CN101199563B - 珍珠菜总皂苷在制备治疗肝癌药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种珍珠菜总皂苷的用途，其特征是珍珠菜总皂苷可用于制备***药物的用途，特别是其具有优良的抗肝癌作用。

Description

珍珠菜总皂苷在制备治疗肝癌药物的用途

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种珍珠菜总皂苷的抗肿瘤用途。

背景技术

恶性肿瘤是造成人类死亡的仅次于心血管疾病的第二号杀手，随着工业化进展和老龄人口比例的增加，肿瘤发病率近20年来呈显著的上升趋势。药物治疗在临床上是最重要的治疗癌症的方法，但目前抗肿瘤药物均有严重的不良反应，因此，从中药中寻找作用显著、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是国际医药界的重点、热点课题。

珍珠菜，英文名：Lysimachia clethroide Duby，系报春花科植物虎尾珍珠菜的根或全草，味苦、辛，性平，具有清热利湿，活血散瘀，解毒消痈之功效。国外学者从70年代开始，相继从中分离得到槲皮素苷，山奈素，黄芪素等黄酮类化合物，国内学者近年来对其化学成分也有所研究，多数着重于其黄酮类的研究，并且已有文献报道其黄酮类具有一定的抗肿瘤作用，因此研究者在研究中大多是提取其黄酮类，并以此作用质量控制指标。

发明内容

本发明公开了珍珠菜总皂苷的抗肿瘤用途，特别是其具有优良的抗肝癌作用。

珍珠菜总皂苷可以用文献方法制备，也可以用下列方法制备得到：

将珍珠菜粉碎，用溶剂回流提取，过滤，滤液经回收溶媒得浸膏，浸膏加水溶解，滤过，滤液浓缩，调节pH值至4～6，然后通过大孔树脂吸附，乙醇洗脱，蒸发除去溶剂并干燥，得珍珠菜粗提物，粗提物加水溶解，滤过，滤液用氯仿、醋酸乙酯或正丁醇萃取，减压回收溶媒，萃取物减压干燥即得。其中所述溶剂选自水、乙醇、丙酮、醋酸乙酯或C_1-4的脂肪族醇；所述大孔树脂选自AB-8、D4020、NKA-9、ZTC大孔吸附树脂或聚酰胺树脂。溶剂优选乙醇。乙醇浓度优选30％～80％，为重量百分比。

洗脱用的乙醇浓度优选20～95％，为重量百分比。

下面是本发明的部分药理药效学试验及结果，本发明药理部分所用的药物即珍珠菜总皂苷，由实施例1方法制备。

一、药物的体外抗肿瘤活性

1采用MTT法测定肿瘤细胞对药物的敏感性

采用常规MTT法测定肿瘤细胞株对药物的敏感性。取对数生长期肿瘤细胞人乳腺癌细胞(MCF-7)、人***细胞(Hela)、人结肠癌细胞(Caco-2)、人肝癌细胞(SMMC-7721)，用完全培养基调整细胞浓度为7×10⁴/ml，接种于96孔培养板中，100μl/孔，37℃、5％CO₂条件下培养过夜，次日进行分组：治疗组加入珍珠菜总皂苷提取物(终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)，阳性对照组加入5-FU(25μg/ml)，100μl/孔，阴性对照组加入等体积完全培养基，每组均设6复孔，培养48h。终止培养前4h加入MTT(5mg/ml)，10μl/孔，培养结束后每孔加入酸化的10％SDS 100μl，放置过夜，于酶标仪检测波长为570nm时的吸光度A值。

肿瘤细胞生长抑制率(Inhibition Rate)按以下公式计算：

Inhibition Rate(％)＝[(A_对照组-A_实验组)/A_对照组]×100％

试验结果：MCF-7、SMMC-7721、Hela、Caco-2细胞的抑制率分别为81.98％、91.92％、73.94％及34.16％，与阴性对照组相比具有极显著性差异(P＜0.01)。可见珍珠菜总皂苷对肝癌的抑制效果明显好于其它癌症。

2药物对SMMC-7721细胞增殖抑制作用

2.1MTT法：取对数生长期SMMC-7721细胞、Hela细胞，调整细胞浓度后接种于96孔培养板中，37℃，5％CO₂条件下培养，次日分组：给药组加入不同浓度珍珠菜总皂苷提取物(终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)，阴性对照组加入等体积生理盐水，每组均设6复孔，分别培养24、48、72h。MTT法同上，每组均设6复孔。

试验结果：药物对人肝癌SMMC-7721、人***Hela细胞株有很强的抑制作用，且作用有明显的时间、浓度依赖性，且药物对SMMC-7721细胞的增殖抑制效果明显好于Hela细胞。

与对照组相比，不同浓度的药物对SMMC-7721细胞增殖均有明显的抑制作用，且呈时间、浓度依赖性。24h、48h、72h的IC₅₀分别为46.19μg/ml、24.0μg/ml、14.6μg/ml，见表1。与对照组相比，不同浓度的ZE4对Hela细胞增殖也有明显的抑制作用，且呈时间、浓度依赖性。24h、48h、72h的IC₅₀分别为95.64μg/ml、47.53μg/ml、42.38μg/ml，见表2。

表1药物对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用

^*p＜0.05，^**p＜0.01

表2药物对Hela细胞的增殖抑制作用

^*p＜0.05，^**p＜0.01 vs control

2.2³H-TdR法

接种细胞至24孔培养板中，培养24小时后给予不同浓度的珍珠菜总皂苷提取物(终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)，阳性对照组加入DXR(10μg/ml)，1ml/孔，阴性对照组加入等体积完全培养基，同时加入稀释的³H-TdR(2.4×10⁴Bq)10μl，继续培养48h。收获细胞：在培养孔中加入蒸馏水，吹打均匀，将细胞转移至49型玻璃纤维滤膜上，依次用生理盐水、5％三氯醋酸、无水乙醇洗涤。取下49型玻璃纤维滤膜，置红外干燥箱干燥，80℃，20-30分种。将滤膜片置入闪烁瓶底部，加入闪烁液3ml，在液体闪烁测量仪上测量每个样品的cmp值。

结果表明，药物作用48h可有效抑制细胞增殖，其中25、50、100μg/ml剂量组的抑制率分别为43.5％、74.2％、83.9％，且与阴性对照组相比具有极显著性差异(P＜0.01)见表3。

表3给药48h后药物对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用

^*P＜0.05   ^**P＜0.01

2.3集落形成试验

取对数生长期细胞，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为2.5×10²/ml于35mm培养皿，2ml/孔，每组均设3复孔，37℃、5％CO₂条件下培养过夜，次日进行分组：给药组加入珍珠菜总皂苷提取物(终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)，阳性组加入5-FU(25μg/ml)，2ml/孔，阴性对照组加入等体积培养基，在含37℃、5％CO₂条件下静置10天，弃去培养基，用Gimesa染色后镜下计数含50个细胞以上的集落，并摄影。

试验结果：药物12.5、25、50、100μg/ml及5-FU(25μg/ml)剂量组均无集落形成；阴性对照组、3.125μg/ml剂量组、6.25μg/ml剂量组的集落形成率分别为54.9％、36.0％和10.2％，3.125μg/ml、6.25μg/ml药物组对SMMC-7721细胞集落形成的抑制率分别为28.5％和79.8％，普通光镜放大20倍拍照，见图1。

3药物对抗肝癌肿瘤细胞转移作用

3.1划痕实验

细胞接种于六孔板，培养过夜使其完全贴壁，用枪尖在孔中央部划一条直线，PBS洗一遍，加入受试药物2ml，阴性对照组加入等体积完全培养基，分别培养24、48、72h，Gimesa染色，显微镜下观察并拍照。

试验结论：各时间点药物100μg/ml处理组细胞迁移距离均小于阴性对照组。

3.2人肝癌细胞与内皮细胞粘附试验

取对数生长期的内皮细胞(ECV 304)，用无血清培养液洗三次，收集并重新悬浮在含0.1％BSA的无血清培养液中，加入受试药物，使其终浓度分别为12.5、25、50、100、200、400μg/ml，阴性对照为不含药物的无血清培养基，细胞浓度均为5×10⁵/ml。室温下孵育60min后，将细胞加入96孔板，各组设6个平行孔，37℃培养90min。用Dulbecco’s PBS清洗细胞4次，除去未粘附的细胞，粘附细胞用20％甲醇稀释的0.5％结晶紫染色固定，漂洗，空气晾干。用比例1∶1的乙醇和0.1mmol/L枸橼酸钠溶液溶解染色细胞，酶标仪在540nm处测OD值。

试验结论：各给药剂量组均可抑制人肝癌细胞SMMC-7721与人内皮细胞ECV304之间的粘附，且随给药剂量的增加抑制作用增强。100μg/ml的药物组对两种细胞粘附的抑制率均为46.3％。

二、考察珍珠菜总皂苷的体内抗肿瘤活性

1药物对小鼠H22肝癌的增殖抑制作用

小鼠分别设阴性对照组、药物高(400mg/kg)、中(200mg/kg)、低(100mg/kg)剂量组、CTX(25mg/kg)组。抽取小鼠腹水，用无菌生理盐水1∶4稀释后接种于小鼠右侧腋下，每只接种0.1ml。接种后随机分组，第2天起灌胃给药，每天一次，共10天。各组给药容积均为每10g体重0.2ml，阴性对照组与予相同体积的0.5％CMC-Na。末次给药24h后处死小鼠，称取瘤重。按下式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝[(阴性对照组平均瘤重一给药组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重]×100％。

实验结果显示药物可显著抑制小鼠H22肝癌的增殖，抑制率均在30％以上，且与对照组相比差异显著或非常显著(P＜0.05，P＜0.01)，其中中剂量(200mg/kg)组的抑瘤效果最好，可达到57.8％，见表4。

表4药物对小鼠H22肝癌的增殖抑制作用

^*P＜0.05，^**P＜0.01

2药物对小鼠肝癌转移作用的研究

2.1对小鼠肺重的影响

分别取接种10天腹水型肝癌小鼠，颈椎脱臼处死，腹部皮肤消毒后剪开并剥去腹部皮肤，用空针穿过腹部肌肉，抽吸腹水，腹水应为乳白色浓稠液体，若为黄色或有大量红细胞之血性腹水则弃之不用，所抽之腹水放入无菌容器内，并置冰块上。取昆明种小鼠(每批实验均为同一性别)，尾静脉注射接种肿瘤细胞悬液(2×10⁶个/ml)0.2ml/只，注射尾部用手术灯光照射使静脉血管扩张。

实验设对照组、高剂量组(400mg/kg)、中剂量组(200mg/kg)、低剂量组(100mg/kg)、CTX组(25mg/kg)。小鼠接种后随机分组，第2天起灌胃给药，各组给药体积均为每10g体重0.2ml，对照组给予相同体积的0.5％CMC-Na。末次给药60min后，颈椎脱臼处死小鼠，称小鼠肺重。

小鼠肝癌肺转移结果表明药物高(400mg/kg)、中(200mg/kg)、低(100mg/kg)三个剂量组均对小鼠肺重的增加均有抑制作用，其中200mg/kg对肺重增加的抑制率为33.1％，但组内变异系数较CTX组比偏大，见表5。

表5药物对小鼠肺重的影响

^*P＜0.05，^**P＜0.01

2.2对肝癌转移小鼠肺转移结节数的影响

小鼠肺于Bouin氏液(1份冰醋酸+15份饱和苦味酸液+5份10％甲醛混合放置24小时即可)固定48小时，置于解剖显微镜下计数肺表面转移灶数、拍照。肺组织经石蜡包埋、50μm连续切片后HE染色观察。

I级：直径＜0.5mm

II级：0.5mm＜直径＜1.0mm

III级：1.0mm＜直径＜2.0mm

IV级：直径＞2.0mm

总转移灶数＝I级(结节数)×1+II级×2+III级×3+IV级×4

肺转移灶计数结果表明，CTX组肺转移灶平均数与阴性对照组相比有极显著性差异(P＜0.01)，药物各剂量组的转移灶数和阴性对照组相比均有所下降，其中200mg/kg组的抑制率为48.1％，见表6。

表6对肝癌转移小鼠肺转移结节数的影响

^*P＜0.05，^**P＜0.01

以上药理结果显示，珍珠菜总皂苷具有优良的抗肝癌活性。

附图说明

图1是药物对SMMC-7721细胞集落形成的抑制作用。(A)：对照组；(B)给药组6.25μg/ml；(C)给药组3.125μg/ml(20×)。

具体实施方式

实施例1

取珍珠菜600g，粉碎，分别用12、10、8倍量的80％乙醇回流提取三次，每次1.5小时，合并滤液，减压回收乙醇得浸膏，浸膏加水溶解、过滤，滤液浓缩至0.9ml/g生药。浓缩液用稀盐酸调节pH值至5.0，然后以1.0ml/min的流速通过AB-8大孔吸附树脂吸附，水洗至洗脱液接近无色，再以40％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸发除去乙醇后，加正丁醇萃取3次，每次100ml，合并萃取液，加正丁醇饱和的水洗涤3次，每次10ml，减压回收正丁醇至无味，萃取物80℃真空干燥2小时，得2.1g珍珠菜提取物，总皂苷含量约为55％。

Claims (5)

1.珍珠菜总皂苷用于制备治疗肝癌药物的用途。

2.权利要求1的用途，其中珍珠菜总皂苷用下列方法制备：将珍珠菜粉碎，用溶剂回流提取，过滤，滤液经回收溶媒得浸膏，浸膏加水溶解，滤过，滤液浓缩至0.5～2.0ml/g生药，调节pH值至4～6，然后通过大孔树脂吸附，乙醇洗脱，蒸发除去溶剂并干燥，得珍珠菜粗提物，粗提物加水溶解，滤过，滤液用氯仿、醋酸乙酯或正丁醇萃取，减压回收溶媒，萃取物减压干燥即得，其中所述溶剂选自水、乙醇、丙酮、醋酸乙酯或C_1-4的直链或支链的脂肪族醇；所述大孔树脂选自AB-8、D4020、NKA-9、ZTC大孔吸附树脂或聚酰胺树脂。

3.权利要求2的用途，其中所述溶剂是乙醇。

4.权利要求3的用途，其中乙醇浓度是30％～80％，为重量百分比。

5.权利要求2的用途，其中洗脱用的乙醇浓度为20～95％，为重量百分比。

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