CN111024875B - 一种鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法 - Google Patents

一种鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物质量控制技术领域，具体涉及一种鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法。本发明通过高效液相色谱仪得到了鸡骨草酰胺类成分的指纹图谱。该方法具有鉴别稳定、精密度和重现性好、分离度高、易于操作等特点，得到的鸡骨草酰胺类成分指纹图谱，各峰分布均匀，共有峰特征优势更为明显，可从色谱的整体面貌特征上监测鸡骨草酰胺类成分的质量情况，既可应用于鸡骨草酰胺类成分的鉴别、质量分析和评价，也可用于鸡骨草药材及含酰胺类提取物的相关制剂、产品的鉴别、质量评价和控制。

Description

一种鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法
技术领域
本发明属于药物质量控制技术领域，具体涉及一种鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法。
背景技术
随着实现中药现代化研究应当建立完备的中药质量控制方法逐渐成为人们的共识，多个国家均已接受色谱指纹图谱的质控方法。中药指纹图谱借助于现代仪器分析手段将中药化学成分组合物中的某类化学物质或各个化学物质的化学信息从定性和定量两个角度以图形(图像)的方式来表征并加以描述的图谱，能较全面地反映药材所含化学成分的相对关系，体现中药成分的复杂性和相关性，对中药材及中药产品进行质量控制。鸡骨草是一种常用的中药，为我国特有南药品种，基源为豆科植物相思子属广州相思子(Aburscantoniensis Hance)和毛相思子(Abrus mollis Hance)。鸡骨草化学成分复杂，均富含黄酮、生物碱和皂苷等化学成分，具有保肝护肝、降脂、抗菌和抗病毒、抗氧化、增强免疫、清除自由基、调节平滑肌功能和提高耐力等作用，并在临床应用中有很好的疗效。前期研究发现鸡骨草中富含酰胺类成分，如鸡骨草甲素(Abrusamide A)、鸡骨草乙素(Abrusamide B)和鸡骨草丙素以及N-反式对香豆酰酪氨酸等，该酰胺类成分具有良好的抗氧化、抗炎、保肝等活性，获得了专利保护(ZL201210421480.X)，建立了该部位的提取制备方法(发明专利申请201610839080.9)，但其质量评价方法一直未得到良好的分离条件，特别是该类成分均为同分异构体，且是构象异构，在分离分析方面一直是难点。
而且，《中国药典》2015版项下关于鸡骨草的质量控制是以性状鉴别和对照药材的薄层色谱为指标进行的，质量评价和品质鉴别的方法较为单调，仅靠性状鉴别和薄层色谱分析难以更好地评价鸡骨草，特别是对除相思子碱成分的其他类成分以及有效部位，未建立有效部位成分的鉴别和测定方法，难以为鸡骨草药材及其制剂等的质量控制和评价提供技术支持和依据。
因此，针对酰胺类成分，为更好的开展其质量评价和应用等问题，本发明建立了一种用于鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法，该方法具有分离度高、精密度高、可操作性强、稳定性和重现性良好等特点，克服了普通分析条件下分离度不好的缺陷，建立的指纹图谱方法可用于鸡骨草药材和酰胺类提取物及其相关制剂产品的鉴别、质量评价和控制。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法，并利用此方法获得鸡骨草药材酰胺类成分的液相色谱指纹图谱。通过建立该类酰胺类成分的质量评价和控制技术，为鸡骨草、毛鸡骨草药材及其提取物及其相关制剂的鉴别、质量等提供分离度高、可行、稳定、可靠的先进的检测和评价方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.供试品溶液的制备：称取鸡骨草，粉碎，精密称定，加入乙醇溶液，加热回流，滤过，合并滤液，减压浓缩至无醇味，加乙酸，摇匀后缓缓加至已处理干净的聚酰胺柱上，洗脱，至洗脱液滴加氨水不变色为止，弃去，加氨水溶液洗脱至无色，收集氨水洗脱液，减压浓缩至干，残渣加乙醇溶解定容，取适量经微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液；
S2.对照品溶液的制备：称取鸡骨草丙素、鸡骨草乙素、鸡骨草甲素、N-反式对香豆酰酪氨酸适量，精密称定，乙醇溶解，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液；
S3.测定：精密吸取供试品溶液和对照品溶液，采用液相色谱法测定，得到指纹图谱，以鸡骨草甲素对照品的色谱峰保留时间和峰面积为1，进行相对保留时间和相对峰面积的计算以及相似度评价。
进一步地，所述步骤S1中的供试品溶液的制备方法为称取鸡骨草，粉碎，取1～5g，精密称定，加入10～50倍30％～70％乙醇溶液，加热回流2～5次，滤过，合并滤液，减压浓缩至无醇味，加1～4滴乙酸，摇匀后缓缓加至已处理干净的聚酰胺柱上，分别用0.05％～0.2％乙酸水和0.05％～0.2％乙酸的10～30％乙醇洗脱，至洗脱液滴加氨水不变色为止，弃去，加pH10的氨水溶液洗脱至无色，收集氨水洗脱液，减压浓缩至干，残渣加30％～70％乙醇溶解定容，取适量经微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。
其中，0.1％乙酸水的制备方法：准确量取100ml水，加入0.1ml乙酸，摇匀，即得；0.1％乙酸的20％乙醇的制备方法：取100ml20％体积分数的乙醇溶液，加0.1ml乙酸，摇匀，即得。
进一步地，所述步骤S2中的对照品溶液的制备方法为称取鸡骨草丙素、鸡骨草乙素、鸡骨草甲素、N-反式对香豆酰酪氨酸适量，精密称定，用30％～70％乙醇溶解，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液；
进一步地，所述液相色谱法测定的梯度洗脱程序为：从0-10min，流动相A的体积百分含量由20％提高至26％，流动相B的体积百分含量由80％降低至74％；从10-20min，流动相A的体积百分含量由26％提高至28％，流动相B的体积百分含量由74％降低至72％；从20-30min，流动相A的体积百分含量由28％提高至30％，流动相B的体积百分含量由72％降低至70％；从30-45min，流动相A的体积百分含量由30％提高至32％，流动相B的体积百分含量由70％降低至68％；从35-40min，流动相A的体积百分含量由32％提高至35％，流动相B的体积百分含量由68％降低至65％。
进一步地，所述的液相色谱法测定的流动相A为甲醇-乙腈混合液，流动相B为0.05％～0.2％甲酸水溶液。
更进一步地，所述的液相色谱法测定的流动相A甲醇-乙腈混合液中甲醇和乙腈的体积比为325:75。
进一步地，所述的液相色谱法所采用的液相色谱仪为超高效液相色谱仪(UPLC)和高效液相色谱仪(HPLC)中的至少一种。
更进一步地，所述的液相色谱法所采用的液相色谱仪为超高效液相色谱仪，所述超高效液相色谱仪的色谱柱规格为2.1mm×100mm、1.8μm，流速为0.3mL/min，进样量为0.3μL，柱温为25℃。
进一步地，所述的液相色谱指纹图谱有20个共有特征峰，其中，第11号峰为鸡骨草丙素峰，第12号峰为N-反式对香豆酰酪氨酸峰，第15号峰为鸡骨草乙素峰，第20号峰为鸡骨草甲素峰，记第20号峰为参照峰。
本发明提供的鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱可应用于鸡骨草药材和酰胺类提取物及其相关制剂产品的鉴别、质量评价和质量控制、质量检测中。
与现有技术相比，本发明有以下优点和用途：
(1)本发明建立了鸡骨草酰胺类成分指纹图谱，并指认了其中主要的代表性活性成分对香豆酰酪氨酸峰、鸡骨草甲素、鸡骨草乙素和鸡骨草丙素，能有效实现不同来源鸡骨草中酰胺类成分的质量分析和相似度评价，可从整体上控制酰胺类有效部位的质量。
(2)本发明对对香豆酰酪氨酸峰、鸡骨草甲素、鸡骨草乙素和鸡骨草丙素等成分同时进行检测，把鸡骨草所有酰胺类成分的指纹图谱作为一个整体，注重图谱的整体性特征，可根据图谱进行各成分的含量测定，避免了单一成分测定进行质量评价的单一性。本发明为鸡骨草及其酰胺类成分的质量检测和评价提供一个新的检测方法和标准，为其成分谱特征、质量和疗效控制提供研究基础和依据。
(3)本发明采用液相色谱，具有鉴别、稳定、精密度和重现性好、分离度高、易于操作等特点，优选的鸡骨草酰胺类成分UPLC指纹图谱，各峰分布均匀，共有峰特征优势更为明显，可在鸡骨草药材和酰胺类提取物及其相关制剂产品的鉴别、质量评价和控制等检测中得到应用。
附图说明
图1为鸡骨草酰胺类成分的超高液相色谱共有图谱：其中，第11号、第12号、第15号和第20号峰分别为鸡骨草丙素、N-反式对香豆酰酪氨酸、鸡骨草乙素和鸡骨草甲素；
图2为对照品的超高液相色谱图谱：其中，1为鸡骨草丙素、2为N-反式对香豆酰酪氨酸、3为鸡骨草乙素、4为鸡骨草甲素；
图3为24批鸡骨草的超高液相色谱指纹图谱叠加图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例
(1)仪器与药品：使用Agilent 1290超高效液相色谱仪。24批不同产地和采收期的鸡骨草药材经鉴定分别为豆科植物相思子属广州相思子(Abrus cantoniensis Hance)或毛相思子(Abrus mollis Hance)的干燥叶。N-反式对香豆酰酪氨酸、鸡骨草甲素、鸡骨草乙素和鸡骨草丙素对照品(广东药科大学新药研发中心自制)。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯净水。本试验中试剂的浓度百分数均为体积百分数。
(2)供试品溶液的制备：称取鸡骨草药材2g，精密称定，置于锥形瓶中，加入50％乙醇溶液60mL，加热回流3次，每次1h，滤过，合并滤液，减压浓缩至无醇味，加2滴乙酸，摇匀后缓缓加至已处理干净的聚酰胺柱上，分别用0.1％乙酸水(约150ml)和0.1％乙酸的20％乙醇洗脱(约360ml)，至洗脱液滴加氨水不变色为止，弃去，加pH10的氨水溶液洗脱至无色(约120ml)，收集氨水洗脱液，减压浓缩至干，残渣加50％乙醇溶解定容至50mL，取适量经0.45μL微孔滤膜，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
0.1％乙酸水的制备方法：准确量取100ml水，加入0.1ml乙酸，摇匀，即得；0.1％乙酸的20％乙醇的制备方法：取100ml20％体积分数的乙醇溶液，加0.1ml乙酸，摇匀，即得。
(3)对照品溶液的制备：精密称取鸡骨草丙素、鸡骨草乙素、鸡骨草甲素、N-反式对香豆酰酪氨酸适量，分别用50％乙醇溶解，定容10mL，制得质量浓度分别为17.50、82.00、90.00、81.00μg/mL的对照品溶液。
(4)超高液相色谱分析：精密吸取供试品溶液和对照品溶液0.3μL注入超高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为Eclipse plus C18(2.1mm×100mm，1.8μm)，流速0.3mL/min，检测波长275nm，柱温25℃，流动相为甲醇-乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，采用表1梯度条件，进行梯度洗脱：
表1梯度洗脱条件
Figure GDA0003636264730000051
(5)取24批鸡骨草药材分别上述方法进行提取和检测，记录色谱图，分析比较得到由共有峰构成的鸡骨草酰胺类成分UPLC指纹图谱，见图1。
将24批药材数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2004A版)”软件进行处理。选择色谱峰峰形好，分离度好，基线平整的S15样品色谱图作为参照图谱。采用中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，时间窗宽度设为0.1，运用手动多点校正方法对色谱峰进行全谱峰匹配，24批鸡骨草的UPLC指纹图谱叠加图如图3，并生成对照指纹图谱。以鸡骨草甲素(20号峰)分离度较高，峰形对称，选为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的20个共有峰的相对保留时间、相对峰面积和相似度结果分别见表2、表3和表4。
表2各共有峰相对保留时间
Figure GDA0003636264730000061
Figure GDA0003636264730000071
Figure GDA0003636264730000072
Figure GDA0003636264730000081
表3各共有峰相对峰面积
Figure GDA0003636264730000082
Figure GDA0003636264730000091
Figure GDA0003636264730000092
Figure GDA0003636264730000101
表4 24批鸡骨草指纹图谱相似度评价
Figure GDA0003636264730000102
Figure GDA0003636264730000111
Figure GDA0003636264730000121
(6)对本发明的鸡骨草药材酰胺类成分超高效液相色谱指纹图谱构建方法的精密度、重现性以及提取供试品的稳定性进行测定。
精密度考察：按照供试品制备方法制备一份供试品，连续进样6次，计算各共有峰相对峰面积RSD均小于3.0％，相对保留时间RSD均小于0.2％，结果见表5、表6。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2004A版)”软件进行相似度评价，相似度均大于0.99，表明仪器稳定，精密度良好。
表5精密度考察各共有峰相对峰面积及RSD(n＝6)
Figure GDA0003636264730000122
Figure GDA0003636264730000131
表6精密度考察各共有峰相对保留时间及RSD(n＝6)
Figure GDA0003636264730000132
重现性考察：按照供试品制备方法制备六份供试品，计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间RSD均小于3.0％，结果见表7、表8。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2004A版)”软件进行相似度评价，相似度均大于0.99，表明方法重现性良好。
表7重现性考察各共有峰相对峰面积及RSD(n＝6)
Figure GDA0003636264730000141
表8重现性考察各共有峰相对保留时间及RSD(n＝6)
Figure GDA0003636264730000142
Figure GDA0003636264730000151
稳定性考察：按照供试品制备方法制备一份供试品，室温下放置，分别于0，2，4，8，12，24h进样测定，记录峰面积，考察色谱峰相似度的一致性，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2004A版)”软件进行相似度评价，相似度均大于0.99，计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间RSD均小于3.0％，结果见表9、表10。表明供试品在24h内稳定性良好。
表9稳定性考察各共有峰相对峰面积及RSD(n＝6)
Figure GDA0003636264730000152
Figure GDA0003636264730000161
表10稳定性考察各共有峰相对保留时间及RSD(n＝6)
Figure GDA0003636264730000162
Figure GDA0003636264730000171
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.供试品溶液的制备：称取鸡骨草，粉碎，精密称定，加入乙醇溶液，加热回流，滤过，合并滤液，减压浓缩至无醇味，加乙酸，摇匀后缓缓加至已处理干净的聚酰胺柱上，洗脱，至洗脱液滴加氨水不变色为止，弃去，加氨水溶液洗脱至无色，收集氨水洗脱液，减压浓缩至干，残渣加乙醇溶解定容，取适量经微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液；
S2.对照品溶液的制备：称取鸡骨草丙素、鸡骨草乙素、鸡骨草甲素、N-反式对香豆酰酪氨酸适量，精密称定，乙醇溶解，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液；
S3.测定：精密吸取供试品溶液和对照品溶液，采用液相色谱法测定，得到指纹图谱，以鸡骨草甲素对照品的色谱峰保留时间和峰面积为1，进行相对保留时间和相对峰面积的计算以及相似度评价；
所述的液相色谱法测定的流动相A为体积比为325:75的甲醇-乙腈混合液，流动相B为0.05％～0.2％甲酸水溶液；
所述液相色谱法测定的梯度洗脱程序为：从0-10min，流动相A的体积百分含量由20％提高至26％，流动相B的体积百分含量由80％降低至74％；从10-20min，流动相A的体积百分含量由26％提高至28％，流动相B的体积百分含量由74％降低至72％；从20-30min，流动相A的体积百分含量由28％提高至30％，流动相B的体积百分含量由72％降低至70％；从30-45min，流动相A的体积百分含量由30％提高至32％，流动相B的体积百分含量由70％降低至68％；从35-40min，流动相A的体积百分含量由32％提高至35％，流动相B的体积百分含量由68％降低至65％。
2.根据权利要求1所述的鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中的供试品溶液的制备方法为称取鸡骨草，粉碎，取1～5g，精密称定，加入10～50倍30％～70％乙醇溶液，加热回流2～5次，滤过，合并滤液，减压浓缩至无醇味，加1～4滴乙酸，摇匀后缓缓加至已处理干净的聚酰胺柱上，分别用0.05％～0.2％乙酸水和0.05％～0.2％乙酸的10～30％乙醇洗脱，至洗脱液滴加氨水不变色为止，弃去，加pH10的氨水溶液洗脱至无色，收集氨水洗脱液，减压浓缩至干，残渣加30％～70％乙醇溶解定容，取适量经微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中的对照品溶液的制备方法为称取鸡骨草丙素、鸡骨草乙素、鸡骨草甲素、N-反式对香豆酰酪氨酸适量，精密称定，用30％～70％乙醇溶解，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液。
4.根据权利要求1中所述的鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述的液相色谱法所采用的液相色谱仪为超高效液相色谱仪和高效液相色谱仪中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述的液相色谱法所采用的液相色谱仪为超高效液相色谱仪，所述超高效液相色谱仪的色谱柱规格为2.1mm×100mm、1.8μm，流速为0.3mL/min，进样量为0.3μL，柱温为25℃。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的鸡骨草酰胺类成分液相色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述的液相色谱指纹图谱有20个共有特征峰，其中，第11号峰为鸡骨草丙素峰，第12号峰为N-反式对香豆酰酪氨酸峰，第15号峰为鸡骨草乙素峰，第20号峰为鸡骨草甲素峰，记第20号峰为参照峰。
7.权利要求1～5中任一项所述的构建方法在对鸡骨草药材和酰胺类提取物及其相关制剂产品的鉴别、质量评价和质量控制、质量检测中的应用。
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