CN112522234B

CN112522234B - 一种限制性内切酶FseI的制备方法

Info

Publication number: CN112522234B
Application number: CN202011480915.9A
Authority: CN
Inventors: 董娜; 文伟彰
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2040-12-15
Also published as: CN112522234A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种限制性内切酶FseI的制备方法。本发明提供一种重组表达载体，其含有一个或多个拷贝的限制性内切酶FseⅠ的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供含有该重组表达载体的重组大肠杆菌以及利用该重组大肠杆菌制备限制性内切酶FseⅠ的方法。本发明的制备方法能够在较短时间内制备得到高纯度、高活性的FseⅠ限制性内切酶，极大地降低了FseⅠ的制备成本，提高了制备效率。

Description

一种限制性内切酶FseI的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种限制性内切酶FseI的制备方法。

背景技术

限制性核酸内切酶是可以识别特定的脱氧核苷酸序列，对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶，其剪切的位置可以在识别位点内也可以在识别位点外。

1970年Smith等发现细菌体内有可以降解入侵其体内的噬菌体DNA的酶，这种酶被命名为HindⅡ，具有特定的识别和切割位点。研究者们发现切割后的DNA片段可以再次进行连接，并开始意识到这种限制性内切酶是研究生物的重要工具，将会引起生物技术领域的革命性变化。限制性内切酶广泛存在于原核生物中，为了得到更多种类的限制性内切酶，人们展开了对原核生物的测序工作，通过分析基因组，找到了多种可以编码限制性内切酶的基因，越来越多的限制酶被发现并应用。目前人们已经发现几千种限制性内切酶，其中有几百种限制酶已经被商业化应用，限制性内切酶已经成为分子生物学研究的重要工具。美国NEB是最早开始克隆并外源表达限制性内切酶的公司。

限制性内切酶根据结构、辅因子的需求、切位与作用方式，可分为三种类型：Ⅰ型限制性内切酶、Ⅱ型限制性内切、Ⅲ型限制性内切酶。Ⅰ型限制性内切酶数量少，应用范围小，含有三个亚基：限制酶R亚基、识别特异序列S亚基、甲基化酶M亚基，具有修饰酶活性与限制酶活性，可以同时催化宿主DNA的甲基化与非甲基化的DNA的水解，其识别位点非对称，切割位点位于识别位点外1000bp处，需要ATP、Mg²⁺、SAM等辅助因子，例如：EcoB、EcoK。因为其识别位点与切割位点相距很远，不产生确定的DNA片段，因而不具有实用性，几乎不被人们所采用。Ⅱ型限制性内切酶种类多应用广，有两个方向相反的亚基组成同源二聚体，这两个亚基分别作用于DNA互补的两条链，只具有识别切割的作用，不具有修饰酶作用。Ⅱ型限制性内切酶所识别的位置多为短的回文序列，大多数所剪切的碱基序列即为所识别的序列，只需要Mg²⁺一种辅助因子，并且只产生具有黏性末端或者平末端的DNA片段，因此是遗传工程上实用性较高的限制酶种类。例如：BamHⅠ、HindIII。这一类酶是构成商业化限制酶的主要部分。Ⅲ型限制性内切酶种类和应用较少，由两个亚基组成，识别位点为反向重复序列，切割位点位于识别位点下游25-27bp，需要ATP、Mg²⁺等辅助因子。因其不能够完全切割开DNA片段而很少作为商业化酶。

目前使用较多的II型限制性内切酶又分四种子型：IIP，IIS，IIC和IIT。IIP型限制酶只有一个蛋白结构域，具有同时识别序列和在序列内进行切割的能力，是目前被广泛使用的限制酶。

FseⅠ限制酶属于IIP型限制酶，基因序列总共有660bp，蛋白有219个氨基酸，分子量大小约为28kDa，其识别位点是：5’-GGCCGGCC-3’，3’-CCGGCCGG-5’。FseⅠ作为一种IIP限制性内切酶，具有八个碱基识别位点，特异性强，在基因克隆技术中受到很多研究者的青睐。FseⅠ限制酶在pH为7.6的NaCl限制缓冲液或KGB缓冲液中，温度26-28℃的环境下获得最佳酶活性。不仅在分子克隆中，FseⅠ在基因组物理图谱的构建，基因的定位和基因分离，DNA分子碱基序列分析方面也具有重要的应用价值及研究潜力。

在分子生物学时代到来之前，人们想要获得目的蛋白，需要从特定组织或细胞中分离提取，但是这种提取方法复杂低效，且很多目的蛋白没有纯化标签，给后续的分离纯化带来了极大的不便。随着基因工程的出现，目的蛋白高效快速的表达得以实现。基因工程是利用DNA重组技术，在体外对目的基因进行改造和重新组合，构建能够高效表达目的蛋白的重组质粒，将重组质粒导入微生物或真核细胞，使重组质粒在细胞内翻译表达，获得人们所需的目的蛋白。然而，目前商品化FseⅠ因为表达量低、蛋白得率低、分离纯化程序繁琐等原因，导致蛋白的价格偏高，较少生物公司生产此类限制酶。因此，提供一种高表达量、低成本、分离纯化简便的高效制备FseⅠ限制酶的方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组表达载体、重组大肠杆菌，以及一种限制性内切酶FseⅠ的制备方法。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种重组表达载体，其含有一个或多个拷贝的限制性内切酶FseⅠ的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述如SEQ ID NO.1所示的序列为限制性内切酶FseⅠ(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)的编码基因经密码子优化得到。上述经密码子优化的编码序列为本发明经大量人工优化和筛选得到，与经密码子优化软件等常规优化方法得到的序列相比，能够在很好地保证FseⅠ的天然活性结构的同时，显著提高FseⅠ蛋白的表达水平。

优选地，所述载体还含有位于所述编码基因的上游的T5启动子和标签序列，所述启动子用于驱动所述编码基因的转录，所述标签序列与所述编码基因可操作性地连接。本发明发现，采用T5启动子能够与如SEQ ID NO.1所示的限制性内切酶FseⅠ的编码基因很好地配合作用，进一步提高FseⅠ蛋白的表达水平。

其中，所述标签序列优选为6×His标签序列。

根据表达***选择配套的载体更有利于蛋白的高效表达。本发明发现在大肠杆菌Origami系列菌株中，采用pQE-80L作为表达载体，能够更高效地表达FseⅠ限制酶。

优选地，所述重组表达载体的骨架为pQE-80L。

pQE-80L可通过市售购买获得，该载体的大小为4751bp，带有6×His(组氨酸)标签，载体抗性为氨苄抗性。

上述重组表达载体可采用本领域常规技术手段构建得到，例如：将如SEQ ID NO.1所示的序列连接至pQE-80L载体。

优选地，在进行pQE-80L载体与FseⅠ编码基因连接时，不使用FseⅠ酶切位点，而使用SacⅠ与BamHⅠ酶切位点，避免转化时渗漏表达，切割自身质粒所带有的FseⅠ酶切位点。

第二方面，本发明提供一种重组大肠杆菌，其包含所述重组表达载体。

本发明选择原核表达***中的大肠杆菌表达***，其具有周期短、培养条件简单、成本低等特点。

与其他限制酶不同，FseⅠ限制酶含有较多半胱氨酸，形成较多二硫键，而大肠杆菌的细胞质呈现出还原环境，不利于二硫键的形成，增加了表达FseⅠ限制酶的困难。基于此，本发明选择大肠杆菌Origami系列菌株作为表达菌株，Origami系列菌株是K-12细胞衍生而来，在硫氧还蛋白氧化还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)基因上同时含有突变，这使得该菌株能够更加高效的在细胞质内生成二硫键，有助于含二硫键蛋白的活性蛋白形成。

因此，优选地，所述重组大肠杆菌为大肠杆菌Origami系列菌株。使用大肠杆菌Origami系列菌株在可更好地促进FseⅠ限制酶的二硫键形成与氨基酸链的正确折叠，表达出具有高活性的限制酶。而且大肠杆菌Origami基因组不含有FseⅠ限制酶酶切位点，避免了FseⅠ限制酶渗漏表达对菌株自身基因组的切割，使得该菌株对FseⅠ限制酶具有天然免疫作用，不需要再对菌株进行改造。

更优选地，所述重组大肠杆菌为大肠杆菌Origami(DE3)。

第三方面，本发明提供所述重组表达载体或所述重组大肠杆菌在限制性内切酶FseⅠ制备中的应用。

第四方面，本发明提供一种限制性内切酶FseⅠ的制备方法，其包括利用所述重组大肠杆菌表达限制性内切酶FseⅠ的步骤。

具体地，所述表达为添加诱导剂进行诱导表达，

优选地，所述诱导剂为终浓度为0.4-0.6mM的IPTG，所述诱导表达的温度为16-18℃，转速为160-180rpm。

针对本发明所使用的上述表达菌株和表达载体，本发明进一步对表达条件进行优化。表达条件包括诱导温度，诱导转速，诱导剂浓度等，其中，诱导温度可影响蛋白产生的速度，从而影响着蛋白的正确折叠。温度较高时蛋白质因来不及正确折叠而容易形成包涵体，温度低则影响蛋白的产量，但同时低温可以增加可溶性蛋白质的含量。另一方面，IPTG诱导剂一般具有毒性，浓度太高则会影响菌株的生长，诱导剂浓度太低则不足以使基因充分表达。本发明发现，在0.4-0.6mM IPTG存在条件下，于16-18℃，转速为160-180rpm进行诱导表达，有助于得到高活性的FseⅠ。

以上所述的制备方法还包括对表达得到的限制性内切酶FseⅠ进行纯化的步骤，所述纯化包括镍柱亲和层析纯化和离子交换层析纯化。

镍柱亲和层析是一种依据生物大分子与配体可逆的专一性结合的原理，从而专一的分离特异的生物大分子的层析***。Ni NTA Beads 6FF可以与带6×His(组氨酸)标签的目的蛋白质结合，使用低浓度咪唑除去未与Beads结合的杂蛋白，使用高浓度咪唑洗脱下目的蛋白，达到分离纯化FseⅠ限制酶的目的。本发明使用25mM低浓度咪唑除去杂蛋白，使用250mM高浓度咪唑洗脱目的蛋白，可更高效地得到初步纯化的FseⅠ限制酶。

本发明进一步使用离子交换层析纯化***对FseⅠ限制酶进行精细纯化。离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离目的的一种柱层析法。使用离子交换层析纯化的关键在于缓冲液pH的选择，合适的缓冲液有助于目的蛋白与杂蛋白的分离。FseⅠ限制酶的等电点为7.5左右，本发明发现，FseⅠ蛋白在Tris-HCl(pH8.2)缓冲溶液中带负电，使用Q柱阴离子交换层析柱能够有效分离纯化目的蛋白，得到高纯度的FseⅠ限制酶。

优选地，所述镍柱纯化使用的用于洗脱杂蛋白的缓冲液包含如下组分：pH8.2的Tris-HCl 20mM，咪唑25mM；NaCl 150mM；使用的用于洗脱目的蛋白的缓冲液包括如下组分：pH8.2的Tris-HCl 20mM，咪唑250mM，NaCl 150mM。

优选地，所述离子交换层析纯化使用的离子交换柱为Q柱阴离子交换柱，使用的洗脱缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B，所述缓冲液A为20mM Tris-HCl，pH 8.2，所述缓冲液B包括如下组分：pH8.2的Tris-HCl 20mM，NaCl 1M。

通过上述镍柱亲和层析纯化和离子交换层析纯化获得的FseⅠ蛋白的纯度高，且整个纯化过程仅需5-6h，避免了长时间纯化过程导致的酶活性降低，更有利于酶产量和活性的提高。经上述纯化后，FseⅠ能够达到分子生物学实验纯度要求。

具体地，本发明所述的限制性内切酶FseⅠ的制备方法包括如下步骤：

(1)将FseⅠ编码基因(SEQ ID NO.1)克隆到pQE-80L表达载体上，构建出pQE-80L-FseⅠ原核表达质粒。

(2)将步骤(1)构建的表达质粒转化入大肠杆菌Origami感受态细胞中，筛选获得携带pQE-80L-FseⅠ原核表达质粒的大肠杆菌Origami；使用IPTG作为诱导剂，终浓度为0.5mM，将携带pQE-80L-FseⅠ原核表达质粒的大肠杆菌Origami在16℃，180rpm低温诱导表达24h。

(3)收集培养的菌体，对菌体称重，以1:5-1:10的比例用预冷的Lysis Buffer(20mM Tris-HCl，pH8.2；15mM咪唑；150mM NaCl)重悬菌体，使用超声破碎仪破碎细胞；4℃，13,000rpm高速离心1h，收集蛋白上清。

(4)使用0.22μm滤膜过滤上清液，将上清液与Ni NTA Beads 6FF结合孵育1-2h后，加入镍柱纯化柱内，使液体在重力作用下自然流出，此时与Beads结合的目的蛋白留在纯化柱中；使用Wash Buffer(20mM Tris HCl，pH8.2；25mM咪唑；150mM NaCl)冲洗纯化柱5-10个柱体积，除去未与Beads结合的杂蛋白，使用Elution Buffer(20mM Tris-HCl，pH8.2；250mM咪唑；150mM NaCl)冲洗纯化柱洗脱与Beads结合的目的蛋白5-10个柱体积，收集穿出液，结束洗脱。

(5)用超滤管将蛋白溶液浓缩至1-2mL，然后用Buffer A(20mM Tris-HCl，pH8.2)将浓缩后的蛋白溶液稀释，使溶液盐浓度降低至30mM，将稀释后的溶液分装，13,000rpm、4℃离心10min除去杂质与沉淀。

(6)打开AKTA纯化***，运行Pump Wash程序，使用Buffer A(20mM Tris-HCl，pH8.2)、Buffer B(20mM Tris-HCl，pH8.2；1M NaCl)先后冲洗A泵、B泵以及整个***；安装Q柱阴离子交换柱；使用Buffer B高盐冲洗除去交换柱中的杂蛋白，至UV不再波动；使用Buffer A与Buffer B平衡5个柱体积，使层析柱内盐浓度为30mM，与蛋白溶液盐浓度保持一致。

(7)安装5mL上样环，先用5倍体积去离子水冲洗，再用5倍体积Buffer A润洗，将离心后的蛋白样品注入上样环。

(8)以Gradient形式设定洗脱程序为4个阶段：0％Buffer B/100％Buffer A～15％Buffer B/85％Buffer A，5个柱体积；15％Buffer B/85％Buffer A～50％Buffer B/50％Buffer A，15个柱体积；50％Buffer B/50％Buffer A～100％Buffer B/0％Buffer A，5个柱体积；100％Buffer B/0％Buffer A，5个柱体积。收集Fraction，每管1.2mL。

(9)程序运行结束后，根据UV280吸收值的变化，收集UV吸收峰所在的Fractions；使用SDS-PAGE鉴定Fraction收集的每管蛋白纯度。

(10)收集好每管蛋白后，与100％甘油1:1的比例混匀，投入液氮后，放到-80℃保存。

(11)使用含有FseⅠ酶切位点的质粒进行双酶切验证。

本发明的有益效果在于：

本发明通过对限制性内切酶FseⅠ的编码基因进行特异的密码子优化，显著提高了该限制酶的表达水平，进一步通过采用大肠杆菌Origami表达***很好地保证了FseⅠ的高活性表达，实现了FseⅠ的简单高效制备。本发明的制备方法能够在较短时间内制备得到高纯度、高活性的FseⅠ限制性内切酶，极大地降低了FseⅠ的生产成本，增加了产品的竞争力，由此制备的限制性内切酶FseⅠ具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为本发明实施例3中离子交换柱纯化从吸收峰对应的Fractions中每管蛋白吸取20μL进行SDS-PAGE验证，即纯化后的FseⅠ蛋白SDS-PAGE图，其中，M为蛋白Marker，从上至下的条带依次为180kDa、140kDa、100kDa、75kDa、65kDa、45kDa、35kDa、25kDa、15kDa、10kDa，1-6分别为吸收峰对应的Fractions中的每管蛋白。

图2为本发明实施例3中离子交换柱纯化的蛋白吸收峰图。

图3为本发明实施例4中利用FseⅠ限制性内切酶双酶切后得到核酸的凝胶电泳图，其中，M代表DNA Marker，从上到下依次为10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，1-9泳道依次为：0.05μL FseⅠ，0.1μL FseⅠ，0.15μLFseⅠ，0.2μL FseⅠ，0.25μL FseⅠ，0.3μL FseⅠ，0.35μL FseⅠ，0.45μL FseⅠ，0.5μL FseⅠ。

图4为本发明实施例5中FseⅠ限制性内切酶的星号活性检测结果，其中，M代表DNAmarker，从上到下依次为10000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，1-9泳道依次为0.05μL FseⅠ，0.1μL FseⅠ，0.15μL FseⅠ，0.2μL FseⅠ，0.25μLFseⅠ，0.3μL FseⅠ，0.35μL FseⅠ，0.45μL FseⅠ，0.5μL FseⅠ。

图5为本发明实施例6中酶切-连接-再酶切的检测结果，1-3依次为DNA Marker、连接产物、再次酶切产物。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的试剂的配方具体如下：

LB液体培养基：5L水中加入胰蛋白胨50g，酵母提取物25g和氯化钠50g，高压灭菌。

LB固体培养基：5L水中加入胰蛋白胨50g，酵母提取物25g和氯化钠50g，琼脂75g，高压灭菌。

2×YT液体培养基：5L水中加入胰蛋白胨80g，酵母提取物50g和氯化钠25g，高压灭菌。

2×YT固体培养基：5L水中加入胰蛋白胨80g，酵母提取物50g和氯化钠25g，琼脂75g，高压灭菌。

1％琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖倒入锥形瓶中，加入100mL TAE溶液，微波炉中加热2min使其完全溶解，加入10μL溴化乙锭(EB)，混匀后倒入插好梳子的胶板中，室温放置20min，待其完全凝固。

1M Tris-HCl(pH8.2)：800mL水中加入121.14gTris碱，待Tris碱完全溶解后，使用稀盐酸将其pH调至8.2，定容至1L，过滤除菌后4℃保存。

2M咪唑：1L水中加入136.1546g咪唑，完全溶解后过滤除菌，4℃保存。

5M氯化钠：1L水中加入292.2g氯化钠，完全溶解后过滤除菌，4℃保存。

Inoue转化缓冲液：MnCl₂·4H₂O称取10.88g，CaCl₂·2H₂O称取2.2g，KCl称取18.65g，0.5M PIPES(PH6.7)吸取20mL，定容至1L。

实施例1 pQE-80L-FseⅠ原核表达质粒的构建

将密码子优化后的FseⅠ基因克隆到含6×His(组氨酸)标签的pQE-80L载体上，构建pQE-80L-FseⅠ原核表达质粒，具体方法如下：

1、FseⅠ基因的合成

为实现FseⅠ的高效表达，本发明首先根据大肠杆菌的密码子偏好性对FseⅠ的编码基因进行密码子优化。在密码子优化过程中，本发明发现，采用常规的密码子优化软件或简单遵循大肠杆菌表达***的密码子的偏好性进行FseⅠ的密码子优化，得到的FseⅠ蛋白的表达水平和纯度并不能满足该酶的大量制备，而且，密码子优化位置和优化程度与表达水平之间并无明显的规律，不同程度的密码子优化得到的编码序列的表达水平差异较大。经筛选，最终确定经密码子优化后的FseⅠ的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。

根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成。

2、酶切与连接反应

使用限制性核酸内切酶SacⅠ与BamHⅠ对FseⅠ基因进行双酶切反应，37℃酶切反应2h，酶切反应后回收酶切好的基因片段。

同时使用限制性核酸内切酶SacⅠ与BamHⅠ对pQE-80L载体进行双酶切，37℃酶切反应4h，酶切反应后对切好的载体进行回收。

使用T4 DNA连接酶连接双酶切后的FseⅠ基因与pQE-80L载体，连接条件为室温连接2h。

3、连接产物的转化

(1)取冻存于-80℃的大肠杆菌DH5α感受态细胞置于冰上10min，向DH5α感受态细胞悬液中加入10μL连接产物，轻弹混匀，冰浴静置30min；

(2)将EP管置于42℃水浴中热激90s，然后快速转入冰浴环境2～3min；

(3)向EP管中加入500μL 2×YT培养基，混匀后置于37℃摇床培养45min；

(4)培养结束后，6000rpm离心30s，弃去500μL上清液，使用剩下的100μL培养液重悬菌体；

(5)用涂板珠将混匀后的菌液均匀涂在含氨苄青霉素(100μg/mL)的2×YT固体培养皿上，将培养皿倒置放于37℃培养箱中过夜培养。

4、质粒的小量提取

(1)挑取阳性单菌落接种于含有氨苄抗性的5mL的2×YT液体培养基中，37℃，220rpm摇床过夜培养。

(2)取4mL新鲜菌液，分两次加到2mL离心管中，13,000rpm室温离心30s收集细菌，弃去上清。

(3)使用250μL Buffer P1重悬菌体沉淀。

(4)加入250μL Buffer P2，轻轻翻转使菌体充***解，室温放置5min。

(5)加入250μL Buffer E3，快速翻转8-10次，室温放置5min后，13,000rpm转速室温离心5min，弃掉沉淀。

(6)将上清全部倒入过滤柱中，13,000rpm离心1min，收集滤液，向滤液中加入225μL异丙醇。

(7)混匀后将其转入平衡好的吸附柱中，13,000rpm离心1min，弃掉滤液。

(8)向吸附柱中加入750μL PW溶液，13,000rpm离心1min，弃去滤液后再空离一次。

(9)再次弃去滤液并将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，并向吸附柱中央滴加65℃预热的50μL无菌水，室温静置2min，13,000rpm离心2min，收集DNA溶液，-20℃保存。

(10)进行DNA测序，测序结果与质粒模板的DNA序列进行比对分析，保存正确质粒，为转入大肠杆菌Origami感受态细胞做准备。

实施例2 FseⅠ限制性内切酶的表达

1、大肠杆菌Origami感受态细胞的制备

(1)挑取预存Origami菌种划线于空LB固体培养基，37℃培养过夜；

(2)挑取单克隆菌落于25mL空培养基中，37℃培养12h以上，至OD₆₀₀＞1.5；

(3)超净台内取3mL菌液于300mL空LB培养基中(1:100),18℃(200rpm)振摇至OD₆₀₀为0.55左右；

(4)冰浴10min菌液，同时预冷Inoue转化缓冲液；

(5)4℃，4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，在吸水纸上倒置2min，吸干残余液体，用80mL Inoue转化缓冲液重悬菌液；

(6)4℃，4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，在吸水纸上倒置2min，吸干残余液体，用20mL Inoue转化缓冲液重悬菌液；

(7)每管加入1.5mL DMSO，轻轻来回混匀，置于冰上10min后转入50mL离心管冰浴；

(8)将冰浴的感受态细胞每管100μL分装到事先灭菌后并放到4℃的EP管中，投入液氮罐里，最后冻到-80℃。

2、pQE-80L-FseⅠ原核表达质粒的转化

(1)Origami感受态细胞在冰上解冻，加入0.2μL重组质粒，用手指轻弹混匀，冰浴30min；

(2)42℃水浴热激90s，冰浴2min；

(3)每管加入500μL LB培养基；

(4)37℃振荡(220rpm)培养45min；

(5)6000rpm离心30s，弃去500μL上清，重悬菌体，均匀铺在氨苄2×YT培养基上；

(6)在37℃恒温培养箱倒置培养12-16h。

3、FseⅠ限制性内切酶的诱导表达

(1)配置5mL 2×YT培养基，100mL LB培养基，800mL LB培养基，加入氨苄抗生素，使培养基氨苄抗生素终浓度为100μg/mL，混匀；

(2)取出转化好的LB培养皿，挑取多克隆接入5mL 2×YT培养基(100μg/mL氨苄抗生素)，放入摇床，37℃(220rpm)振荡培养过夜；

(3)按照1:100的比例转接振荡培养过夜后的菌液至新的100mL LB培养基中(100μg/mL氨苄抗生素)，37℃(220rpm)振荡培养至OD600 nm＞1.5；

(4)按照1:100的比例转接振荡培养过夜后的菌液至新的800mL LB培养基中(100μg/mL氨苄抗生素)，37℃(220rpm)振荡培养4-6h至OD600 nm为0.7左右；

(5)将培养瓶放入冰水混合物中预冷15分钟左右，加入IPTG诱导剂，使IPTG终浓度为0.5mM，16℃(180rpm)诱导24h。

4、菌体的超声处理

(1)将培养24h的菌液收集到收菌瓶中，4000rpm，4℃离心20min-30min，弃上清液；

(2)对菌体称重，以1:5-1:10的比例用预冷的Lysis Buffer(20mM Tris-HCl，pH8.2；15mM咪唑；150mM NaCl)重悬菌体，倒入100mL的烧杯中，将烧杯半埋在冰水混合物中，保持低温；

(3)打开超声波细胞破碎仪，以转接1.6L LB培养基诱导FseⅠ限制酶表达为例，参照设置超声功率为300w，超声时间25-30min，温度上限4℃，超声2s，停5s；超声时始终保持烧杯半埋在冰水混合物中；

(4)超声破碎后，将裂解液13,000rpm，4℃离心1h；

(5)收集上清，弃去沉淀。

实施例3 FseⅠ限制性内切酶的纯化

1、蛋白过镍柱纯化

(1)使用0.22μm滤膜过滤上清液；

(2)将上清液与Beads在4℃结合孵育1-2h，此时FseⅠ蛋白与Beads结合；

(3)将上清液加入纯化柱内，使液体在重力作用下自然流出，与Beads结合的目的蛋白留在纯化柱中，始终保持纯化柱在层析柜中，保持低温环境；

(4)使用Wash Buffer(20mM Tris-HCl，pH8.2；25mM咪唑；150mM NaCl)冲洗纯化柱5-10个柱体积，除去未与Beads结合的杂蛋白，使用快染试剂实时检测蛋白，直到快染试剂不再变蓝，即可判断已经没有杂蛋白被洗脱下来；

(5)使用EIution Buffer(20mM Tris-HCl，pH8.2；250mM咪唑；150mM NaCl)冲洗纯化柱，洗脱与Beads结合的目的蛋白5-10个柱体积，收集穿出液，使用快染试剂实时检测蛋白，直到快染试剂不再变蓝，即可判断已经没有目的蛋白被洗脱下来，结束洗脱。

2、蛋白离子交换柱纯化

(1)样品准备：用50mL超滤管将蛋白溶液浓缩至1-2mL，然后用Buffer A(20mMTris-HCl，pH8.2)将浓缩后的蛋白溶液稀释，使溶液盐浓度降低至30mM，将稀释后的溶液分装至1.5mL EP管，13,000rpm，4℃离心10min除去杂质与沉淀。

(2)离子交换准备：打开AKTA纯化***，运行Pump Wash程序，使用Buffer A，Buffer B(20mM Tris-HCl，pH8.2；1M NaCl)先后冲洗A泵、B泵以及整个***。安装Q柱阴离子交换柱。使用Buffer B高盐冲洗除去交换柱中的杂蛋白，至UV不再波动。使用Buffer A与Buffer B平衡5个柱体积，使层析柱内盐浓度为30mM。

(3)上样:安装5mL上样环，先用5倍体积去离子水冲洗，再用5倍体积Buffer A润洗，将离心后的蛋白样品注入上样环。

(4)运行离子交换洗脱程序：以Gradient形式设定洗脱程序为4个阶段：0％BufferB/100％Buffer A～15％Buffer B/85％Buffer A，5个柱体积；15％Buffer B/85％BufferA～50％Buffer B/50％Buffer A，15个柱体积；50％Buffer B/50％Buffer A～100％Buffer B/0％Buffer A，5个柱体积；100％Buffer B/0％Buffer A，5个柱体积。峰图的电导显示洗脱目的蛋白所需NaCl浓度为250mM左右。收集Fraction每管1.2mL，将收集的蛋白进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示，结果表明，纯化得到的FseⅠ限制性内切酶具有较高的纯度。离子交换柱纯化的蛋白吸收峰图如图2所示。

(5)清洗离子交换柱：用5倍柱体积的Buffer A与Buffer B先后冲洗柱子，最后用去离子水冲洗柱子和整个***。卸下离子交换柱，保存在4℃。

(6)程序运行结束后，根据UV280吸收值的变化，收集吸收峰所在Factions。经过SDS-PAGE鉴定Fraction收集的每管蛋白纯度与蛋白浓度。

(7)收集好每管蛋白后，与100％甘油1:1的比例混匀，投入液氮后，放到-80℃保存。

实施例4 FseⅠ限制性内切酶的活性鉴定

对实施例3中制备的限制性内切酶FseⅠ进行活性鉴定。使用含有FseⅠ与AscⅠ的酶切位点的质粒进行双酶切验证，酶切体系为10μL，其中含有500μg质粒，载体与基因的大小分别为10000bp与4500bp，酶切时间为15min，AscⅠ使用量为0.2μL。分别加入0.05μL FseⅠ，0.1μL FseⅠ，0.15μL FseⅠ，0.2μL FseⅠ，0.25μL FseⅠ，0.3μL FseⅠ，0.35μL FseⅠ，0.45μLFseⅠ，0.5μL FseⅠ限制酶。

结果显示(图3)，使用0.05μL本发明实施例3制备的FseⅠ限制性内切酶在10μL双酶切体系中酶切15min能够完全切开500μg含有FseⅠ酶切位点的质粒。

将实施例3中收集到的样品，用NanoDrop在280nm处测定蛋白浓度，结果为0.210mg/ml。根据内切酶酶活定义，37℃下，在20μL反应体系中，1μL酶能够在15min内完全消化1μgλDNA。结合图3可知，纯化获得的限制性内切酶FseI具有较高的酶切活力，比活力约为47619.04U/mg。

实施例5 FseⅠ限制性内切酶的星号活性检测

对实施例3纯化得到的FseⅠ进行星号活性检测，具体方法如下：

使用含有FseⅠ和AscⅠ的酶切位点的质粒进行双酶切验证，酶切体系为10μL，其中含有500μg质粒，载体与基因的大小分别为10000bp与4500bp，酶切时间为8h，AscⅠ的使用量为0.2μL。分别加入0.05μL FseⅠ，0.1μL FseⅠ，0.15μL FseⅠ，0.2μL FseⅠ，0.25μL FseⅠ，0.3μL FseⅠ，0.35μL FseⅠ，0.45μL FseⅠ，0.5μL FseⅠ限制酶。

结果如图4所示，结果显示，使用本发明实施例3制备的FseⅠ限制性内切酶在10μL双酶切体系中酶切8h能够完全切开500μg含有FseⅠ酶切位点的质粒，无星号活性。

实施例6 酶切-连接-再酶切检测

对实施例3纯化得到的FseⅠ进行酶切-连接-再酶切检测，具体方法如下：

使用50μl体系酶切载体，在37℃温育15min获得酶切片段，将酶切片段用T4 DNA连接酶连接，回收连接产物，如图5显示，第一泳道为Marker，第二泳道为连接产物，第三道泳道为再次酶切产物，所得连接产物超过95％可以被限制性内切酶FseI再次切开，再酶切结果中无杂带、无拖尾，表明实施例3所纯化的FseI完全达到了限制性内切酶的分子生物学实验要求。

综上所述，本发明构建了pQE-80L-FseⅠ表达质粒，并转化入Origami大肠杆菌菌株进行诱导培养，收集诱导培养后的菌体，通过超声裂解得到含有目的蛋白的裂解液。利用镍柱亲和层析柱对所述裂解液进行初步纯化，得到含有目的蛋白的洗脱液，洗脱液中杂蛋白大量减少。然后进行离子交换层析纯化，对含有目的蛋白的洗脱液进行精细纯化，最终得到高纯度的限制性内切酶FseⅠ。本发明的制备方法操作高效，成本低，获得的限制性内切酶纯度高，能够满足分子生物学实验对限制性内切酶FseⅠ的纯度要求。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种限制性内切酶FseI的制备方法

<130> KHP201118593.0

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaccgacg agttgtttcc tatcccggag ccattggtca gaccagtcat cgcactcccc 60

cctcatctga aggaattgat cgatctactc ccattgaata cgccggtaca tcgccgagat 120

ctcgaagcga agtatgggcg ctccaactat gctagacgca tacgaaagat tatcagtgaa 180

tacggttggg aaatcgagag tcgccgccag tcggaaggcg ccaatgacga ttggtacatc 240

cgtcggtccg acggccccgt gcgaccgcag cgtattagac gggaggtacc aagacgcagc 300

cgcgagaccg tctacagacg tgacgactgg atctgccaga tttgtcggat gaaaaccgac 360

ccggagcgtg gatctctcgt tccgcagtgc gatcacaaga ttccggcgga ccgcggaggg 420

gattctgatg aagaaaatct tcagacgctt tgcacgcgtt gcaatctcaa gaagaggcag 480

gcctgcggtg gatgcgctct ggccagctgt gcggattgtc catttgcgta tccagaaaag 540

tttgatgatg tgctgattct gcacctcgac agggagcacc ttaagaggat tatgaccacg 600

gcatacgctc gaaatgtcac ggccagtgca gtcgtcagcg acctatccga cctgctctag 660

<210> 2

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Asp Glu Leu Phe Pro Ile Pro Glu Pro Leu Val Arg Pro Val

1 5 10 15

Ile Ala Leu Pro Pro His Leu Lys Glu Leu Ile Asp Leu Leu Pro Leu

20 25 30

Asn Thr Pro Val His Arg Arg Asp Leu Glu Ala Lys Tyr Gly Arg Ser

35 40 45

Asn Tyr Ala Arg Arg Ile Arg Lys Ile Ile Ser Glu Tyr Gly Trp Glu

50 55 60

Ile Glu Ser Arg Arg Gln Ser Glu Gly Ala Asn Asp Asp Trp Tyr Ile

65 70 75 80

Arg Arg Ser Asp Gly Pro Val Arg Pro Gln Arg Ile Arg Arg Glu Val

85 90 95

Pro Arg Arg Ser Arg Glu Thr Val Tyr Arg Arg Asp Asp Trp Ile Cys

100 105 110

Gln Ile Cys Arg Met Lys Thr Asp Pro Glu Arg Gly Ser Leu Val Pro

115 120 125

Gln Cys Asp His Lys Ile Pro Ala Asp Arg Gly Gly Asp Ser Asp Glu

130 135 140

Glu Asn Leu Gln Thr Leu Cys Thr Arg Cys Asn Leu Lys Lys Arg Gln

145 150 155 160

Ala Cys Gly Gly Cys Ala Leu Ala Ser Cys Ala Asp Cys Pro Phe Ala

165 170 175

Tyr Pro Glu Lys Phe Asp Asp Val Leu Ile Leu His Leu Asp Arg Glu

180 185 190

His Leu Lys Arg Ile Met Thr Thr Ala Tyr Ala Arg Asn Val Thr Ala

195 200 205

Ser Ala Val Val Ser Asp Leu Ser Asp Leu Leu

210 215

Claims

1.一种限制性内切酶FseⅠ的制备方法，其特征在于，包括利用重组大肠杆菌表达限制性内切酶FseⅠ的步骤；

所述重组大肠杆菌为大肠杆菌Origami（DE3）菌株，含有重组表达载体；

所述重组表达载体含有一个拷贝的限制性内切酶FseⅠ的编码基因，还含有位于所述编码基因的上游的T5启动子和6×His标签序列，所述启动子用于驱动所述编码基因的转录，所述标签序列与所述编码基因可操作性地连接；所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述载体的骨架为pQE-80L；

所述表达为添加诱导剂进行诱导表达；

所述诱导剂为终浓度为0.4-0.6mM的IPTG；

所述诱导表达的温度为16-18℃，转速为160-180rpm；

所述制备方法还包括对表达得到的限制性内切酶FseⅠ进行纯化的步骤，所述纯化包括镍柱亲和层析纯化和离子交换层析纯化；

所述镍柱纯化使用的用于洗脱杂蛋白的缓冲液包含如下组分：pH8.2 的Tris-HCl20mM，咪唑25mM；NaCl 150mM；用于洗脱目的蛋白的缓冲液包括如下组分：pH8.2的Tris-HCl20mM，咪唑250mM，NaCl 150mM；

所述离子交换层析纯化使用的离子交换柱为Q柱阴离子交换柱，

使用的洗脱缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B；所述缓冲液A为20mM Tris-HCl，pH 8.2，所述缓冲液B包括如下组分：pH8.2的Tris-HCl 20mM，NaCl 1M。