CN108254470B - 地黄中糖类成分的同时测定及其指纹图谱构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种地黄中糖类成分的同时测定方法及其指纹图谱构建方法，所述测定方法为对供试品溶液进行HPLC‑ELSD检测，供试品溶液的制备方法如下：用水超声提取生地黄或熟地黄5～30分钟过滤，即可；液相色谱条件如下：色谱柱为Welch Ultimate Hilic‑NH2；流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，柱温为10～40℃；气体压力25～40psi，漂移管温度50～80℃。本发明建立的地黄药材HPLC‑ELSD指纹图谱检测方法，能从糖类成分方面反映地黄的质量，通过建立的标准指纹图谱能对生地黄进行质量控制，也可以用于熟地黄药材的质量控制，还可以作为生地黄、熟地黄配方颗粒的指纹图谱质量控制研究。

Description

地黄中糖类成分的同时测定及其指纹图谱构建方法
技术领域
本发明涉及一种地黄中糖类成分的同时测定及其指纹图谱构建方法。
背景技术
地黄为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鲜或干燥块根，前者习称“鲜地黄”，后者习称“生地黄”。熟地黄，则以生地黄为原料，经酒炖法或蒸法制成的加工炮制品。
国内外学者对地黄的化学成分研究显示：地黄含有多种苷类成分，其中主要含环烯醚萜及其苷类，如梓醇、桃叶珊瑚苷、益母草苷、地黄苷A/B/C/D等；苯乙醇糖苷，如洋地黄叶苷、焦地黄苯乙醇苷、毛蕊花糖苷、海胆苷等。此外，还含有大量糖类，虽然生地黄和鲜地黄所含糖类组分基本相同，但含量有明显差异。而熟地黄，则含较少量的环烯醚萜类成分，同时也富含糖类组分，有研究称其单糖组分含量较鲜地黄明显增加。且已有药理学研究证实，地黄中的环烯醚萜类及糖类成分与其生物活性密切相关，为其重要药效组分。
现有文献(张杰等，中国实验方剂学杂志，生地黄低聚糖部位的HPLC指纹图谱，第20卷第22期，2014年11月)在供试品溶液的制备过程中，还涉及比较复杂的萃取过程，并且，其不涉及蜜二糖和甘露三醇的检测。另一篇现有文献(张文婷等，中草药，地黄生品与炮制品中8个糖类成分及不同炮制时间点其量变化分析，第47卷第7期，2016年4月)研究的内容主要是采用HPLC法分析地黄生品及炮制品中8种糖类成分，探索炮制时间对地黄中糖类成分的影响，为揭示地黄炮制机制提供数据支持。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中对于地黄中糖类成分的检测时供试品溶液的萃取过程复杂、检测对象不全面的缺陷，而提供了一种地黄中糖类成分的同时测定及其指纹图谱构建方法。
本发明提供了一种地黄中糖类成分的同时测定方法，所述测定方法为对供试品溶液进行HPLC-ELSD检测，所述供试品溶液的制备方法包括如下步骤：用水超声提取生地黄或熟地黄5～30分钟过滤，即可；
液相色谱检测的条件如下：色谱柱为Welch Ultimate Hilic-NH2；流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，洗脱梯度如下：
时间(分钟) 流速(ml/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～25 0.5 28 72
25～25.1 0.8 28→30 72→70
25.1～45 0.8 30→35 70→65
45～55 0.8 35 65
柱温为10℃～40℃；
ELSD参数：气体压力25psi～40psi，漂移管温度50℃～80℃。
本发明中，所述的超声提取所用的溶剂水较佳地为超纯水。
本发明中，所述的过滤较佳地为使用0.45μm滤膜过滤。
本发明中，所述的柱温较佳地为20℃。
本发明中，所述的气体压力较佳地为35.0psi。
本发明中，所述的漂移管温度较佳地为60.0℃。
本发明中，较佳地，使用蒸发光散射检测器的雾化器冷却模式进行检测。
本发明中，所述糖类成分为本领域常规的糖类成分，具体包括D-果糖、D-无水葡萄糖、半乳糖、蔗糖、棉籽糖、水苏糖、蜜二糖、甘露三糖等几种具体糖类成分。
本发明还提供了一种地黄指纹图谱的构建方法，其包括如下步骤，采用上述测定方法检测地黄，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价***软件，模拟生成地黄指纹图谱。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明以HPLC法对地黄中糖类成分进行分析，具体采用ELSD检测器进行。本发明建立的地黄药材HPLC-ELSD指纹图谱检测方法，能从糖类成分方面反映地黄的质量，通过建立的标准指纹图谱能对生地黄进行质量控制。建立的指纹图谱也可以用于熟地黄药材的质量控制，还可以作为生地黄、熟地黄配方颗粒的指纹图谱质量控制研究。
附图说明
图1为实施例1的HPLC色谱图。
图2为实施例1、2、3对应的ELSD不同漂移管温度下的地黄的HPLC色谱图。
图3为实施例1、4对应的ELSD不同雾化器模式下的地黄的HPLC色谱图。
图4为实施例5的HPLC色谱图。
图5为实施例1、6、7对应的不同柱温下的地黄的HPLC色谱图。
图6为对比实施例1中色谱柱为Waters Atlantis T3时的HPLC色谱图。
图7为对比实施例1中色谱柱为GSK gel时的HPLC色谱图。
图8为对比实施例1中色谱柱为Welch Ultimate NH2时的HPLC色谱图。
图9为由中药色谱指纹图谱相似度评价***A版生成的生地黄药材HPLC对照指纹图谱。
图10为地黄药材指纹图谱共有峰1-5、7、9的指认。
图11为地黄药材指纹图谱共有峰6、8的指认。
图12为按照对照指纹图谱进行5批地黄颗粒指纹相似度匹配图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例、对比实施例和效果实施例中，都按照高效液相色谱法(2015年版《中国药典》通则0512)测定，仪器与试剂为：
Waters Alliance高效液相色谱仪(Waters 2695分离单元，2424ELSD检测器，Empower色谱工作站)；METTLER TOLEDO MS 105Du电子天平；KQ-250DE型医用数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；中药色谱指纹图谱相似度评价***2004A版。
Welch Ultimate Hilic-NH2色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)
乙腈，色谱纯；超纯水，自制；其他试剂均为分析纯。
研究用对照品来源及批号：
梓醇，含量测定用，批号110808-201210，中国食品药品检定研究院；
D-无水葡萄糖，含量测定用，110833-201506，中国食品药品检定研究院；
半乳糖，含量100％，批号100226-201506，中国食品药品检定研究院；
蔗糖，含量测定用，批号111507-201303，中国食品药品检定研究院；
D-果糖，含量98.8％，上海诗丹德生物技术有限公司；
棉籽糖，HPLC≥98％，批号TA0423CA14，上海月旭科技有限公司；
水苏糖，HPLC≥98％，批号K31AS2907，上海月旭科技有限公司；
甘露三糖，HPLC≥98％，批号L29M6Y1，上海月旭科技有限公司；
蜜二糖，HPLC≥98％，批号K23M7S15176，上海月旭科技有限公司。
下述实施例中，用到的样品为贵州同济堂制药有限公司提供的共计22个批次的地黄药材进行试验，地黄的相关信息具体见表1。
表1 22个批次的地黄的信息
Figure GDA0001228775920000041
Figure GDA0001228775920000051
实施例1
(1)色谱条件与***适应性试验：
以Welch Ultimate Hilic-NH2色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以超纯水为流动相A，以乙腈为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱；柱温为20℃；ELSD参数：雾化器冷却模式，气体压力35.0psi，漂移管温度60.0℃。理论板数以蔗糖计不低于7000。表2中，箭头的含义如下，以25～25.1分钟，流动相A的体积百分比从28→30为例，是指，流动相A的比例在10～25分钟之内，从28％降至30％。
表2实施例1的HPLC的洗脱梯度
Figure GDA0001228775920000052
Figure GDA0001228775920000061
(2)参照物溶液的制备：
取梓醇、D-果糖、D-无水葡萄糖、半乳糖、蔗糖、棉籽糖、水苏糖、蜜二糖、甘露三糖对照品适量，精密称定，加流动相分别制成每1ml含0.994mg、0.486mg、0.922mg、1.556mg、1.374mg、0.938mg、1.313mg、1.144mg、0.868mg的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤即得。
(3)供试品溶液的制备：
取批号为20150802的地黄粗粉1g，精密称定，置于100ml具塞锥形瓶中，加去离子水50ml，密塞，称定重量，超声(250W，40Hz)15分钟，取出放至室温，再以去离子水补足减失的重量，摇匀，过0.45um滤膜，取续滤液，即得。
(4)测定：
分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得，如图1。
实施例2
本实施例中漂移管温度为50.0℃，其余参数和条件均同实施例1，得到的色谱结果中各色谱峰形、分离度与实施例1相比相差不大。
实施例3
本实施例中漂移管温度为80.0℃，其余参数和条件均同实施例1，得到的色谱结果中各色谱峰形、分离度与实施例1相比相差不大。实施例1、实施例2和实施例3的具体谱图结果见图2。
结果显示：不同漂移管温度对分析检测结果有一定影响，相比之下，漂移管温度60℃时，噪音相对较小，基线较为稳定，色谱峰型与分离度均较好。
实施例4
本实施例中ELSD的雾化器模式为加热模式，其余参数和条件均同实施例1，得到的色谱结果中各色谱峰形、分离度与实施例1相比相差不大，具体请见图3。
结果显示：不同雾化器模式对分析检测结果有一定影响，两种模式下，色谱峰型与分离度均达到要求，但冷却模式较加热模式，噪音更小，基线更平稳光滑。
实施例5
本实施例中ELSD气体压力为30psi，其余参数和条件均同实施例1，得到的色谱结果中各色谱峰形、分离度与实施例1相比相差不大，具体请见图4。
结果显示：不同气体压力对分析检测影响不大，相比之下，实施例1中气体压力为35psi时，基线更平稳。
实施例6
本实施例中柱温为25℃，其余参数和条件均同实施例1。
实施例7
本实施例中柱温为30℃，其余参数和条件均同实施例1。对于不同柱温对分析检测的影响结果，请见图5。
结果显示：不同柱温对分析检测有一定影响，30℃柱温时，部分色谱峰型较差，相比之下，20℃柱温时，色谱峰型及分离效果均较好，基线也较平稳。
实施例8
本实施例中供试品溶液的提取时间为30分钟，其余参数和条件均同实施例1，得到的色谱结果中各色谱峰形、分离度与实施例1相比相差不大。
结果显示：不同超声提取时间制得的供试品溶液，色谱峰基本一致，15min和30min超声提取的供试品溶液，各峰面积/浓度比值基本接近，表明超声15min即可达到检测组分的基本完全提取。
对比实施例1不同色谱柱的效果比较
由于需聚焦分析地黄中的糖类组分，而糖的特殊结构及它本身不含强紫外和荧光吸收的官能团，选择三种可能适合的色谱柱：Waters Atlantis T3、GSK gel、WelchUltimate NH2进行对比分析。
取一批次(批号为20150802)生地黄药材照实施例1的方法制备供试品溶液，采用不同色谱柱进行摸索检测，记录色谱图，具体见图6、图7、图8。
结果显示：不同类型色谱柱对生地黄药材的分析检测效果具有较大差异，结合药材组分特点及不同色谱柱的性能与耐受性考虑，选Welch Ultimate NH2作为生地黄指纹图谱研究用色谱柱。
效果实施例1***适用性试验
取一供试品溶液(批号为20150802的地黄)，以实施例1中色谱条件进样检测。
以参照物梓醇计算理论板数，均大于10000；以指纹图谱共有色谱峰中已指认组分，在高效液相色谱仪中分别自动计算色谱分离度，结果见表3。
表3色谱分离度数据
共有色谱峰编号 对应成分 分离度
1 梓醇 1.3
2 D-果糖 7.3
3 D-无水葡萄糖 3.0
4 半乳糖 1.5
5 蔗糖 4.6
6 蜜二糖 8.5
7 棉籽糖 5.7
8 甘露三糖 9.0
9 水苏糖 4.6
由表3可见，指认的各色谱峰的分离度较好，可以满足指纹图谱检测的要求。
效果实施例2方法学考察
以研究确定的高效液相色谱条件和供试品溶液制备方法，对建立的指纹图谱HPLC-ELSD分析方法学进行考察：精密度、样品的稳定性、方法的重复性。
(1)精密度试验
取一批地黄药材(批号为20150802的地黄)，按照实施例1的方法制备供试品溶液，连续6次进样检测，记录HPLC色谱图。以蔗糖为参照峰，对9个共有峰，分别记录其相对保留时间及相对峰面积，见表4、表5。
表4精密度试验(与蔗糖的相对保留时间)
Figure GDA0001228775920000091
表5精密度试验(与蔗糖的相对LN峰面积比)
Figure GDA0001228775920000092
结果显示：以蔗糖为参照，共有峰的相对保留时间RSD均小于0.2％，相对LN峰面积比值均小于0.6％，说明方法的精密度良好。
(2)稳定性试验
取一批地黄药材(批号为20150802的地黄)，按照实施例1的方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、13、15、24、36h进样检测，记录HPLC图。以蔗糖为参照峰，对9个共有峰，分别记录其相对保留时间及相对LN峰面积比值，见表6、表7。
表6稳定性试验(与蔗糖的相对保留时间)
Figure GDA0001228775920000101
表7稳定性试验(与蔗糖的相对LN峰面积比)
Figure GDA0001228775920000102
结果显示：以蔗糖为参照，36小时内供试品溶液的9个共有色谱峰相对保留时间RSD均小于1.0％，相对LN峰面积比值均小于1.2％，表明供试品溶液在36小时内稳定。
(3)重复性试验
取同批次地黄药材6份(批号为20150802的地黄)，按照实施例1的方法制备供试品溶液，分别进样检测，记录HPLC图。以蔗糖为参照峰，对9个共有峰，分别记录其相对保留时间及相对峰面积，见表8、表9。
表8重复性试验(与梓醇的相对保留时间)
Figure GDA0001228775920000103
Figure GDA0001228775920000111
表9重复性试验(与梓醇的相对峰面积比)
Figure GDA0001228775920000112
结果显示：以蔗糖为参照，共有色谱峰的相对保留时间RSD均小于0.2％，相对LN峰面积比值均小于1.2％，表明方法稳定性好。
效果实施例3地黄药材HPLC-PDA指纹图谱的构建
分别精密称取梓醇、D-果糖、D-无水葡萄糖、半乳糖、蔗糖、棉籽糖、水苏糖对照品适量，照实施例1的方法制备参照物溶液；分别取22批次生地黄药材，照实施例1的方法制备相应的供试品溶液；照实施例1的色谱条件，分别吸取参照物溶液和各供试品溶液进样检测，记录HPLC图。
运用Empower 3导出色谱数据(*.AIA格式文件)，并将其导入国家药典委员会2004年颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价***(A版)”，进行指纹图谱匹配和相似度计算分析。以生地黄140115的HPLC色谱图作为参照谱。进行了对照谱的生成、指纹图谱匹配及相似度计算。
(1)共有峰的确定
由22批次生地黄药材制备的供试品溶液，进样检测分析，其HPLC-ELSD指纹图谱的匹配结果，显示得到9个共有峰。选择以蔗糖为参照峰，各共有峰的相对保留时间见表10。
表10指纹图谱共有峰的相对保留时间
共有峰编号 相对保留时间 共有峰编号 相对保留时间
1 0.557 6 1.274
2 0.709 7 1.447
3 0.789 8 1.808
4 0.844 9 1.971
5 1.000
(2)指纹图谱的相似度分析
相似度是评价中药指纹图谱的一个重要参数，它是根据指纹图谱的整体相似程度来计算中药所含化学组分的整体波动程度。本实验以批号140115地黄药材的HPLC图作为参照谱，对22批次地黄药材进行指纹图谱匹配和相似度计算，具体分析结果见表11。
表11相似度分析结果
Figure GDA0001228775920000121
Figure GDA0001228775920000131
表11的结果是由国家药典委员会2004年颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价***(A版)”软件生成的，试验以批号140115地黄药材的HPLC图作为参照谱(即表格的参照含义)，进行匹配，得到对照谱(即表11中的对照)。
由表11可见，企业提供的不同批次各地黄药材，其HPLC-ELSD指纹图谱相似度较高，均大于0.99，因此，可以作为建立生地黄药材的指纹图谱使用，***生成的生地黄药材对照指纹图谱见图9。
(3)指纹图谱共有峰的指认
取批号20150802生地黄药材的供试品溶液的HPLC图，分别以各参照物溶液的HPLC图进行对比，对指纹图谱中共有峰进行指认，具体见图10、图11。
对9个色谱峰进行了指认，即分别为图9中的峰1(梓醇)、峰2(D-果糖)、峰3(D-无水葡萄糖)、峰4(半乳糖)、峰5(蔗糖)、峰6(蜜二糖)、峰7(棉籽糖)、峰8(甘露三糖)、峰9(水苏糖)。
效果实施例4自购地黄药材的HPLC-ELSD指纹图谱检测分析
企业采购2批次生地黄药材，产地分别为河南、山西；以及自行采购5批次生地黄药材及4批次熟地黄药材，其来源及批号见表12。
表12自购地黄药材来源及批号
Figure GDA0001228775920000132
Figure GDA0001228775920000141
自购生地黄与熟地黄药材的HPLC-ELSD指纹图谱分析：
取以上各批次自购生地黄及熟地黄药材，照实施例1中制备相应的供试品溶液；照实施例1中色谱条件，分别吸取各供试品溶液进样检测，记录HPLC图。
运用Empower 3导出色谱数据(*.AIA格式文件)，并将其导入国家药典委员会2004年颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价***(B版)”，以***已经生成的地黄-R(即22批次研究药材对照)的色谱图作为参照谱，对各批次自购药材进行指纹图谱匹配和相似度计算分析，结果见13。
表13自购不同批次生地黄和熟地黄药材与对照指纹图谱的相似度分析结果
批号 相似度
R 1.000
河南 0.993
山西 0.945
自购生地2016012201 0.975
自购生地2016032305 0.994
自购生地160329 0.998
自购生地160419 0.995
自购生地160426 0.987
熟地2016030805华氏 0.449
熟地2016030805雷允上 0.606
熟地160325 0.385
熟地160413 0.296
结果显示：企业提供的另行购买和研究者自购生地黄的指纹图谱与建立的生地黄HPLC-ELSD对照指纹图谱相似度较高，相似度均大于0.945；而自购所有批次熟地黄与建立的生地黄HPLC-ELSD对照指纹图谱相似度较低，最高仅为0.606，最低为0.296。
结论：地黄经过加工炮制后，所含糖类组分发生较大变化。我们建立的生地黄HPLC-ELSD指纹图谱，可以作为生地黄和熟地黄药材的特征鉴别方法。
效果实施例5
市售5批地黄颗粒指纹相似度检验
为了更好的评价不同批次地黄配方颗粒的相似程度，利用上述建立的HPLC对照指纹图谱进行评价。
按照各批次配方颗粒的标示量，取相当于1g饮片的量的配方颗粒粉末，精密称定。按按附件1确定的供试液制备方法制备各批次地黄、饮片的供试品溶液。按确定的色谱条件，记录色谱图。运用Empower 3将6批样品的HPLC色谱数据导出*.AIA格式文件，并将文件导入国家药典委员会2004年颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价***B版”。色谱图进行多点校正，以地黄-HPLC-R(即22批对照)对照色谱图作为参照谱，进行指纹图谱匹配，见图12，相似度结果见表14。
表14 5批颗粒与药材HPLC标准指纹图谱的相似度比较
Figure GDA0001228775920000151
Figure GDA0001228775920000161
由表14可见，5批颗粒与建立的药材对照指纹图谱的相似度均在0.96以上。说明提供的5批颗粒的样品均一，质量稳定。已经建立的HPLC指纹图谱方法可以作为地黄饮片配方颗粒的研究参考。

Claims (8)

1.一种地黄中糖类成分的同时测定方法，其特征在于，所述测定方法为对供试品溶液进行HPLC-ELSD检测，所述供试品溶液的制备方法包括如下步骤：用水超声提取生地黄或熟地黄5～30分钟过滤，即可；
液相色谱检测的条件如下：色谱柱为Welch Ultimate Hilic-NH2；流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，洗脱梯度如下：
Figure FDA0002933364700000011
柱温为10℃～40℃；
ELSD参数：气体压力25psi～40psi，漂移管温度50℃～80℃；
所述糖类成分包括D-果糖、D-无水葡萄糖、半乳糖、蔗糖、棉籽糖、水苏糖、蜜二糖和甘露三糖。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的超声提取所用的溶剂水为超纯水。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的过滤为使用0.45μm滤膜过滤。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的柱温为20℃。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的气体压力为35.0psi。
6.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的漂移管温度为60.0℃。
7.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法使用蒸发光散射检测器的雾化器冷却模式进行检测。
8.一种地黄指纹图谱的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：采用如权利要求1～7任一项所述的测定方法检测地黄，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价***软件，模拟生成地黄指纹图谱。
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