CN117964708A - 一种内含肽及其突变体的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，特别是蛋白表达纯化技术领域。本发明提供了一种内含肽，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明提供的内含肽及其突变体可缩短其与目标蛋白融合后的体外剪切时间，并提高其剪切效率、同时降低胞内剪切，提高目标多肽的回收效率。

Description

一种内含肽及其突变体的应用

技术领域

本发明属于蛋白表达纯化技术领域，尤其属于融合表达标签去除技术领域。

背景技术

利用微生物或者动物细胞进行蛋白表达是目前生物合成异源蛋白的主要方法，为了方便提高目的蛋白表达量以及方便后续目的蛋白的纯化，通常目的蛋白会与标签蛋白融合表达。纯化后得到的融合蛋白是目的蛋白和标签蛋白的复合体，为了得到目的蛋白还需利用蛋白酶对标签蛋白进行去除，这些蛋白酶包括凝血酶、凝血因子、肠激酶、烟草蚀刻病毒蛋白酶以及Sumo蛋白酶等，然而，对融合蛋白进行酶切纯化大大提高了生产成本，不利于商业化的大规模生产。此外，除了肠激酶、Sumo蛋白酶等少量蛋白酶，其他蛋白酶对标签蛋白切割后，仍然会残留一个或多个氨基酸残基，无法满足高纯度蛋白生产的要求。因此，构建一个可无痕剪切的、不依赖蛋白酶的蛋白纯化方法将有利于目的蛋白的大规模生产。

内含肽(inteins)是蛋白质序列中的一段***序列，可以催化两端多肽的剪接，由内含肽介导的序列重排称作蛋白剪接，也是一种翻译后修饰。内含肽广泛应用于蛋白质纯化领域。通过内含肽的自我剪切活性，将内含肽N端或C端的首位氨基酸突变为丙氨酸，沉默一端的剪切活性即可获得一端剪切活性的内含肽，在硫醇试剂或者pH条件诱导下，完成目的蛋白与内含肽的切割，进而获得去除标签的目的蛋白。应用于蛋白纯化的内含肽包括两种形式：连续内含肽和断裂内含肽。两种内含肽均有广泛的应用，然而，两个内含肽在生产过程中也有各自面临的问题。连续内含肽在目的蛋白表达过程中，胞内自剪切率高，造成蛋白产量的损失；断裂内含肽将内含肽的N端和C端分别和标签蛋白以及目的蛋白融合表达，利用内含肽N端和C端的亲和性，实现目的蛋白的纯化并在体外发生剪切，该方法避免了胞内自剪切的现象，但在分段表达过程中，融合蛋白容易出现错误折叠以包涵体形式表达，还需要对融合蛋白进行复性，降低了蛋白生产效率。此外，这两种内含肽有一个共同的缺点，需要引入几个氨基酸残基保证剪切效率。

gp41-1是目前已知剪切活性最高，C端剪切速度最快的内含肽(37℃，5min)，但剪切后目的蛋白会带有几个残留的gp41-1的天然外显肽的5个氨基酸残基，去除后剪切效率显著降低(Carvajal-Vallejos，2012)。

许多研究人员通过对内含肽进行人工改造，将内含肽广泛应用于蛋白纯化过程中。Volkmann(2009)等通过点突变技术，人工改造了Synethocystis sp的剪切内含肽DnaB，使其只具备一端的切割能力，实现了标签蛋白与目的蛋白的分离，切割效率可达到95％以上，但切割时间高达40～50min。Wood(1999)等将迷你内含肽MtuRecA N端的第一个案件天冬酰胺突变为丙氨酸，C端422位点上的天冬氨酸突变为甘氨酸，抑制了N端剪切的同时，保持了C端切割的效率。Miguel Ramirez(2013)团队同样通过氨基酸突变，获得了具有C端高切割活性的内含肽，16min内即可完成切割，随后该团队利用该内含肽构建了蛋白快速分离纯化的方法。

因此，构建一种具有低自剪切率的，高剪切效率的，可无痕剪切的内含肽可以提高目的蛋白的商业化生产前景。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种内含肽，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

在本发明具体实施例中，还提供了一种内含肽突变体，将所述的内含肽的107位的天冬氨酸突变为甘氨酸。

在本发明具体实施例中，还提供一种内含肽突变体，将所述的内含肽的123位的苏氨酸突变为组氨酸。

在本发明具体实施例中，还提供一种内含肽突变体，将所述的内含肽的107位的天冬氨酸突变为甘氨酸和123位的苏氨酸突变为丙氨酸。

本发明提供了所述的内含肽或内含肽突变体在蛋白剪切和纯化中的应用。

进一步地，所述蛋白为GFP蛋白。

本发明最后提供了所述的内含肽突变体在药用多肽剪切和纯化中的应用。

进一步地，所述药用多肽为特立帕肽。

本发明提供的内含肽及其突变体可缩短其与目标蛋白融合后的体外剪切时间，并提高其剪切效率、同时降低胞内剪切，提高目标多肽的回收效率。

附图说明

图1为gp41-1及其变体与GFP融合表达在不同诱导温度下融合表达的自剪切率图。

其中，A为gp41-1及其变体不同温度诱导表达下的SDS-PAGE，1-4分别代表gp41-1,TAgp41-1,DGgp41-1和DGTAgp41-1；B为不同诱导温度下gp41-1及其变体自剪切率变化趋势。

图2为gp41-1及其变体与GFP融合表达经DTT诱导的剪切效率图。

其中，A为gp41-1及其变体在37℃、20mMDTT条件下诱导剪切后的SDS-PAGE，1-6代表剪切0h，3h，6h，9h，12h和24h。B为gp41-1及其变体随剪切时间延长剪切效率的变化趋势。

图3为不同首位氨基酸的GFP对gp41-1及其变体自剪切率和剪切效率的影响

图4为T123H和T123S突变体与SerGFP融合表达后的胞内自剪切率和剪切效率图。

其中，A为胞内自剪切率，B为剪切效率。

图5为gp41-1与药用多肽融合表达剪切的SDS-PAGE

图6为gp41-1与双亲分子18A和GFP融合表达剪切的SDS-PAGE，1泳道为细胞裂解液沉淀，2-5分别为剪切3h，6h，9h，12h后上清，6泳道为剪切后沉淀。

具体实施方式

在本文中，术语“变体”是指与亲本相比具有一个或多个的氨基酸或核苷酸突变的多肽或多核苷酸。

在本文中，术语“生物学活性”实体是指与天然内含肽gp41-1相比相似或升高的C端剪切效率的实体。

在本文中，术语“氨基酸”指含有氨基基团和羧基基团的有机化合物。在本发明中，涉及的氨基酸为天然氨基酸，包括丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。天然氨基酸残基缩写如表1所示：

表1.天然氨基酸残基缩写

在本文中，术语“多肽”表示通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。

在本文中，术语“宿主细胞”或“底盘细胞”指接收、复制和表达载体的细胞，宿主细胞可以用来表达本发明的融合蛋白，宿主细胞既可以是原核细胞也可以是真核细胞。本发明中所使用的宿主细胞是埃希氏菌属细胞，更优选为大肠杆菌(Escherichia coli)，在具体实施的案例中，使用的是大肠杆菌BL21(DE)细胞。

在本文中，术语“纯化标签”是指利用其自身的性质对目的分子进行纯化的分子。现已开发出多种不同类型的纯化标签，包括亲和标签、沉淀标签以及复合型标签，这些标签与目的分子融合表达，可以使目的分子通过不同的方法被选择性地捕获和/或纯化，例如，亲和标签利用可与其特异性结合的亲和树脂实现捕获和/或纯化(如His标签、MBP标签等)；沉淀标签利用自身可聚集型或者诱导可聚集型通过离心实现捕获和/或纯化等等(如ELP标签、18A标签)。许多标签除纯化功还具有促进可溶表达的功能。

在本发明中，用于构建的表达载体来自于商购的pET28a(+)(Novagen)。

另一方面，本发明涉及一种宿主细胞，包含前述的连续的多核苷酸或重组载体，在一个实施方案中，重组载体转化进入宿主细胞(DH5α或BL21)，并在宿主细胞(BL21)中表达融合蛋白。

在本文中，术语“转化”是指将包含本发明中所述融合蛋白的重组载体转入宿主细胞，本领域技术人员熟知将外源多核苷酸片段或重组载体转入宿主细胞的方法，包括化学转化法，电转化法，脂质体转染法等。本发明通过化学转化法将多核苷酸片段或重组载体转入宿主细胞。

在本文中，术语“表达”是指通过多核苷酸的转录和翻译产生蛋白的过程。

实施例1

1.gp41-1及其变体与GFP蛋白融合表达载体构建

1.1目的片段获取

从NCBI中获得gp41-1的氨基酸序列，内含肽gp41-1-C1A的多核苷酸序列由生工(上海)公司进行大肠杆菌密码子优化后合成，并将其***pUC18质粒。目的蛋白绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)载体由本实验室保存。

所述内含肽gp41-1-C1A氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示,核苷酸序列如序列表SEQ ID No.7所示。所述内含肽gp41-1-C1A是将分段的断裂型内含肽gp41-1的N段88氨基酸(SEQ ID No.2)和C段37氨基酸(SEQ ID No.3)，连接成联系的具有125个氨基酸的内含肽，首位氨基酸半光氨酸(Cys，C)突变为丙氨酸(Ala，A)。

所述gp41-1(D107G)突变体是所述内含肽gp41-1-C1A的107位的天冬氨酸(Asp，D)突变为甘氨酸(Gly，G)，得到突变体DGgp41-1，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示，优化后的核苷酸如序列表SEQ ID No.8所示。所述突变体DG gp41-1提高了其与目标蛋白融合后的体外及胞内剪切效率，提高目标多肽的回收效率。

所述gp41-1(T123 H)突变体是所述内含肽gp41-1-C1A的123位的苏氨酸(Thr，T)突变为组氨酸(His，H)，得到突变体THgp41-1，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.5所示，优化后的核苷酸如序列表SEQ ID No.9所示。所述突变体THgp41-1可缩短其与目标蛋白融合后的体外剪切时间，并提高其剪切效率、同时降低胞内剪切，提高目标多肽的回收效率。

所述gp41-1(D107G,T123A)是所述内含肽gp41-1-C1A的107位和123位氨基酸进行复合突变，即将107位的天冬氨酸(Asp，D)突变为甘氨酸(Gly，G)、123位的苏氨酸(Thr，T)突变为丙氨酸(Ala，A)，得到突变体DGTAgp41-1，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示，优化后的核苷酸如序列表SEQ ID No.10所示。所述突变体DGTA gp41-1可提高其与目标蛋白融合后的体外剪切率，而胞内剪切效率不变，提高目标多肽的回收效率。

所述gp41-1(D107G)变体、gp41-1(T123A)变体及gp41-1(D107G,T123A)变体-GFP通过overlap PCR获得。

通过Primer 7设计并合成了如表2所示的引物，分别用28a-gp41-1F和gp41-1R、GFP F和28a-GFPR两对引物分别从载体上扩增gp41-1以及GFP，PCR反应体系及反应程序如表3所示，反应完成后，用1％的琼脂糖凝胶电泳法分析PCR产物，结果表明PCR扩增出与目的大小相符的条带。

按照Omega胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，将gp41-1和GFP的胶回收产物按比例混合后，用28a-gp41-1F和28a-GFPR引物进行二次PCR扩增，用以上相同方法对PCR产物进行回收，-20℃保存备用；同样的，用28a-gp41-1F和D107Ggp41-1R以及28a-gp41-1F和T123Agp41-1R两对引物从pUC18-gp41-1上扩增获得D107G和T123A突变体，再以突变体为模版获得D107G&T123A双突变体，再通过overlap PCR与GFP相连，以获得gp41-1及其变体与GFP的融合片段。

表2本实施方案中所用到的引物

表3扩增内含肽gp41-1和GFP基因的PCR体系及反应程序

1.2重组表达载体构建

用限制性内切酶BamHI和XhoI对pET28a载体进行双酶切，37℃剪切2小时后，用上述相同的方法对载体骨架进行回收。用一步法快速克隆试剂盒将2.1获得的gp41-1和GFP的胶回收产物和pET28a载体骨架相连，随后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，将细胞涂布于具有卡那霉素的LB平板上(50μg/mL)筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒并测序。将测序正确的阳性克隆质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，选取阳性克隆细胞用于后续蛋白表达实验。

实施例2

gp41-1及其变体与GFP蛋白融合表达胞内自剪切率验证

将实施例1中获得的阳性单克隆菌液接种于含有5ml含Kan⁺的LB液体培养基的试管中，培养至待菌液OD₆₀₀值达到0.6时加入终浓度0.2mM的IPTG,再分别于180rpm、37℃摇床诱导培养4-6h，180rpm、30℃诱导培养8-10h，180rpm、16℃摇床中诱导培养24h。每组三次重复，培养结束后，8,000rpm，5min收集菌体，加入2mL Binding buffer(100mM NaCl，10mMTris base，HCL调节pH至8.0)重悬菌体，使用超声破碎仪于低温条件下破碎细胞，工作程序设置为60W,超声每工作3s停1s，总破碎时间2min。12000rpm于4℃离心20min收集上清。取20μL上清蛋白与上样缓冲液(5x)混合，100℃处理10min，SDS-PAGE后经考马斯亮蓝染色并洗脱后，拍照。使用ImageJ软件对蛋白胶图进行灰度分析，具体设置如下，图片格式设置为8-bit，设置参数为Mean grey value、Min&Max grey value以及Integrated density，去除杂背景后，对蛋白胶图进行灰度分析。图1所示，其中A所示为gp41-1及其变体与GFP融合蛋白在不同温度诱导下自剪切SDS-PAGE，B为不同诱导温度下gp41-1及其变体自剪切率变化趋势。

表4为gp41-1及其变体在不同诱导温度下的自剪切率

自剪切率由计算公式：目的蛋白灰度值/(目的蛋白+融合蛋白)灰度值。

gp41-1及其变体自剪切率随着诱导温度下降而降低，其中T123A变体在所有诱导温度下均具有最低的自剪切率，分别只有29.94％，22.70％和16.72％；D107G变体的自剪切率明显提高，达到了50.87％，43.34％和32.27％；DGTA双突变体则具有和gp41-1相近的自剪切率，分别为36.50％，28.89％和21.63％。综上所述，胞内自剪切率T123Agp41-1<gp41-1<DGTAgp41-1<D107Ggp41-1。

实施例3

gp41-1及其变体与GFP蛋白融合表达gp41-1无痕剪切效率验证

3.1gp41-1及其变体与GFP融合蛋白诱导表达纯化

培养实施例1中获得的阳性单克隆菌落种子液，并按照以下步骤进行融合蛋白表达和纯化：

(1)将种子液以1:1000(v/v)比例接种到5mL含Kan⁺的LB液体培养基中，于37℃、180rpm摇床中进行扩大培养。再将菌液以1:1000(v/v)比例接种到300mL含Kan⁺的LB培养基中，摇床中扩大培养至待菌液OD₆₀₀值达到0.6时加入终浓度0.2mM的IPTG,再于180rpm、16℃摇床中诱导培养24h。

(2)使用250mL收菌罐以8,000rpm离心5min多次反复收集诱导后的菌液(每次收集不超过罐体积的2/3)，加入30mL Binding buffer重悬菌体。将上述菌悬液转移至新的50mL离心管中，使用超声破碎仪于低温条件下破碎细胞，工作程序设置为300W,超声每工作3s停1s，总破碎时间30min。

(3)12000rpm于4℃离心20min，取上清过0.22μm滤膜。

(4)使用灭菌蒸馏水及Binding buffer各3个柱体积冲洗镍柱，将过滤后的待纯化蛋白溶液温和缓慢地加入镍柱中，重复多次上样。

(5)用含不同咪唑浓度的Elution buffer(100mM NaCl，10mM Tris base，500mM咪唑，HCL调节pH至8.0)清洗镍柱，分别收集洗脱样品，收集的蛋白保存于-20℃冰箱备用。

(6)用含500mM咪唑的Elution buffer除去镍柱中的残余蛋白，并加入大量灭菌蒸馏水冲洗镍柱，最后将镍柱填料保存于20％(v/v)乙醇中。

3.2目的蛋白诱导剪切

取500μL蛋白，在20mM DTT，37℃条件下诱导剪切0h、3h、6h、9h、12h以及24h，每个时间点取20μL剪切蛋白与上样缓冲液(5x)混合，100℃处理10min后，置于-20℃冰箱备用。

3.3考马斯亮蓝显色及灰度分析

将样品加入提前制备的1.0mm蛋白胶上样孔中，电泳直至样品到达蛋白胶底部；取出蛋白凝胶于考马斯亮蓝染色液中40min；将染色充分的蛋白凝胶浸入脱色液(8％冰乙酸、25％乙醇)中反复清洗脱色；对脱色后的蛋白凝胶拍照，留图。

用ImageJ软件对蛋白胶图进行灰度分析，具体设置如下，图片格式设置为8-bit，设置参数为Mean grey value、Min&Max grey value以及Integrated density，去除杂背景后，对蛋白胶图进行灰度分析。

3.4剪切效率分析

本发明以融合蛋白复合体随时间剪切变化量作为剪切效率的计算依据。使用Prism 9对数据进行分析。如图2所示，gp41-1及其变体剪切效率，其中，A为剪切不同时间的SDS-PAGE，B为剪切效率变化趋势。

gp41-1及其变体展现出不同的剪切活性，DG突变体具有最高的剪切活性，剪切24h可达到80％以上的剪切效率，其他变体则低于60％。其中DGTA双突变体剪切效率略高于gp41-1(分别为60％和55％)，而TA突变体的剪切效率最低(<40％)。

表5gp41-1及其变体与GFP融合后剪切效率

综上所述，本实施例中获得的D107Ggp41-1变体在任意剪切时间均具有最高的C端剪切效率。

实施例4

不同首位氨基酸对gp41-1及其变体剪切效率的验证

本实施例所用的引物如表4所示，与实施例2相同的实验步骤获得不同首位氨基酸的GFP蛋白与gp41-1及其变体的融合蛋白表达载体。

用实施例3和实施例4的步骤对融合蛋白进行自剪切和剪切效率的比较分析。

表6本实施方案中所用到的引物

如图3所示，gp41-1及其变体与四个不同首位氨基酸融合表达的自剪切和剪切效率。

不同首位氨基酸对gp41-1及其变体的剪切活性的影响。

首先选择了非极性氨基酸Met、极性氨基酸His、极性不带电氨基酸Cys和天然残基Ser进行研究。首先关注的是自剪切率。如图所示，第一残基显著影响自剪切率，His-GFP自剪切率高于Met-GFP、Cys-GFP和Ser-GFP。如上所述，T123A突变体的自剪切率最低。

当第一个残基是疏水性的(Met)时，自剪切很低。极性不带电氨基酸(Ser,Cys)自剪切率较高。而极性带电氨基酸的自剪切率最高，尤其是D117G突变体，在37℃诱导表达时自剪切率超过75％，在16℃诱导蛋白时自剪切率也超过50％。与自剪切率的结果相符，剪切效率也呈现了相同的趋势，Met为首位氨基酸的剪切效率随着剪切时间的增加逐渐上升(gp：55％，DG：80％，TA：34％，DGTA：61％)，极性氨基酸为首位氨基酸时，DG和DGTA突变体在剪切9h即可以达到70％以上，His为首位氨基酸时，3h即达到70％以上。极性氨基酸为首位氨基酸时，DG和DGTA突变体表现出更高的剪切活性。

表7gp41-1及其变体与不同首位氨基酸的GFP融合的剪切效率

将Thr123位点突变位其他极性氨基酸，发现T123H突变体具有极高的剪切活性和较低的胞内自剪切率(图4)，具有较高的应用价值。

构建了以其他氨基酸为首位氨基酸的GFP与gp41-1和DGgp41-1的融合表达载体，剪切效率如表5所示，整体上来看，极性氨基酸在DG突变体中具有更高的剪切效率(除了Lys和Arg)，极性负电荷氨基酸在gp41-1中几乎没有剪切发生，在DG突变体中发生快速剪切。非极性氨基酸的在gp41-1和DG突变体中均不高，且增加幅度较为舒缓。本实施例结果表明，gp41-1及其变体的剪切活性会受到所融合的目的蛋白性质的影响。

所述绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列如序列表SEQ ID No.11所示，核苷酸序列如序列表SEQ ID No.12所示。

本发明中所提及的剪切效率均为近似值。本发明提供了gp41-1的3个变体，DG突变体具有最高的剪切效率和自剪切率，极性氨基酸(His)为目的蛋白首位氨基酸时，自剪切率显著提高，而DGTA双突变体在一定程度上综合了两个单突变体的优点，自剪切率与天然内含肽相当，却保有更高的剪切效率，TH突变体则兼顾了高剪切效率和较低的胞内自剪切率。可根据实际需要选择不同的内含肽突变体。

表8不同首位氨基酸的GFP与gp41-1和DGgp41-1融合表达剪切效率

实施例5

内含肽gp41-1的应用

本方案设计引物如表7所示，18A标签由生工合成。所述标签蛋白18A氨基酸序列如序列表SEQ ID No.13所示，核苷酸序列如序列表SEQ ID No.14所示。

本实施例通过引入沉淀标签，验证了gp41-1变体在蛋白纯化后，标签去除中的应用。此外，还将药用多肽与gp41-1的变体融合表达，验证了gp41-1在多肽分子纯化剪切中的应用。

实验方案与前述步骤一致。

表9本实施方案中所用到的引物

如图5为药用多肽与gp41-1变体融合表达纯化剪切SDS-PAGE。特立帕肽的首位氨基酸是Ser，具有较高的剪切效率，与GFP结果相反的是，DGTA突变体具有比DG突变体更高的剪切效率，而DG突变体的自剪切率更低，在与GFP融合表达具有极高剪切效率的TH突变体，与特立帕肽融合表达后，剪切效率最低。综上所述，D107Ggp41-1突变体与特立帕肽融合表达具有最好的应用价值。所述特立帕肽氨基酸序列如序列表SEQ ID No.15所示，核苷酸序列如序列表SEQ ID No.16所示。

如图6为gp41-1与18A标签和GFP融合表达剪切SDS-PAGE。将活性聚集标签18A与gp41-1-GFP融合表达，融合蛋白主要表达在沉淀中，用缓冲液将沉淀重悬，加入40mM DTT诱导剪切，不同剪切时间收集上清用于SDS-PAGE检测。结果表明，GFP随着剪切时间延长逐渐在上清中累积，gp41-1可以应用于蛋白纯化后的标签蛋白去除。

表10 gp41-1变体与特立帕肽融合后的剪切效率

	6h	9h	24h	自剪切率
					DGgp41-1	17.89％	31.22％	52.73％	35.47％
THgp41-1	18.59％	22.85％	38.37％	49.44％
					DGTAgp41-1	40.12％	70.00％	72.15％	61.06％

Claims (8)

1.一种内含肽，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.内含肽突变体，其特征在于，将权利要求1所述的一种内含肽的107位的天冬氨酸突变为甘氨酸。

3.内含肽突变体，其特征在于，将权利要求1所述的一种内含肽的123位的苏氨酸突变为组氨酸。

4.内含肽突变体，其特征在于，将权利要求1所述的一种内含肽的107位的天冬氨酸突变为甘氨酸和123位的苏氨酸突变为丙氨酸。

5.权利要求书1至4中任一权利要求所述的一种内含肽或内含肽突变体在蛋白剪切和纯化中的应用。

6.依据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述蛋白为GFP蛋白。

7.权利要求2所述的内含肽突变体在药用多肽剪切和纯化中的应用。

8.依据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药用多肽为特立帕肽。