CN114642698B - 龙葵总皂苷在制备抗耐药性白血病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了龙葵总皂苷在制备抗耐药性白血病药物中的应用，所述耐药性白血病为多药耐药性白血病，所述龙葵总皂苷的使用浓度大于10μg/mL。发明人利用白血病耐药细胞株裸鼠移植瘤模型，发现SN在体内具有较好的抗肿瘤活性，并通过体外测定SN对K562/ADR和K562细胞增殖的抑制作用，发现了其对细胞内周期、凋亡、自噬以及耐药等相关蛋白的表达情况，验证了其对自噬或相关通路对克服耐药以及细胞死亡产生的影响。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及龙葵总皂苷在制备抗耐药性白血病药物中的应用。
背景技术
肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)是导致肿瘤化疗失败以及肿瘤复发的主要原因之一，其表现为当恶性肿瘤细胞对于一种化疗药物具有耐药性的同时，也会对多种其他具有不同结构和作用机制的化疗药物均产生耐药性。因此，如何克服肿瘤的多药耐药性是癌症治疗中的当务之急。
细胞自噬(autophagy)又被称作II型细胞程序性死亡，是机体细胞在压力条件下的自我保护机制，在癌症的治疗过程中普遍出现的现象。根据肿瘤细胞成分、治疗方式和所处微环境的变化，自噬对于多药耐药型肿瘤来说是一把双刃剑，它既可以参与肿瘤多药耐药性的发生并保护肿瘤细胞免受化疗药物的影响，但也可以诱导细胞发生过度自噬最终造成肿瘤细胞发生自噬性死亡。因此，调节自噬以克服肿瘤的多药耐药性是治疗各类型恶性肿瘤的新策略。但相关技术中，对于利用细胞自噬实现克服肿瘤的多药耐药性的技术尚未有公开。
龙葵(Solanum nigrum L)作为一种传统中药，具有多种生物学效应，其提取物具有显著的抗肿瘤作用。然而龙葵碱本身具有较强的细胞毒性，对于使用剂量以及使用方法具有较高的要求，从而极大的限制了其抗肿瘤方面的应用。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出龙葵总皂苷在制备抗耐药性白血病药物中的应用。发明人发现从龙葵中提取富集得到的总甾体皂苷(SN)具有抑制耐药性白血病细胞增殖的作用，从而能够作为一种新型的抗耐药性白血病药物，有效解决白血病耐药问题。
本发明的第一个方面，提供龙葵总皂苷在制备耐药性白血病药物中的应用。
在本发明中，发明人通过各种试验证明SN以浓度和时间依赖性的方式降低了K562和K562/ADR细胞的活力，说明SN能够有效杀伤一般白血病细胞和耐药性白血病细胞，具有一定的抗白血病耐药效果。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述耐药性白血病包括阿霉素耐药等多药耐药性白血病。
在本发明的一些优选实施方式中，所述龙葵总皂苷的使用浓度大于10μg/mL。
在本发明中，10μg/mL的龙葵提取物对K562/ADR细胞已具有显著的细胞毒性。除此之外，目前有关龙葵提取物克服肿瘤耐药的研究，尤其是龙葵提取物直接克服肿瘤耐药的研究寥寥无几。因此，对龙葵中甾体皂苷类成分进行深入的研究以寻找新型具有克服耐药作用的抗白血病药物是十分有必要的。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述龙葵总皂苷的使用浓度大于20μg/mL。
在本发明中，发明人发现，20μg/mL的SN能够有效抑制K562/ADR中的BCRP、P-gp等耐药蛋白的表达，其抑制效果甚至强于阳性对照阿霉素，且通过该结果，可以表明SN是通过抑制BCRP、P-gp等耐药蛋白的表达来实现抑制K562/ADR细胞耐药性的效果。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述龙葵总皂苷的制备方法包括：
(1)使用60～70％乙醇加热回流2～4次提取龙葵青果，得到醇提液；
(2)除去醇提液中的乙醇，加水重悬后使用D101大孔树脂柱洗脱，收集洗脱液经浓缩干燥后即得。
在本发明的一些优选实施方式中，所述洗脱液为50％～70％乙醇的洗脱液。
在本发明的一些优选实施方式中，所述洗脱液为50％乙醇和70％乙醇的洗脱液。
在本发明的一些优选实施方式中，所述龙葵总皂苷的制备方法具体为：取干燥的龙葵青果，使用65％的乙醇加热至约70℃回流(3次)提取，得到龙葵醇提液。采用减压浓缩的方式除去龙葵醇提液中的乙醇，加水重悬，得到龙葵水悬液。使用D101大孔树脂柱依次用水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇以及95％乙醇对龙葵水悬液进行梯度洗脱，收集50％乙醇、70％乙醇的洗脱液，混合后即得龙葵总皂苷提取液。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述龙葵总皂苷通过激活细胞自噬克服白血病耐药性。
在本发明的一些优选实施方式中，所述SN通过(PI3K)/Akt/mTOR/p70S6K/4EBP1信号通路诱导细胞发生自噬并克服了K562/ADR细胞耐药。
在本发明的一些优选实施方式中，所述龙葵总皂苷激活的细胞自噬表现为：
促进LC3-I向LC3-II的转化；
增加Beclin-1的表达；以及
降低p62的表达。
本发明的第二个方面，提供龙葵总皂苷在制备细胞增殖抑制药物中的应用。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述细胞为K562/ADR细胞。
在本发明的一些优选实施方式中，所述龙葵总皂苷通过阻滞K562/ADR细胞周期进而抑制细胞增殖。
本发明的第三个方面，提供龙葵总皂苷在制备促进细胞凋亡药物中的应用。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述细胞为K562/ADR细胞。
在本发明的一些优选实施方式中，所述龙葵总皂苷通过增加PARP-1、cleaved-caspase 3的表达、降低pro-caspase 3、pro-caspase 8和pro-caspase 9的表达进而促使细胞凋亡。
本发明的第四个方面，提供龙葵总皂苷在制备促进细胞自噬药物中的应用。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述细胞为K562/ADR细胞。
在本发明的一些优选实施方式中，所述龙葵总皂苷通过抑制p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1的表达，促进LC3-I向LC3-II的转化进而促使细胞发生自噬。
本发明的有益效果是：
本发明利用含水乙醇对龙葵青果进行提取，提取的浸膏经大孔树脂梯度洗脱，得到的洗脱液减压浓缩后，从而得到龙葵甾体皂苷(SN)。发明人利用白血病耐药细胞株裸鼠移植瘤模型，发现SN在体内具有较好的抗肿瘤活性，并通过体外测定SN对K562/ADR和K562细胞增殖的抑制作用，发现了其对细胞内周期、凋亡、自噬以及耐药等相关蛋白的表达情况，验证了其对自噬或相关通路对克服耐药以及细胞死亡产生的影响。
附图说明
图1为龙葵总皂苷进行成分分析的高效液相色谱图。
图2为本发明实施例中的药物投放时间及SN对移植瘤生长的抑制作用示意图。
图3为SN对瘤体积和瘤重的影响。
图4为SN对K562/ADR和K562细胞的细胞毒性作用。
图5为BCRP和P-gp蛋白在K562/ADR和K562细胞中的表达水平。
图6为不同浓度SN对K562/ADR细胞中BCRP和P-gp蛋白表达的影响。
图7为SN对K562/ADR和K562的G0/G1期相关周期蛋白表达的影响。
图8为SN对K562/ADR和K562两种细胞中凋亡相关蛋白表达的影响。
图9为Z-VAD-FMK的预处理对K562/ADR细胞中凋亡相关蛋白表达的影响。
图10为Z-VAD-FMK的预处理对K562/ADR细胞中耐药相关蛋白表达的影响。
图11为SN对K562/ADR和K562两种细胞中自噬相关蛋白表达的影响。
图12为3MA和CQ的预处理对K562/ADR细胞中凋亡相关蛋白表达的影响。
图13为3MA和CQ的预处理对K562/ADR细胞中耐药相关蛋白表达的影响。
图14为Z-VAD-FMK的预处理对K562/ADR细胞中LC3-II表达的影响。
图15为SN对K562/ADR和K562两种细胞中p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K以及p-4EBP1蛋白表达的影响。
图16为SN对K562/ADR裸鼠移植瘤中BCRP、P-gp、p-mTOR和LC3-II蛋白表达的影响。
图17为MHY1485的预处理对p-mTOR、p-p70S6K以及p-4EBP1蛋白表达的影响。
图18为MHY1485的预处理对K562/ADR细胞中凋亡相关蛋白表达的影响。
图19为MHY1485的预处理对K562/ADR细胞中LC3-II和p62蛋白表达的影响。
图20为MHY1485的预处理对K562/ADR细胞中耐药相关蛋白表达的影响。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
龙葵总皂苷的提取、富集以及含量测定
取干燥的龙葵青果，使用65％的乙醇加热至70℃回流提取，得到龙葵醇提液。采用减压浓缩的方式除去龙葵醇提液中的乙醇，加水重悬，得到龙葵水悬液。龙葵水悬液通过D101大孔树脂柱，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇以及95％乙醇进行梯度洗脱，收集50％乙醇、70％乙醇的洗脱液，混合后即得龙葵总皂苷提取液。通过紫外分光光度计法在430nm波长下测定提取液中的龙葵总皂苷(SN)含量。以实验室前期分离出的皂苷单体为对照品，采用高效液相色谱法对龙葵总皂苷进行成分分析，其色谱条件为：检测器:ELSD(漂移管温度：95℃，载气：压缩空气，压力：0.1MPa)，色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ(4.6ID×250mm，5μm)，柱温：室温，流动相：乙腈(A)和0.8％三氟乙酸-水(B)，洗脱梯度条件：0～15min：22％～24％(A)，15～30min：24％～27％(A)，30～40min：27％～29％(A)，40～45min：29％～38％(A)，45～60min：38％～38％(A)，60～70min：38％～100％(A)，流速：1.0mL/min。
结果如图1所示。
我们共鉴定出4个主要甾体皂苷单体色谱峰，化学名称如表1所示。
表1
龙葵总皂苷的抗肿瘤作用
在本实施例中，实验鼠采用3-4周的雌性裸鼠，购自广东省医学动物实验中心。
(1)实验动物模型造模：
取3-4周的雌性裸鼠，采用左上肢皮下注射的方式接种等量人白血病阿霉素耐药株K562/ADR，待细胞成瘤且长至约100mm3时完成造模。
(2)龙葵总皂苷的抗肿瘤效果研究：
将上述造模后的实验鼠随机均分为五组，分别采用下述方法进行处理：
模型组：腹腔注射等量生理盐水；
阳性药物组：腹腔注射2mg/kg的阿霉素；
龙葵总皂苷低剂量组：采用灌胃给药的方式灌胃62.5mg/kg的上述实施例中提取得到的龙葵总皂苷。
龙葵总皂苷中剂量组：采用灌胃给药的方式灌胃125mg/kg的上述实施例中提取得到的龙葵总皂苷。
龙葵总皂苷高剂量组：采用灌胃给药的方式灌胃250mg/kg的上述实施例中提取得到的龙葵总皂苷。
其中，阳性药物组每隔3天给药一次，共给药6次。
龙葵总皂苷实验组(低剂量组、中剂量组和高剂量组)每隔2天给药一次，共给药7次。
实验共持续24天，实验流程图以及肿瘤体积变化如图2所示。
每隔一天称重、测量瘤体积(计算公式为：)。密切关注裸鼠生命体征，实验周期结束后脱臼处死实验鼠。解剖取出肿瘤，称量瘤重。
结果如图3所示。
从结果可以看出，相比模型组，经SN给药治疗后的小鼠肿瘤明显体积更小，尤其是SN高剂量组，即便相比阳性药物组，其对肿瘤的抑制效果也是最为明显，说明SN在体内能显著抑制K562/ADR移植瘤的生长。而从获得的肿瘤重量数据来看，可以发现SN给药治疗相比于阳性药物治疗，其肿瘤质量显著下降，尤其是对于高剂量组而言，其相比阳性药物组具有显著差异性(**p<0.01)。
龙葵总皂苷的细胞毒性
使用CCK-8法检测SN对细胞增殖及细胞活力的影响，具体实验步骤如下：
取K562和K562/ADR细胞，分别以以5×103cells/孔的密度接种于96孔板中，置于培养箱中培养过夜。隔天分别向各孔中加入不同浓度(0、5、10、20和40μg/mL)的上述实施例中提取得到的龙葵总皂苷，使其分别与细胞共孵育24、48和72h后，每孔加入10μL CCK-8溶液再培养4h。然后使用酶标仪在450nm处检测吸光度(OD值)。
结果如图4所示。
可以发现，SN以浓度和时间依赖性的方式降低了K562和K562/ADR细胞的活力，说明SN能够有效杀伤一般白血病细胞和耐药性白血病细胞，具有一定的抗白血病耐药效果。
SN抗肿瘤耐药的作用机制研究
取对数生长期的K562和K562/ADR细胞分别接种(接种浓度为4×105cells/孔)于6孔板中，置于培养箱中培养过夜。隔天收集孔中细胞用于后续实验。
使用Western blotting法分别检测细胞中的BCRP和P-gp蛋白的表达情况。其中，所用一抗P-gp和BCRP均购于武汉三鹰(武汉，中国)，使用前将抗体以1：2000的比例进行稀释。二抗为兔抗，购于Cell Signaling Technology(Danvers,USA)，使用前将抗体以1：2000的比例进行稀释。
结果如图5所示。
可以发现，K562/ADR细胞中BCRP、P-gp等耐药蛋白的表达显著高于K562细胞(**p<0.01)，说明SN能够有效抑制K562/ADR细胞可能是由于其抑制了相关的耐药蛋白的表达。
为了进一步验证该假设，发明人取对数生长期的K562/ADR细胞分别接种(接种浓度为4×105cells/孔)于6孔板中，置于培养箱中培养过夜。隔天分别向各孔中加入2mL不同浓度(5、10和20μg/mL)的上述实施例中提取得到的龙葵总皂苷，同时设置阳性对照阿霉素(ADR，50μM)，使其与细胞共孵育24h后，使用western blot法检测细胞中的BCRP、P-gp蛋白的表达情况。其中一抗P-gp和BCRP均购于武汉三鹰(武汉，中国)，使用前将抗体以1：2000的比例进行稀释。二抗为兔抗，购于Cell Signaling Technology(Danvers,USA)，使用前将抗体以1：2000的比例进行稀释。设置空白对照(不加SN和ADR)。
结果如图6所示。
可以发现，SN能够有效抑制K562/ADR中的BCRP、P-gp等耐药蛋白的表达，尤其是在20μg/mL浓度下，其抑制效果甚至强于阳性对照阿霉素(**P<0.01)，且通过该结果，可以表明SN是通过抑制BCRP、P-gp等耐药蛋白的表达来实现抑制K562/ADR细胞耐药性的效果。
为了进一步探究SN抗肿瘤耐药的作用机制，发明人取对数生长期的K562/ADR细胞分别接种(接种浓度为4×105cells/孔)于6孔板中，置于培养箱中培养过夜。隔天分别向各孔中加入2mL一定浓度(作用于K562/ADR细胞的浓度为10μg/mL，作用于K562细胞的浓度为8μg/mL)的上述实施例中提取得到的龙葵总皂苷，使其与细胞共孵育0、12、18和24h后，用western blot法检测G0/G1期相关周期蛋白(cyclin E2和p21)表达情况。其中一抗均来自于细胞周期调控抗体采样试剂盒II，二抗为兔抗，均购于Cell Signaling Technology(Danvers,USA)，使用前将抗体以1：1000的比例进行稀释。
结果如图7所示。
可以发现，相比SN处理前的细胞，使用SN处理12、18和24h后，G0/G1期细胞(p21表达量/cyclin E2表达量)比例均明显升高，说明SN显著增加了K562/ADR细胞和K562细胞中p21蛋白的表达，而cyclin E2蛋白在SN作用下被显著降低，说明SN通过阻滞K562/ADR和K562细胞周期进而抑制细胞增殖(*p<0.05，**p<0.01)。
为了进一步探究SN抗肿瘤耐药的作用机制，发明人取对数生长期的K562和K562/ADR细胞(接种浓度为4×105cells/孔)于6孔板中，置于培养箱中培养过夜。隔天分别向各孔中加入2mL不同浓度(5、10和20μg/mL)的上述实施例中提取得到的龙葵总皂苷，同时设置阳性对照阿霉素(ADR，50μM)，使其与细胞共孵育24h后，用western blot法检测凋亡相关蛋白(PARP-1、pro-caspase 3、cleaved-caspase 3、pro-caspase 8和pro-caspase 9)表达情况(GAPDH作为内参)。其中一抗PARP-1和GAPDH购于武汉三鹰(武汉，中国)，一抗pro-caspase 3、cleaved-caspase 3、pro-caspase 8和pro-caspase 9以及二抗兔抗和鼠抗，购于Cell Signaling Technology(Danvers,USA)，使用前除抗体GAPDH以1：2000的比例稀释，其余抗体均以1：1000的比例进行稀释。
结果如图8所示。
可以发现，SN显著增加了K562/ADR和K562细胞的凋亡率，且能够发现SN显著增加了PARP-1、cleaved-caspase 3蛋白的表达，降低了pro-caspase 3、pro-caspase 8和pro-caspase9蛋白的表达(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。而相比而言，50μM的阿霉素则并不能诱导K562/ADR细胞发生凋亡。以上结果提示了SN诱导了白血病细胞发生凋亡。
同时，为了证明上述结论，发明人先使用pan-caspase抑制剂Z-VAD-FMK(5μM)对K562/ADR进行预处理4h后，再按照上述试验方法加入SN(16μg/mL)共孵育24h，用westernblot法检测凋亡相关蛋白表达情况。其中一抗PARP-1和GAPDH购于武汉三鹰(武汉，中国)，一抗pro-caspase 3、cleaved-caspase 3、pro-caspase 8和pro-caspase 9以及二抗兔抗和鼠抗，购于Cell Signaling Technology(Danvers,USA)，使用前除抗体GAPDH以1：2000的比例稀释，其余抗体均以1：1000的比例进行稀释。pan-caspase抑制剂Z-VAD-FMK购于Selleck Chemicals(Houston,TX,USA)
结果如图9所示。
可以发现，相比于SN处理组，加入Z-VAD-FMK(5μM)后可显著恢复K562/ADR细胞中pro-caspase 3蛋白的表达，降低cleaved-PARP-1、cleaved-caspase 3蛋白的表达(ns无显著性，#P<0.01，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)，说明SN对于K562/ADR细胞的凋亡作用确实是通过诱导K562/ADR细胞发生caspase依赖性凋亡所产生的。
而用western blot法检测Z-VAD-FMK预处理组中的K562/ADR细胞的BCRP和P-gp蛋白表达情况。其中一抗P-gp和BCRP均购于武汉三鹰(武汉，中国)，使用前将抗体以1：2000的比例进行稀释。二抗为兔抗，购于Cell Signaling Technology(Danvers,USA)，使用前将抗体以1：2000的比例进行稀释。pan-caspase抑制剂Z-VAD-FMK购于Selleck Chemicals(Houston,TX,USA)。
结果发现Z-VAD-FMK预处理对于K562/ADR细胞的BCRP和P-gp蛋白表达并未带来任何影响(图10，ns无显著性，#P<0.01，*P<0.05，**P<0.01)，表明caspase依赖性凋亡可能不是SN克服K562/ADR细胞多药耐药性的主要原因。
基于上述结果，发明人用western blot法检测自噬相关蛋白(LC3、p62/SQSTM1)和Beclin-1)表达情况(按照上述试验方法)。其中一抗LC3、p62和Beclin-1均购于武汉三鹰(武汉，中国)，二抗为兔抗，购于Cell Signaling Technology(Danvers,USA)，使用前将抗体以1：2000的比例进行稀释。
结果发现SN显著增加了LC3-I向LC3-II的转化，以及Beclin-1蛋白的表达，同时降低了p62蛋白的表达(图11，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.001)。该结果表明SN诱导了K562/ADR和K562细胞发生自噬。
为了证明上述结论，发明人先使用分别使用自噬抑制剂3MA(2mM)或CQ(8μM)对K562/ADR细胞进行预处理4h后，再按照上述试验方法加入SN(16μg/mL)共孵育24h，用western blot法检测自噬相关蛋白表达情况。其中一抗P-gp和BCRP均购于武汉三鹰(武汉，中国)，使用前将抗体以1：2000的比例进行稀释。二抗为兔抗，购于Cell SignalingTechnology(Danvers,USA)，使用前将抗体以1：2000的比例进行稀释。3MA购于SigmaChemical(St.Louis,MO,USA)，CQ购于阿拉丁(上海，中国)。
结果发现3MA和CQ预处理后可显著恢复pro-caspase 3蛋白的表达，同时降低PARP-1、cleaved-caspase 3蛋白的表达，而且耐药相关蛋白(BCRP、P-gp)的表达也被恢复(图12～13，ns无显著性，#p<0.01，##p<0.01，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.01)。结合Z-VAD-FMK的预处理对K562/ADR细胞中LC3-I向LC3-II的转化没有影响(图14，ns无显著性，**P<0.01)，可以表明SN诱导的自噬是克服耐药进而促进K562/ADR细胞死亡的关键因素。
为了验证上述结论，发明人按照上述方法，用western blot法检测K562/ADR和K562细胞的PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白(p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K、4EBP1以及p-4EBP1)的表达情况。其中一抗p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K、4EBP1和p-4EBP1以及二抗为兔抗均购于Cell Signaling Technology(Danvers,USA)，使用前除4EBP1、p-4EBP1以及兔抗以1：2000的比例进行稀释，其余抗体皆以1：1000的比例进行稀释。
结果发现SN显著抑制了K562/ADR和K562细胞中p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K以及p-4EBP1蛋白的表达(图15，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。且与模型组和阿霉素组相比，SN显著抑制了K562/ADR裸鼠移植瘤中p-mTOR蛋白的表达，增加了LC3-I向LC3-II的转化，这与上述结果一致(图16，**p<0.01，***p<0.001)。因此，可以说明SN能够抑制白血病细胞的PI3K/Akt/mTOR信号通路。
发明人先使用mTOR激动剂MHY1485(10μM)对K562/ADR细胞进行预处理4h后，再按照上述试验方法加入SN(16μg/mL)共孵育24h，用western blot法检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白、凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白以及耐药相关蛋白表达情况。其中一抗P-gp和BCRP均购于武汉三鹰(武汉，中国)，使用前将抗体以1：2000的比例进行稀释。二抗为兔抗，购于Cell Signaling Technology(Danvers,USA)，使用前将抗体以1：2000的比例进行稀释。mTOR激动剂MHY1485购于MedChemExpress(上海，中国)。
结果发现，在MHY1485干预后，p-mTOR、p-p70S6K以及p-4EBP1蛋白的表达显著增加(图17，ns无显著性，#p<0.01，##p<0.01，*p<0.05，**p<0.01)。除此之外，MHY1485也显著恢复(提高)了pro-caspase 3蛋白的表达，降低PARP-1、cleaved-caspase 3蛋白的表达(图18，ns无显著性，#p<0.01，*p<0.05，**p<0.01)。更重要的是，通过MHY1485干预激活p-mTOR蛋白的表达明显抑制了LC3-I向LC3-II的转化，p62蛋白的降解也被抑制(图19，ns无显著性，#p<0.01，####p<0.00001，**p<0.01，****p<0.0001)。此外，在激活PI3K/Akt/mTOR信号通路后，SN对BCRP和P-gp蛋白表达的下调作用被显著抑制(图20，ns无显著性，#p<0.01，##p<0.001，*p<0.05，**p<0.01)。
综上所述，SN通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节K562/ADR细胞自噬进而克服肿瘤细胞耐药，最终诱导细胞发生自噬性细胞死亡。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.龙葵总皂苷在制备非治疗目的的体外PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂中的应用；
所述体外PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂表现为抑制p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1的表达，促进LC3-I向LC3-II的转化；
所述龙葵总皂苷的使用浓度大于20 μg/mL；
所述龙葵总皂苷由包括以下制备方法制备得到：
（1）使用60~70%乙醇加热回流2~4次提取龙葵青果，得到醇提液；
（2）除去醇提液中的乙醇，加水重悬后使用D101大孔树脂柱洗脱，收集洗脱液浓缩干燥后即得龙葵总皂苷；
所述洗脱液为50%~70%乙醇的洗脱液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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2022
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Sankar Jagadeeshan等.Solanum nigrum Unripe fruit fraction attenuates Adriamycin resistance by down-regulating multi-drug resistance protein (Mdr)-1 through Jak-STAT pathway.《BMC Complementary and Alternative Medicine》.2017,(第17期),第1-9页，尤其是第3页左栏第1段，第4页左栏第2段和右栏第1段以及第8页右栏第2段. * |
| Yi Wang等.S-20, a steroidal saponin from the berries of black nightshade, exerts anti-multidrug resistance activity in K562/ADR cells through autophagic cell death and ERK activation.《Food Funct.》.2022,(第13期),第2200-2215页，尤其是第2201页左栏第2段和第2203页左栏最后一段. * |
| 朱聪等.龙葵碱对白血病K562/ADR细胞多药耐药性的逆转作用及其分子机制.《肿瘤》.2017,第37卷第1276-1281页. * |
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