CN110907545B - 一种同时测定小金制剂体内六种代谢产物含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时测定小金制剂体内六种代谢产物含量的方法，所述六种代谢产物为乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、3‑乙酰基‑11‑酮基‑β‑乳香酸、11‑酮基‑β‑乳香酸、蚯御素，所述测定方法包括以下步骤：1)对血浆样品进行前处理，得待测样品溶液；2)向待测样品溶液中加入正离子内标和负离子内标，进行HPLC‑MS/MS检测。本发明首次针对小金制剂在生物体内的六种代谢产物，建立了一种便捷、准确、灵敏、可靠的液质联用含量测定方法，该方法可应用于小金制剂的血清药理学研究，更好地监测药物在体内的药代动力学过程。

Description

一种同时测定小金制剂体内六种代谢产物含量的方法
技术领域
本发明涉及生物样品中药物代谢产物的含量测定方法，尤其是一种同时测定小金制剂体内六种代谢产物含量的方法。
背景技术
《中国药典》2010版一部收载了一种具有散结消肿，化瘀止痛之功效的中药，药品名是“小金丸”，由人工麝香、木鳖子、草乌、枫香脂、乳香、没药、五灵脂、当归、地龙、香墨等10味中药制备而成。该方是中医经典名方，可用于多种疑难杂症如甲状腺肿、良性***增生、带状疱疹后遗神经痛、乳腺囊性增生、慢性***包块及结节性筋膜炎等的治疗。目前已有片剂、胶囊剂等多种制剂上市，如CN106265992A公开了小金胶囊及其制备方法，CN102764311A公开了小金分散片及其制备方法。
为了探明中药复方配伍规律，揭示其药效作用机制和治疗疾病的物质基础，申请人在前期研究的基础上对小金制剂进行了大量基础研究，其中包括采用现代提取分离技术对中药的总多糖、总皂苷、总黄酮等部位进行提取分离，结合药效学试验确定有效部位群；同时还开展血清药理学研究，观察了进入体内的有效成分及其代谢产物以及一些经药物作用后机体所产生的内生性产物的药理作用。在研究过程中，首次发现小金制剂经口服后进入血清的一系列可能具有生理活性的化合物，为了更好地监测这些化合物在体内的药代动力学过程，有必要建立一种便捷、准确、灵敏的含量测定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时测定小金制剂体内六种代谢产物含量的方法。
所述小金制剂由以下重量份数的原料制成：人工麝香1-20份、草乌40-60份、乳香20-40份、五灵脂40-60份、地龙40-60份、木鳖子40-60份、枫香脂40-60份、没药20-40份、当归20-40份、香墨1-10份，
所述六种代谢产物为乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸、11-酮基-β-乳香酸、蚯御素，它们的化学结构如图1所示。
所述测定方法包括以下步骤：
1)对血浆样品进行前处理，得待测样品溶液；
2)向待测样品溶液中加入正离子内标和负离子内标，进行HPLC-MS/MS检测，其中，所述高效液相的固定相是C18键合硅胶色谱柱，流动相A是0.05-0.5％甲酸水溶液，流动相B是乙腈，采用梯度洗脱，流速为0.1-0.5mL/min，柱温为25-40℃，所述质谱采用正负离子两种模式，电喷雾电离离子源，扫描方式为多反应离子监测模式，正离子模式下，检测乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸、11-酮基-β-乳香酸和正离子内标原阿片碱；负离子模式下，检测蚯御素与负离子内标异嗪皮啶。
优选地，所述正离子内标为原阿片碱，所述负离子内标为异嗪皮啶。
优选地，所述流动相A是0.1％甲酸水溶液。
优选地，所述流速为0.3mL/min。
优选地，所述柱温为35℃。
优选地，所述梯度洗脱在正离子模式下，0.01-2.5min，10-80％乙腈；2.5-3.5min，80-100％乙腈；3.5-6min，100％乙腈；6-7min，100-10％乙腈；7-10min，10％乙腈，单次运行时间为10min；在负离子模式下，0.01-0.5min，30％乙腈；0.5-2min，30-80％乙腈；2-2.1min，80-30％乙腈；2.1-5min，30％乙腈，单次运行时间为5min。
优选地，所述质谱的干燥气温度为550℃；气帘气为40psi；碰撞气为中等；离子喷雾电压为5500(+)/-4500(-)V；雾化气为50psi,辅助加热气为55psi。
优选地，所述血浆样品的前处理方法是，涡旋振荡2min，4℃下13000rpm离心10min，移取上清溶液，氮气挥干溶剂，残渣用甲醇溶液复溶，4℃下13000rpm离心10min，吸取上清溶液。
本发明首次针对小金制剂在生物体内的六种代谢产物，建立了一种便捷、准确、灵敏、可靠的液质联用含量测定方法，该方法可应用于小金制剂的血清药理学研究，更好地监测药物在体内的药代动力学过程。
附图说明
图1.六种待测化合物和2种内标化合物的结构式。
图2雌性SD大鼠血浆中6种待测化合物与2种内标化合物的HPLC-MS/MS色谱图。A：大鼠空白血浆色谱图；B：6种待测化合物和内标混合溶液色谱图；C：空白血浆加6种待测化合物和内标混合溶液色谱图；D：小金胶囊口服给药45min后大鼠的血浆加内标化合物色谱图。(1.乌头原碱，2.准噶尔乌头碱，3.里奥林，4.AKBA，5.KBA，6.原阿片碱(IS+)，7.蚯御素，8.异嗪皮啶(IS-))
具体实施方式
本发明对健民药业集团股份有限公司生产的中药复方小金胶囊中6种生物代谢产物在大鼠血浆中的HPLC-MS/MS定量分析方法进行了建立与开发，并开展了生物样品的方法学考察，包括特异性、线性范围、定量下限、精密度、准确度、基质效应、稳定性等方面进行验证。以此为小金胶囊多成分药代动力学研究提供准确、快速、稳定可靠的分析手段。
按照“君药以及名贵药中的代表性成分、体外含量较大的成分、文献报道的药效成分、单味药的代表成分、不同类化合物的代表性成分”等原则，综合申请人前期小金胶囊血清药物化学的研究结果，选取了乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸(AKBA)、11-酮基-β-乳香酸(KBA)、蚯御素这6种成分，进行方法学研究。其主要成为三类：以乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林为代表的乌头碱类生物碱；AKBA、KBA是三萜酸类化合物；蚯御素为地龙中新发现的呋喃磺酸类化合物，其体内的代谢规律尚未报道过，可为其后续研究提供理论基础。6种化合物的化学结构如图1。
1.实验材料
1.1仪器
Figure GDA0002339260830000031
Figure GDA0002339260830000041
1.2药品与试剂
药品与试剂 生产公司 国家
乌头原碱 中国食品药品检定研究院 中国
准噶尔乌头碱 上海源叶生物科技有限公司 中国
里奥林 上海源叶生物科技有限公司 中国
11-酮基-β-乳香酸 上海源叶生物科技有限公司 中国
3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸 上海源叶生物科技有限公司 中国
原阿片碱(IS) 中国食品药品检定研究院 中国
异嗪皮啶(IS) 中国食品药品检定研究院 中国
小金胶囊(批号:20170231) 武汉健民集团股份有限公司 中国
水合氯醛 国药集团化学试剂有限公司 中国
肝素钠 国药集团化学试剂有限公司 中国
甲醇(质谱级) Merck 德国
乙腈(质谱级) Merck 德国
甲酸(质谱级) Sigma-Aldrich 美国
亮氨酸脑啡肽校正液 Sigma-Aldrich 美国
超纯水(18.2Ω) MilliQ 50SP纯水*** 美国
乙酸乙酯 上海润捷化学试剂有限公司 中国
蚯御素为本实验室从单味药地龙中分离纯化所得，其结构经核磁共振质谱(1HNMR,13C NMR)、UPLC-Q-TOF-MS验证其结构为2-己基-5-乙基-呋喃-3-磺酸。所有标准品化合物的纯度经HPLC测试，均高于98％。
1.3实验动物
健康、成年的雌性SD大鼠，体重200±20g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物质量合格证号：SCXK(沪)2018-0006。动物常规饲养于海军军医大学药学院实验动物中心，适应性饲养7天，给予标准饲料和饮用水，保持室温24±2℃，相对湿度55±5％，12h黑暗光照周期。实验前12h禁食，但仍给予饮水。
2.实验方法与结果
2.1溶液的配置
分别精密称取乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、AKBA、KBA、蚯御素标准品5.03mg，4.95mg，5.04mg，4.98mg，4.93mg，4.90mg，置于5mL棕色容量瓶中，先加适量的甲醇溶液进行溶解，然后再加入甲醇至刻度进行定容，混合摇匀即得质量浓度为1.006mg/mL，0.990mg/mL，1.008mg/mL，0.996mg/mL，0.986mg/mL，0.998mg/mL的标准品储备液。
分别精密称取5.0mg的内标原阿片碱和异嗪皮啶标准品，用甲醇-乙腈(1:3，v/v)混合溶液配置成质量浓度为400ng/mL的混合内标储备液，放置于4℃冰箱储存。
2.2血浆样品前处理
精密量取正常大鼠空白血浆180μL，置于1.5mL EP管内，分别加入20μL各系列浓度的6种标准品的混合溶液和800μL溶度为400ng/mL原阿片碱和异嗪皮啶的混合内标溶液。涡旋振荡2min，4℃下13000rpm离心10min，移取上清溶液置于另一干净1.5mL EP管内。氮气仪设置为35℃下挥干溶剂，残渣用200μL甲醇溶液复溶，4℃下13000rpm离心10min，吸取上清溶液，2μL进样。
2.3分析条件
2.3.1液相条件
采用Agilent Eclipse Plus C18(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱，流动相由0.1％(v/v)甲酸水溶液(A)和乙腈(B)组成，流速为0.3mL/min，柱温为35℃，进样量为2μL。6种化合物分为正负离子两种模式采集，为了缩短采集时间提高分析效率，正负模式分别优化了洗脱梯度。在正离子模式下，0.01-2.5min，10-80％(v/v)乙腈；2.5-3.5min，80-100％乙腈；3.5-6.0min，100％乙腈；6.0-7.0min，100-10％乙腈；7.0-10.0min，10％乙腈，单次运行时间为10.0min。在负离子模式下，0.01-0.5min，30％乙腈；0.5-2.0min，30-80％乙腈；2.0-2.1min，80-30％乙腈；2.1-5.0min，30％乙腈，单次运行时间为5.0min。
2.3.2质谱条件
AB SCIEX 4500QTRAPTM质谱(AB SCIEX，美国)，采用电喷雾电离(ESI)离子源，扫描方式为多反应离子监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)。雾化气、干燥气和碰撞气均为氮气；干燥气温度：550℃，气帘气(Curtain Gas)：40psi；碰撞气(CollisionGas)：medium；喷雾电压(Ionspray Voltage)：5500(+)/-4500(-)V；雾化气(Gas1)：50psi,辅助加热气(Gas2)：55psi。采用AnalystTM 1.6.3工作站进行质谱数据的采集。正离子模式下，检测乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、AKBA、KBA和正离子内标原阿片碱；负离子模式下，检测蚯御素与负离子内标异嗪皮啶。各待测成分的最优MRM参数见表1。
表1六种待测化合物与两内标化合物的子母离子对和MRM参数
Figure GDA0002339260830000061
2.4方法学考察
2.4.1特异性考察
大鼠空白血浆、6种待测化合物和内标混合溶液、空白血浆加6种待测化合物和内标混合溶液、小金胶囊口服给药45min后大鼠的血浆加内标化合物的样品，按照“2.2”项下的方法进行生物样品前处理，按照“2.3”项下的液相和质谱条件进行进样分析检测，其结果所得的色谱图见图2。结果表明，大鼠血浆中的内源性物质不干扰6种待测化合物和内标的检测，大鼠空白血浆中加入6种待测化合物和内标溶液与小金胶囊给药后的大鼠血浆加内标溶液的色谱行为一致。
2.4.2线性考察
移液枪精密吸取空白血浆180μL转移至空白1.5mL EP管中，分别加入20μL一系列不同浓度的6种待测化合物的混合标准品溶液，配置成质量浓度分别为：乌头原碱0.10、0.20、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、40.00ng/mL；准噶尔乌头碱0.20、0.40、2.00、4.00、10.00、20.00、40.00、80.00ng/mL；里奥林0.50、1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00、200.00ng/mL；AKBA7.50、15.00、30.00、75.00、150.00、375.00、750.00、1500.00ng/mL；KBA7.50、15.00、30.00、75.00、150.00、375.00、750.00、1500.00ng/mL；蚯御素25.00、62.50、125.00、250.00、625.00、1250.00、2500.00、5000.00ng/mL的血浆样品，按照“2.2”项下的方法进行生物样品前处理，按照“2.3”项下的液相和质谱条件进行进样分析检测，记录数据并绘制标准曲线，计算其各个化合物的线性回归方程，结果见表2。结果可得，化合物乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、AKBA、KBA以及蚯御素分别在0.10-40.00ng/mL，0.20-80.00ng/mL，0.50-200.00ng/mL，7.50-1500.00ng/mL，7.50-1500.00ng/mL，25.00-5000.00ng/mL范围内线性关系良好。
表2大鼠血浆中六种待测化合物的回归方程和回归系数
化合物 线性范围/(ng/mL) 回归方程 R
乌头原碱 0.10～40.00 y＝0.00322x+0.00119 0.9982
准噶尔乌头碱 0.20～80.00 y＝0.0146x+0.00709 0.9910
里奥林 0.50～200.00 y＝0.0202x+0.0118 0.9946
AKBA 7.50～1500.00 y＝0.1104x+0.0967 0.9927
KBA 7.50～1500.00 y＝0.0284x-0.3621 0.9912
蚯御素 25.00～5000.00 y＝0.0065x+0.0477 0.9974
2.4.3定量下限考察
移液枪精密吸取空白血浆180μL于空白1.5mL EP管中，加入20μL6种待测化合物的混合溶液，配制成6种待测化合物质量浓度分别为0.10、0.20、0.50、7.50、7.50、25.00ng/mL的血浆样品溶液5份，按照“2.2”项下的方法进行生物样品前处理，按照“2.3”项下的液相和质谱条件进行进样分析检测，记录数据分析其实际溶度并计算RSD值。结果见表3。由表中数据可知，其RSD值在5.11-11.02％范围内，小于15％，符合血浆样品的分析要求。
表3乌头原碱在大鼠血浆中的定量下限(n＝5)
Figure GDA0002339260830000071
2.4.4精密度考察
移液枪精密吸取空白血浆180μL于空白1.5mL EP管中，加入20μL 6种待测化合物的混合溶液，配制成6种待测化合物的定量下限、低浓度、中浓度、高浓度四种等级浓度的质量控制(QC)样品，每个浓度平行配制5份，即乌头原碱浓度为0.10、0.30、5.00、32.00ng/mL；准噶尔乌头碱浓度为0.20、0.60、10.00、64.00ng/mL；里奥林浓度为0.50、1.50、25.00、160.00ng/mL；AKBA浓度为7.50、22.50、150.00、1200.00ng/mL；KBA浓度为7.50、22.50、150.00、1200.00ng/mL；蚯御素浓度为25.00、75.00、625.00、4000.00ng/mL的血浆样品。按照“2.2”项下的方法进行生物样品前处理，按照“2.3”项下的液相和质谱条件进行进样分析检测，记录数据分析其实际溶度，计算其日内精密度与日间精密度。结果见表4-1至表4-6，结果表明RSD在2.11-10.48％之间，小于15％，符合血浆样品的分析要求。
表4-1大鼠血浆中乌头原碱精密度测定结果(n＝5)
Figure GDA0002339260830000081
表4-2大鼠血浆中准噶尔乌头碱精密度测定结果(n＝5)
Figure GDA0002339260830000082
表4-3大鼠血浆中里奥林精密度测定结果(n＝5)
Figure GDA0002339260830000083
Figure GDA0002339260830000091
表4-4大鼠血浆中AKBA精密度测定结果(n＝5)
Figure GDA0002339260830000092
表4-5大鼠血浆中KBA精密度测定结果(n＝5)
Figure GDA0002339260830000093
表4-6大鼠血浆中蚯御素精密度测定结果(n＝5)
Figure GDA0002339260830000094
2.4.5准确度考察
本实验以SD大鼠空白血浆进行准确度(即相对回收率)考察，移液枪精密吸取空白血浆180μL于空白1.5mL EP管中，加入20μL 6种待测化合物的混合溶液，配制成6种待测化合物的定量下限、低浓度、中浓度、高浓度四种等级浓度的质量控制(QC)样品，每个浓度平行配制5份，即乌头原碱浓度为0.10、0.30、5.00、32.00ng/mL；准噶尔乌头碱浓度为0.20、0.60、10.00、64.00ng/mL；里奥林浓度为0.50、1.50、25.00、160.00ng/mL；AKBA浓度为7.50、22.50、150.00、1200.00ng/mL；KBA浓度为7.50、22.50、150.00、1200.00ng/mL；蚯御素浓度为25.00、75.00、625.00、4000.00ng/mL的血浆样品。按照“2.2”项下的方法进行生物样品前处理，按照“2.3”项下的液相和质谱条件进行进样分析检测，记录数据分析其实际溶度，并用实际测得浓度与其标识浓度之比计算准确度(即相对回收率)，具体结果见表5-1至表5-2，6种化合物的相对回收率在85.580％-108.250％之间，RSD在0.75％-11.72％之间，小于15％。即该方法中6种化合物的准确度良好，符合生物样品的分析要求。
表5-1大鼠血浆中乌头原碱准确度测定结果(n＝5)
Figure GDA0002339260830000101
Figure GDA0002339260830000111
表5-2大鼠血浆中准噶尔乌头碱准确度测定结果(n＝5)
Figure GDA0002339260830000112
表5-3大鼠血浆中里奥林准确度测定结果(n＝5)
Figure GDA0002339260830000121
表5-4大鼠血浆中AKBA准确度测定结果(n＝5)
Figure GDA0002339260830000122
Figure GDA0002339260830000131
表5-5大鼠血浆中KBA准确度测定结果(n＝5)
Figure GDA0002339260830000132
Figure GDA0002339260830000141
表5-6大鼠血浆中蚯御素准确度测定结果(n＝5)
Figure GDA0002339260830000142
2.4.6基质效应考察
移液枪精密吸取空白血浆180μL于空白1.5mL EP管中，加入20μL 6种待测化合物的混合溶液，配制成含6种待测化合物的低浓度、中浓度、高浓度三种浓度等级的质控样品，每个浓度平行配制6份，按照“2.2”项下的方法进行生物样品前处理，按照“2.3”项下的液相和质谱条件进行进样分析检测，记录乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、AKBA、KBA、蚯御素的峰面积为A1；另外将180μL纯净水代替180μL空白血浆，其他同上述操作，记录此时乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、AKBA、KBA、蚯御素的峰面积为A2，则乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、AKBA、KBA、蚯御素的基质效应为：(A1/A2)×100％。若各生物样本得到的A1/A2都在85％-115％范围内则无基质效应。实验结果如表6所示，6种化合物的基质效应在93.45％-100.64％之间，RSD在1.27％-5.13％之间，符合生物样品定量的要求。
表6大鼠血浆6种待测化合物和内标基质效应(n＝6)
Figure GDA0002339260830000151
Figure GDA0002339260830000161
2.4.7稳定性考察
移液枪精密吸取空白血浆180μL于空白1.5mL EP管中，加入20μL 6种待测化合物的混合溶液，配制成6种待测化合物的低浓度、中浓度、高浓度三种等级浓度的质量控制(QC)样品，每个浓度平行配制5份，即乌头原碱浓度为0.30、5.00、32.00ng/mL；准噶尔乌头碱浓度为0.60、10.00、64.00ng/mL；里奥林浓度为1.50、25.00、160.00ng/mL；AKBA浓度为22.50、150.00、1200.00ng/mL；KBA浓度为22.50、150.00、1200.00ng/mL；蚯御素浓度为75.00、625.00、4000.00ng/mL的血浆样品，考察血浆中6种待测化合物的短期稳定性和长期稳定性。其中短期稳定考察主要包括考察室温放置稳定性、自动进样器稳定性和反复冻融稳定性；长期稳定性则是考察血浆样品在-80℃冰箱放置20天的稳定性，其考察结果见表7-1至表7-4。根据结果可得，RSD在1.27％-8.49％之间，小于15％，即乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、AKBA、KBA和蚯御素的低浓度、中浓度、高浓度这3个浓度的质控样品在短期和长期考察中均表现出稳定性良好，满足生物样品分析条件。
表7-1大鼠血浆6种待测化合物室温放置稳定性(n＝5)
Figure GDA0002339260830000162
Figure GDA0002339260830000171
表7-2大鼠血浆6种待测化合物自动进样器稳定性(n＝5)
Figure GDA0002339260830000172
表7-3大鼠血浆6种待测化合物反复冻融稳定性(n＝5)
Figure GDA0002339260830000173
Figure GDA0002339260830000181
表7-4大鼠血浆6种待测化合物长期稳定性(n＝5)
Figure GDA0002339260830000182
Figure GDA0002339260830000191
3.小结
本发明建立了一种基于HPLC-MS/MS同时测定生物样品中乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、AKBA、KBA和蚯御素这6种小金胶囊代谢产物以及内标原阿片碱和异嗪皮啶的灵敏、快速、简便、稳定的体内含量测定方法。乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、AKBA、KBA和内标原阿片碱采用正离子模式进行采集，分析时间为10分钟；蚯御素和内标异嗪皮啶采用负离子模式进行采集，分析时间为5分钟。并开展了生物样品的方法学考察，从专属性、线性范围、定量下限、精密度、准确度、基质效应、稳定性等方面对所建立的LC-MS/MS测定方法进行方法学考察，各考察结果均符合生物样品的分析要求，表明所建立的6种代谢产物的分析方法简便、稳定、可靠，可用于这6种代谢产物在大鼠体内的血药浓度的测定。

Claims (4)

1.一种同时测定小金制剂体内六种代谢产物含量的方法，所述小金制剂由以下重量份数的原料制成：人工麝香1-20份、草乌40-60份、乳香20-40份、五灵脂40-60份、地龙40-60份、木鳖子40-60份、枫香脂40-60份、没药20-40份、当归20-40份、香墨1-10份，其特征在于：所述六种代谢产物为乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸、11-酮基-β-乳香酸、蚯御素，测定方法包括以下步骤：
1）对血浆样品进行前处理，得待测样品溶液，血浆样品前处理方法为：精密量取正常大鼠空白血浆180μL，置于1.5mL EP管内，分别加入20μL各系列浓度的6种标准品的混合溶液和800μL溶度为400ng/mL原阿片碱和异嗪皮啶的混合内标溶液；涡旋振荡2min，4℃下13000rpm离心10min，移取上清溶液置于另一干净1.5mL EP管内；氮气仪设置为35℃下挥干溶剂，残渣用200μL甲醇溶液复溶，4℃下13000rpm离心10min，吸取上清溶液，2μL进样；
小金胶囊口服给药45min后大鼠的血浆加内标化合物的样品按上述前处理方法处理；
所述混合内标溶液的溶剂为体积比为1:3的甲醇-乙腈混合溶液；
2）进行HPLC-MS/MS检测，其中，色谱柱是Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，规格为2.1×100mm，1.8μm，流动相A是0.05-0.5%甲酸水溶液，流动相B是乙腈，采用梯度洗脱，流速为0.1-0.5mL/min，柱温为25-40℃，质谱采用正负离子两种模式，电喷雾电离离子源，扫描方式为多反应离子监测模式，正离子模式下，检测乌头原碱、准噶尔乌头碱、里奥林、3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸、11-酮基-β-乳香酸和正离子内标原阿片碱；负离子模式下，检测蚯御素与负离子内标异嗪皮啶，
所述梯度洗脱在正离子模式下，0.01-2.5min，10-80%乙腈；2.5-3.5min，80-100%乙腈；3.5-6min，100%乙腈；6-7min，100-10%乙腈；7-10min，10%乙腈，单次运行时间为10min；在负离子模式下，0.01-0.5min，30%乙腈；0.5-2min，30-80%乙腈；2-2.1min，80-30%乙腈；2.1-5min，30%乙腈，单次运行时间为5min；
所述质谱的干燥气温度为550℃；气帘气为40psi；碰撞气为中等；离子喷雾电压为+5500/-4500V；雾化气为50psi, 辅助加热气为55psi。
2.如权利要求1所述同时测定小金制剂体内六种代谢产物含量的方法，其特征在于：所述流动相A是0.1%甲酸水溶液。
3.如权利要求1所述同时测定小金制剂体内六种代谢产物含量的方法，其特征在于：所述流速为0.3mL/min。
4.如权利要求1所述同时测定小金制剂体内六种代谢产物含量的方法，其特征在于：所述柱温为35℃。
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