但其作用比喜树碱要弱。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.将鸡骨草全草干燥且粉碎后，用8～10倍量的95%乙醇浸泡后于70～80℃回流提取1h，重复2～3次，合并提取液后，经过滤、脱除乙醇后，即得提取浓缩液；
S2.将所述提取浓缩液加水稀释后，采用乙酸乙酯进行萃取，萃取比例为1～2∶2～4，萃取2～3次，分别合并萃取相和萃取液，萃取相和萃取液分别经减压浓缩制得乙酸乙酯部位浸膏和水部位浸膏；
S3.将所述乙酸乙酯部位浸膏用甲醇溶解后，采用硅胶柱层析法分离得到Fr.1-3组分、Fr.4-7组分和Fr.8-10组分，
S4.取所述Fr.1-3组分用乙酸乙酯溶解并过滤，经浓缩、冷冻结晶、干燥后，即得大黄酚；
S5.取所述Fr.4-7组分用C18柱制备分离，再经浓缩、干燥后，即得木犀草素；
S6.取所述Fr.8-10组分用C18柱制备分离，再经浓缩、干燥后，即得相思子碱；
S7.取所述水部位浸膏溶解后，用C18柱制备分离，再经浓缩、干燥后，即得原儿茶酸。
2.根据权利要求1所述一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸的方法，其特征在于：所述步骤S3中，硅胶柱层析法满足以下条件：
拌样硅胶：200～300目；
脱洗剂：二氯甲烷-甲醇；
梯度脱洗：40∶1→30∶1→20∶1→10∶1。
3.根据权利要求1所述一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸的方法，其特征在于：所述步骤S5中，C18柱制备分离满足以下条件：
流动相：乙腈-0.1%甲酸水，体积比为30∶70；
波长：350 nm。
4.根据权利要求1所述一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸的方法，其特征在于：所述步骤S6中，C18柱制备分离满足以下条件：
流动相：0.4%三乙胺-0.2%磷酸，体积比为18∶82；
波长：280 nm。
5.根据权利要求1所述一种从鸡骨草中分离并提取大黄酚、木犀草素、相思子碱及原儿茶酸的方法，其特征在于：所述步骤S7中，C18柱制备分离满足以下条件：
流动相：甲醇-0.1%磷酸，体积比为15∶85；
波长：260 nm。
6.如权利要求1～5任一项所述方法在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.如权利要求1～5任一项所述方法在制备DNA Topo I抑制剂药物中的应用。
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