CN110438104A - 一种限制性内切酶MnlI及其表达纯化方法 - Google Patents

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CN110438104A CN201910804225.5A CN201910804225A CN110438104A CN 110438104 A CN110438104 A CN 110438104A CN 201910804225 A CN201910804225 A CN 201910804225A CN 110438104 A CN110438104 A CN 110438104A
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Abstract

本发明提供了一种限制性内切酶MnlI及其表达纯化方法，所述方法包括以下步骤：构建限制性内切酶MnlI重组表达载体，转化甲基化感受态细胞，得限制性内切酶MnlI重组菌株，诱导培养，裂解菌体，纯化回收产物，即得限制性内切酶MnlI。表达纯化方式操作简单，快速，收率高，纯化出的限制性内切酶MnlI纯度高。

Description

一种限制性内切酶MnlI及其表达纯化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种限制性内切酶MnlI及其表达纯化方法。
背景技术
在生物体内有一类能将外来的DNA切断的酶，它能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自身的DNA却无损害作用，这样就可以起到保护细胞原有的遗传信息的作用。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。其发现促使DNA重组技术的诞生从而极大推动现代分子生物学和基因工程的发展，是当代基因工程研究不可或缺的基础工具。
由于细菌体内存在“限制-修饰”现象，即自身的DNA被甲基化酶修饰，从而避免所产生的限制性内切酶对自身DNA片段的切割，达到抵御外来噬菌体侵染的目的。因此在原核表达体系中单一的重组表达限制性内切酶，会使宿主因DNA被切割而死亡。而甲基转移酶在识别序列上的特异性修饰可防止限制性内切酶的切割。限制-修饰基因常紧密连锁，细菌通过调控两者的表达，使自身DNA首先受到甲基化保护,保护完成后再表达限制性内切酶，而入侵的异源DNA并没有受到保护因而被限制性内切酶降解。即胞内相关的甲基转移酶对与其配对限制性内切酶识别的相同特定序列进行甲基化修饰，并使修饰的DNA具有抵抗其限制性内切酶的切割的特性，保护宿主DNA而降解未被甲基化的外源DNA。
随着限制修饰现象被发现，科学家Werner Arben，Daniel Nathans和HamiltonSmith发现了限制性内切酶，阐明了限制性内切酶在分子基因问题上的作用，之后，越来越多的限制性内切酶被发现、提纯并获得应用。关于限制性内切酶的研究,多年来着重于它们作为工具酶的实用价值,包括新酶的发现与筛选、高产工程菌株的构建、酶纯化技术与程序的优化改进等。其中MnlI是一种应用较为广泛的限制性内切酶，可识别四个碱基的核酸序列(5’CCTCNNNNNN^’)，不仅可作为普通的限制性内切酶应用于分子克隆，在生物领域的其他方向也具有重要的应用价值及研究潜力。
CN101225396A公开了一种生产限制性内切酶的方法，所述方法包括以下步骤：将与所述限制性内切酶相对的甲基化酶基因克隆到pEEB载体的上游；在甲基化酶的保护下，将限制性内切酶基因克隆至同一载体强启动子下游的多克隆位点中；转化表达宿主菌；筛选稳定、可诱导、高表达的限制性内切酶的菌株。
CN106755002A公开了一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，所述的甲基化酶是M.CviPI；所述的限制性内切酶C选自：AatI，AscI，BanII，BglI，BmtI，BspQI，BsrDI，BssHII，BtsI，EagI，HindIII，KasI，MluI，NheI，NotI，NruI，NsiI，PstI，PvuII，SacI，SapI，SbfI，SfiI，SphI。该发明方法重组工程菌的构建过程中直接使用广谱保护型甲基化酶M.CviPI，无需针对单个限制性内切酶进行繁琐的甲基化酶基因筛选，应用范围广泛，简化了重组表达过程。
但由于表达量低、分离纯化程序繁琐、蛋白得率低等问题，目前市售的MnlI限制性内切酶不仅价格高，而且也限制了它的广泛应用及深入研究。同时，以上提及的一系列问题也限制了其他很多应用广泛的限制性内切酶的深入研究。
因此，提供一种表达量高、分离纯化程序简便、蛋白得率高的制备限制性内切酶MnlI的方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种限制性内切酶MnlI及其表达纯化方法，表达纯化方式操作简单，快速，收率高，所得蛋白纯度高，SDS-PAGE电泳无杂带，其纯度在95％以上。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种限制性内切酶MnlI的表达纯化方法，所述方法包括以下步骤：构建限制性内切酶MnlI重组表达载体，转化甲基化感受态细胞，得限制性内切酶MnlI重组菌株，诱导培养，裂解菌体，纯化回收产物，即得限制性内切酶MnlI。
优选地，所述限制性内切酶MnlI重组表达载体的构建方法包括将限制性内切酶MnlI基因片段连接pBAD质粒，得到限制性内切酶MnlI重组表达载体pBAD-R.MnlI。
优选地，所述限制性内切酶MnlI基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述SEQ ID NO.1的氨基酸序列具体如下：
MDFNNFLNKATLNALLVAFANAKPITKPFIGFVIESSYKNSAYSPIELTDDIYQQNNQLLSQFTNLDFQLNGKKHQFFIQSDLSCDDFFALVYKNILIKGSTIDNDEFSKLILLSFFALRGSPDFKLNFYSLDLPRQIVSKNYLDNLFKLSTNVSDLRQLNLNFRELQEQFITGENERNTQFRINLRYFYDNFSDDLAKINLFKSNILKHNANLIKTKNIAQESRTFIERLNFYRDNVLNQTKTQHEIEQLRKNLGFIYDDTIDEKTTRNQGIVQYVRAYFPDECACCKNQYNIKDRSFTYRHSDRYYLEVHHVISFASDRTLDQIDNLVKVCPTCHRALSKNRADEQYQKELISEILINAPKAKEFCLNFTDENDCIQFIYDRLR.
优选地，所述甲基化感受态细胞的制备方法包括以下步骤：筛选MnlI甲基转移酶基因片段，连接表达载体pACYC184，得到甲基转移酶重组表达载体pACYC184-M.MnlI并转化大肠杆菌ER2566，得到甲基化感受态细胞[pACYC184-M.MnlI，ER2566]。
优选地，所述诱导培养的诱导剂包括***糖。
优选地，所述诱导剂的终浓度为0.1-0.3％，例如可以是0.1％、0.15％、0.2％、0.25％或0.3％，优选为0.2％。
优选地，所述培养的条件为25-30℃，180-220rpm，培养15-20h，进一步优选为30℃，200rpm，培养16h。
优选地，所述裂解菌体包括以下步骤：诱导培养后收集菌体，用裂解缓冲液重悬菌体，得重悬液，对重悬液进行低温超高压破碎，得裂解液，离心得粗产品。
优选地，所述裂解缓冲液包括终浓度为5mmol/L～15mmol/L的Tris-Hcl、0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT、5％的甘油和150mmol/L～250mmol/L的Nacl。
优选地，所述裂解缓冲液与菌体的体积质量比(2-10):1mL/g，例如可以是2:1mL/g、3:1mL/g、4:1mL/g、5:1mL/g、6:1mL/g、7:1mL/g、8:1mL/g、9:1mL/g或10:1mL/g，优选为10mL/g。
优选地，所述低温为4-6℃。
优选地，所述超高压为70-90MPa，优选为80MPa。
优选地，所述离心的条件为30000-35000×g，4℃，25-30min，取上清，优选为35000×g，4℃，30min。
优选地，所述纯化包括以下步骤：将裂解菌体得到的粗产品依次经过肝素亲和层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析纯化，得限制性内切酶MnlI。
优选地，所述阳离子交换缓冲液包括终浓度为5mmol/L～15mmol/L的KH2PO4、0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT、5％的甘油和40mmol/L～80mmol/L的Nacl。
优选地，所述阴离子交换缓冲液包括终浓度为5mmol/L～15mmol/L的Tris-Hcl、0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT、5％的甘油和40mmol/L～80mmol/L的Nacl。
优选地，还包括限制性内切酶MnlI的酶活检测，具体包括以下步骤：对经纯化后得到的限制性内切酶MnlI进行梯度稀释后，在1×FlashOneTMBuffer缓冲条件下、20μl反应体系中，与底物λDNA在37℃温育15min，然后以1％琼脂糖凝胶电泳检测底物的酶切情况。
本发明中限制性内切酶MnlI的表达纯化操作流程见图1，S110为限制性内切酶MnlI的表达筛选，具体包括：将测序正确的重组表达质粒pBAD-R.MnlI转化至筛选好的甲基化感受态细胞[pACYC184-M.MnlI，ER2566]，涂布于含氨苄青霉素和氯霉素抗生素的平板上筛选37℃培养12-16h，获得限制性内切酶MnlI的重组表达菌株。对获得的MnlI重组表达菌株进行单克隆筛选，挑选单克隆菌株至单独的LB培养基中，37℃，200rpm培养至OD6000.8。以***糖诱导，加入诱导剂***糖至终浓度0.2％，并在25℃摇床以200rpm培养16h。收集1.5ml诱导好的菌液至2mlEP管中，15000×g离心，弃上清取沉淀，加入200μlB-PER(赛默飞世尔)，裂解15min，离心，取上清，该上清为MnlI的粗酶液。对提取的粗酶液进行粗酶活检测：在1XFlashOneTMBuffer缓冲条件下、20μl反应体系中，与底物λDNA在37℃温育15min，然后以1％琼脂糖凝胶电泳检测底物的酶切情况；限制性内切酶MnlII的酶活定义为：37℃下，在20μl反应体系中，1μl能够在15min内完全消化1μgλDNA。
S120为对筛选得到的限制性内切酶MnlI重组菌株进行大量诱导培养，并收集诱导培养后的菌体，具体包括以下步骤：按比例1:10000～15000的比例将重组工程菌接种到含有氨苄青霉素和氯酶青霉素抗性的固体培养基平板上，35℃～38℃的条件下培养12h-16h。抗性根据重组工程菌内含有的抗性位点进行选择。在本实施方式中含有抗性的培养基为含有氨苄青霉素和氯酶青霉素抗性的LB培养基，通过抗性筛选培养以确定培养出的重组工程菌的正确性。然后按照1ml1个单菌落的比例将复苏后的重组工程菌加入到LB培养液中，在35℃～38℃的条件下培养2h-6h，得到OD600在0.7～0.9活化液。经过复苏和扩增后，得到的活化菌液中重组工程菌的生长活力较好。向得到的活化液中加入体积比为0.1％～0.3％的***糖，在25℃～30℃条件下培养，低于扩增培养重组工程菌的温度。研究过程中发现，诱导培养的温度较低，适宜限制性内切酶MnlI的表达，提高表达效率。具体地，以上复苏，扩增以及诱导培养过程中，均在转速为150rpm～250rpm。诱导培养后的菌液，收集至收菌瓶中两两配平，4℃，5000×g，5min离心进行固液分离，收集固体物，得到菌体。
S130为裂解菌体，得裂解液，具体包括以下步骤：诱导表达后，得到的菌体中表达了大量的限制性内切酶MnlI(目的的蛋白)，通过对菌体裂解，将目的蛋白释放出来。用裂解缓冲液重悬所述菌体，得到重悬液，其中所述裂解缓冲液中含有终浓度为5mmol/L～15mmol/L的Tris-Hcl、终浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT和终浓度为150mmol/L～250mmol/L的Nacl，5％甘油，所述裂解缓冲液与菌体比例为10:1。裂解缓冲液的pH值约为7.5，向菌体中加入裂解液，涡旋5～15min以使菌体重悬。低温高压破碎菌体，破碎压力为60～90MPa；破碎程度为使菌液不再粘稠、流动性良好为准。破菌后的混合液在30000×g～35000×g离心20min～40min，收集上清，得到裂解液。
S140为裂解通过肝素亲和层析柱纯化，裂解液中的目的蛋白结合在Heparin亲和层析柱上面，具体包括以下步骤：将裂解液结合到平衡好的肝素亲和层析柱上，先用3～5倍柱床体积结合缓冲液冲洗。再用浓度梯度的Nacl缓冲液对Heparin亲和层析柱进行线性梯度洗脱。出现蛋白峰时收集洗脱液，对收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳，通过对SDS-PAGE电泳胶图的分析判断目的蛋白峰的位置，收集含有目的蛋白的洗脱液1。其中，平衡Heparin亲和层析柱的缓冲液成分为：5mmol/L～15mmol/L的Tris-Hcl、终浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT和终浓度为30mmol/L～60mmol/L的Nacl，5％甘油，平衡缓冲液的pH值为7.5；Nacl缓冲液成分为5mmol/L～15mmol/L的Tris-Hcl、终浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT和终浓度为900mmol/L～1000mmol/L的Nacl，5％Glycerol，pH值约为7.5。
S150为将洗脱液1依次进行阳离子交换层析和阴离子交换层析，对洗脱液精细纯化，得高纯度目的蛋白MnlI，具体包括以下步骤：将S140收集的洗脱液1稀释后进行阳离子交换层析。将稀释后的洗脱液1结合到平衡好的阳离子交换层析柱上，先用3～5倍柱床体积结合缓冲液漂洗未结合的杂蛋白，再用浓度梯度的Nacl缓冲液对阳离子交换层析柱进行线性梯度洗脱。出现蛋白峰时收集洗脱液，对收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳，通过对SDS-PAGE电泳胶图的分析判断目的蛋白峰的位置，收集含有目的蛋白的洗脱液2。其中，平衡阳离子交换层析柱的缓冲液成分为，5mmol/L～15mmol/L的KH2PO4、终浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT和终浓度为30mmol/L～60mmol/L的Nacl，5％Glycerol，pH值为6.0。高浓度Nacl缓冲液成分为5mmol/L～15mmol/L的KH2PO4、终浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT和终浓度为900mmol/L～1000mmol/L的Nacl，5％Glycerol。pH值约为6.0。
将得到的洗脱液2稀释后加入到平衡好的阳离子交换层析柱中，洗脱液2中的目的蛋白结合在阳离子交换层析柱上面，然后先用3～5倍柱床体积结合缓冲液漂洗未结合的杂蛋白。再用浓度梯度的Nacl缓冲液对阳离子交换层析柱进行线性梯度洗脱。出现蛋白峰时收集洗脱液，对收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳，通过对SDS-PAGE电泳胶图的分析判断目的蛋白峰的位置，收集含有目的蛋白的洗脱液3。其中，平衡阴离子交换层析柱的缓冲液成分为，5mmol/L～15mmol/L的Tris-Hcl、终浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT和终浓度为30mmol/L～60mmol/L的Nacl，5％Glycerol，pH值7.5。高浓度Nacl缓冲液成分为5mmol/L～15mmol/L的Tris-Hcl、终浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT和终浓度为900mmol/L～1000mmol/L的Nacl，5％Glycerol。pH值约为7.5。
得到的洗脱液3进行缓冲液置换，将置换后的蛋白液保存于-20℃条件下。具体地，置换的缓冲液成分包含5mmol/L～15mmol/L的Tris-Hcl、终浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT和终浓度为250mmol/L～350mmol/L的Nacl，50％Glycerol。pH值约为7.5。
具体地，将洗脱液3加入到透析袋中，放置于置换缓冲液中，在4℃缓慢搅拌12～16h。取出保存在-20℃条件下。
需要说明的是，实际应用中，表达纯化限制性内切酶MnlI时，不局限于S110-S150的顺序。本领域技术人员可以根据需要进行调整。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述表达纯化方法制备得到的限制性内切酶MnlI。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的限制性内切酶MnlI的表达方法操作简单，快速，成本低，收率高，表达获得目的蛋白表达量高，可溶性好，便于后期纯化。
(2)本发明的限制性内切酶MnlI的纯化方法仅采用3步纯化，操作简单，快速，成本低，收率高，纯化后获得的目的蛋白活性高可达到80U/μl，蛋白纯度高可达到95％以上纯度。
(3)本发明的限制性内切酶MnlI的纯化方法第一步采用Heparin进行捕获，利用Heparin的亲和性质进行结合大量捕获目的蛋白并分离杂蛋白，利于后续纯化，该方式可应用于大部分的无标签限制性内切酶的纯化。
(4)本发明的限制性内切酶MnlI采用阳离子交换和阴离子交换连用的方式进行纯化，利用不同的基质性质分离蛋白，可以达到更好的分离效果，该方式可应用于大部分的中性蛋白的纯化。
(5)本发明的限制性内切酶MnlI的表达纯化方式操作简单，快速，成本低，得率高，可应用于限制性内切酶MnlI的大批量生产。
附图说明
图1为限制性内切酶MnlI的表达纯化方法的流程图；
图2为实施例1限制性内切酶MnlI表达菌株筛选图，其中第1泳道为蛋白Marker，第2泳道为裂解液上清，第3泳道为裂解液沉淀，第4泳道为Heparin亲和层析目的蛋白洗脱液，第5泳道为阳离子交换目的蛋白洗脱液，第6泳道为阴离子交换目的蛋白洗脱液；
图3为限制性内切酶MnlI纯化的过程中各阶段的样品的SDS-PAGE电泳结果对比图，其中第1泳道为λDNA，第2泳道为对标品(NEB)酶切图，第3-20泳道MnlI表达筛选单克隆1-18酶切图，第21泳道为Marker；
图4为限制性内切酶MnlI活力检测电泳图，其中泳道1是λDNA，泳道2是对标品(NEB公司生产的MnlI)，泳道3-10为分别是将MnlI原液稀释10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍、1280倍的特异性酶切图，最终活力定为80U/μl。
具体实施方式
为使本发明的上述目的，特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实验材料
1)菌株与质粒
B-PER购自赛默飞世尔科技有限公司(ThermoFisherScientific)；
pBAD、pACYC184、pUC19购自淼灵生物质粒平台；
酶活检测底物λDNA购自赛默飞世尔科技有限公司(ThermoFisherScientific)；
2)仪器与试剂
低温超高压连续流细胞破碎仪：购自永联生物科技股份有限公司；
蛋白分子量标准：PAGE-MASTERProteinStandardPlus购自金斯瑞生物科技有限公司；
限制性内切酶MnlI对标品购自NewEnglandBiolabs(NEB)；
10×FlashOneTMBuffer购自莫纳生物科技有限公司。
实施例1
(1)筛选含有MnlI片段的重组工程菌
将测序正确的重组表达质粒pBAD-R.MnlI转化至筛选好的甲基化感受态细胞[pACYC184-M.MnlI，ER2566]，涂布于含氨苄青霉素和氯霉素抗生素的平板上筛选培养，获得限制性内切酶MnlI的重组表达菌株；该菌株经扩大培养后，以***糖诱导，获得限制性内切酶MnlI的重组蛋白，粗酶提取，进行酶切验证，以λDNA为底物，NEB公司生产的限制性内切酶MnlI为对照，对阳性克隆分别进行酶切实验，结果见图2，筛选得到酶活最优的单克隆菌株，并保存。
图2中，第1泳道为λDNA；第2泳道为对标品(NEB)酶切图；第3-20泳道MnlI表达筛选单克隆1-18酶切图；第21泳道为Mark。由图2可知，所挑选单克隆菌株均具有MnlI的酶切活力，通过与对照组比照，最终挑选酶切活力最好的16号单克隆菌株进行保种。
(2)菌种的活化表达
取1μl上述重组工程菌在15ml含氨苄青霉素和氯酶青霉素的固体培养基上进行4区划线。在37℃恒温培养箱中培养12～16h。将培养好的重组菌株按照1ml1个单菌落的比例转接到新鲜的LB液体培养基中。37℃，200rpm震荡培养5h，得到OD600为0.5的活化液；将活化好的菌种按1:50的比例转接到新鲜的LB液体培养集中。37℃，200rpm震荡6h，加入终浓度0.2％***糖，然后在30℃，200rpm条件下进行诱导培养16h，离心收集菌体。
(3)纯化限制性内切酶MnlI
将冻存的菌体置于室温解冻，用150ml裂解缓冲液(10mmol/LTris-Hcl，pH7.5，0.1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，50mmol Nacl)重悬菌体，得到重悬液。通过低温高压破碎(80MPa，2.5min)裂解菌体。然后在35000×g条件下离心30min，收集上清，获得150ml裂解液。
a)肝素亲和层析
将裂解液加入到用裂解缓冲液平衡好的Heparin亲和层析柱上，用3倍柱床体积的裂解缓冲液冲洗去未结合的杂蛋白。然后用浓度梯度的Nacl缓冲溶液进行线性梯度洗脱得到含有目的蛋白的洗脱液，收集样品Nacl浓度为200～300mmol/L。上样前用裂解缓冲液平衡层析柱至UV280达到基线，电导，pH稳定。上Heparin亲和层析柱时，上样流速为1cm/min，洗脱流速为2cm/min，上样量为每ml基质上样菌体蛋白50mg，上柱过程中温度维持在4℃。此步纯化目的在于捕获目的蛋白。
b)阳离子交换层析
收集的Heparin洗脱液用阳离子交换进行中度纯化。先用3倍柱床体积的NaOH清洗阳离子交换层析柱，***和管路，用NaOH清洗以确保蛋白接触部位无菌。上样前用阳离子交换低盐缓冲液(10mmol/L KH2PO4，pH7.5，0.1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，50mmol Nacl)对层析柱进行平衡3倍柱床体积,至UV280达到基线，电导，pH稳定即可。1cm/min上样，上样后用3倍柱床体积的阳离子交换低盐缓冲液冲洗去未结合的杂蛋白。然后用浓度梯度的Nacl缓冲溶液2cm/min进行线性梯度洗脱得到含有目的蛋白的洗脱液，收集样品Nacl浓度为100～200mmol/L。收集容器及期间取样仪器均需经过灭菌处理。上柱过程中温度维持在4℃。该步纯化得到较高纯度目的蛋白。
c)阴离子交换层析
将收集的阳离子交换洗脱液用小粒径阴离子交换层析柱进行精细纯化。先用3倍柱床体积的NaOH清洗阴离子交换层析柱，***和管路，用NaOH清洗以确保蛋白接触部位无菌。上样前用阴离子交换低盐缓冲液(10mmol/LTris-Hcl、pH7.5，0.1mmol/L EDTA、1mmol/L的DTT、50mmol Nacl)对层析柱进行平衡3倍柱床体积，至UV280达到基线，电导，pH稳定即可。1cm/min上样，上样后用3倍柱床体积的阳离子交换低盐缓冲液冲洗去未结合的杂蛋白。然后用浓度梯度的Nacl缓冲溶液2cm/min进行线性梯度洗脱得到含有目的蛋白的洗脱液，收集样品Nacl浓度为100～200mmol/L。收集容器及期间取样仪器均需经过灭菌处理。上柱过程中温度维持在4℃。该步纯化得到的蛋白纯度高，透析至Storage buffer(10mmol/LTris-Hcl pH7.4、1mmol/L DTT、0.1mmol/L EDTA、300mmol/L Nacl)保存在-20℃条件下。
纯化限制性内切酶MnlI的过程中各阶段的样品的SDS-PAGE分析
通过对裂解液上清、沉淀、肝素亲和层析目的蛋白洗脱液、阳离子交换层析目的蛋白洗脱液和阴离子交换层析目的蛋白洗脱液的SDS-PAGE分析，把控纯化过程各阶段样品的质量，结果见图3，其中第1泳道：蛋白Marker；第2泳道：裂解液上清；第3泳道：裂解液沉淀；第4泳道：Heparin亲和层析目的蛋白洗脱液；第5泳道：阳离子交换目的蛋白洗脱液；第6泳道：阴离子交换目的蛋白洗脱液，蛋白Marker的分子量从上到下依次为120KD、80KD、60KD、50KD、40KD、30KD、20KD和10KD。。
从图3可以看出，裂解液经过Heparin亲和层析大量富集目的蛋白；阳离子交换中度纯化，大量去除杂蛋白；阴离子交换精细纯化，提高蛋白纯度；最终得到高纯度目的蛋白，通过Gel-Pro analyzer4条带分析软件对图3中第6泳道进行分析，所得蛋白纯度大于95％。
纯化后限制性内切酶MnlI酶活测定
限制性内切酶MnlI的酶活定义为：37℃下，在20μl反应体系中，1μl能够在15min内完全消化1μgλDNA。本发明对经纯化后得到的限制性内切酶MnlI进行梯度稀释后，在1×FlashOneTMBuffer(莫纳生物科技有限公司)缓冲条件下、20μl反应体系中，与底物λDNA在37℃温育15min，然后以1％琼脂糖凝胶电泳检测底物的酶切情况(图4)。图4中泳道1是λDNA；泳道2是对标品(NEB公司生产的MnlI)；泳道3-10为分别是将MnlI原液进行不同梯度稀释的特异性酶切图，最终活力定为80U/μl，具体的，3：原液稀释10倍；4：原液稀释20倍；5：原液稀释40倍；6：原液稀释80倍；7：原液稀释160倍；8：原液稀释320倍；9：原液稀释640倍；10：原液稀释1280倍。
由图4可知，纯化获得的限制性内切酶MnlI具有良好的酶切活力，比活力约为66666.6U/mg的诱导菌液。
综上所述，通过对含有限制性内切酶MnlI表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集诱导培养后的菌体。然后菌体裂解，得到含有目的蛋白(限制性内切酶MnlI)的裂解液。利用Heparin亲和层析柱对所述裂解液进行初步纯化。得到含有目的蛋白(MnlI)的洗脱液，洗脱液中杂蛋白大量减少，体积较少，减小后续纯化的上样时间。然后依次进行阳离子交换和阴离子交换层析对含有目的蛋白的洗脱液进行精细纯化，最终得到高纯度的限制性内切酶MnlI。这种表达纯化方式操作简单，快速，成本低，收率高，表达纯化获得的限制性内切酶纯度高，满足市场上对限制性内切酶的纯度要求。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 莫纳（武汉）生物科技有限公司
<120> 一种限制性内切酶MnlI及其表达纯化方法
<130> 20190816
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 386
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Met Asp Phe Asn Asn Phe Leu Asn Lys Ala Thr Leu Asn Ala Leu Leu
1 5 10 15
Val Ala Phe Ala Asn Ala Lys Pro Ile Thr Lys Pro Phe Ile Gly Phe
20 25 30
Val Ile Glu Ser Ser Tyr Lys Asn Ser Ala Tyr Ser Pro Ile Glu Leu
35 40 45
Thr Asp Asp Ile Tyr Gln Gln Asn Asn Gln Leu Leu Ser Gln Phe Thr
50 55 60
Asn Leu Asp Phe Gln Leu Asn Gly Lys Lys His Gln Phe Phe Ile Gln
65 70 75 80
Ser Asp Leu Ser Cys Asp Asp Phe Phe Ala Leu Val Tyr Lys Asn Ile
85 90 95
Leu Ile Lys Gly Ser Thr Ile Asp Asn Asp Glu Phe Ser Lys Leu Ile
100 105 110
Leu Leu Ser Phe Phe Ala Leu Arg Gly Ser Pro Asp Phe Lys Leu Asn
115 120 125
Phe Tyr Ser Leu Asp Leu Pro Arg Gln Ile Val Ser Lys Asn Tyr Leu
130 135 140
Asp Asn Leu Phe Lys Leu Ser Thr Asn Val Ser Asp Leu Arg Gln Leu
145 150 155 160
Asn Leu Asn Phe Arg Glu Leu Gln Glu Gln Phe Ile Thr Gly Glu Asn
165 170 175
Glu Arg Asn Thr Gln Phe Arg Ile Asn Leu Arg Tyr Phe Tyr Asp Asn
180 185 190
Phe Ser Asp Asp Leu Ala Lys Ile Asn Leu Phe Lys Ser Asn Ile Leu
195 200 205
Lys His Asn Ala Asn Leu Ile Lys Thr Lys Asn Ile Ala Gln Glu Ser
210 215 220
Arg Thr Phe Ile Glu Arg Leu Asn Phe Tyr Arg Asp Asn Val Leu Asn
225 230 235 240
Gln Thr Lys Thr Gln His Glu Ile Glu Gln Leu Arg Lys Asn Leu Gly
245 250 255
Phe Ile Tyr Asp Asp Thr Ile Asp Glu Lys Thr Thr Arg Asn Gln Gly
260 265 270
Ile Val Gln Tyr Val Arg Ala Tyr Phe Pro Asp Glu Cys Ala Cys Cys
275 280 285
Lys Asn Gln Tyr Asn Ile Lys Asp Arg Ser Phe Thr Tyr Arg His Ser
290 295 300
Asp Arg Tyr Tyr Leu Glu Val His His Val Ile Ser Phe Ala Ser Asp
305 310 315 320
Arg Thr Leu Asp Gln Ile Asp Asn Leu Val Lys Val Cys Pro Thr Cys
325 330 335
His Arg Ala Leu Ser Lys Asn Arg Ala Asp Glu Gln Tyr Gln Lys Glu
340 345 350
Leu Ile Ser Glu Ile Leu Ile Asn Ala Pro Lys Ala Lys Glu Phe Cys
355 360 365
Leu Asn Phe Thr Asp Glu Asn Asp Cys Ile Gln Phe Ile Tyr Asp Arg
370 375 380
Leu Arg
385

Claims (10)

1.一种限制性内切酶MnlI的表达纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
构建限制性内切酶MnlI重组表达载体，转化甲基化感受态细胞，得限制性内切酶MnlI重组菌株，诱导培养，裂解菌体，纯化回收产物，即得限制性内切酶MnlI。
2.根据权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述限制性内切酶MnlI重组表达载体的构建方法包括将限制性内切酶MnlI基因片段连接pBAD质粒，得到限制性内切酶MnlI重组表达载体pBAD-R.MnlI；
优选地，所述限制性内切酶MnlI基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的表达纯化方法，其特征在于，所述甲基化感受态细胞的制备方法包括以下步骤：筛选MnlI甲基转移酶基因片段，连接表达载体pACYC184，得到甲基转移酶重组表达载体pACYC184-M.MnlI并转化大肠杆菌ER2566，得到甲基化感受态细胞[pACYC184-M.MnlI，ER2566]。
4.根据权利要求1-3任一项所述的表达纯化方法，其特征在于，所述诱导培养的诱导剂包括***糖；
优选地，所述诱导剂的终浓度为0.1-0.3％，优选为0.2％；
优选地，所述培养的条件为25-30℃，180-220rpm，培养15-20h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的表达纯化方法，其特征在于，所述裂解菌体包括以下步骤：诱导培养后收集菌体，用裂解缓冲液重悬菌体，得重悬液，对重悬液进行低温超高压破碎，得裂解液，离心得粗产品；
优选地，所述裂解缓冲液包括终浓度为5mmol/L～15mmol/L的Tris-Hcl、0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT、5％的甘油和150mmol/L～250mmol/L的Nacl；
优选地，所述裂解缓冲液与菌体的体积质量比(2-10):1mL/g；
优选地，所述低温为4-6℃；
优选地，所述超高压为70-90MPa，优选为80MPa；
优选地，所述离心的条件为30000-35000×g，4℃，25-30min，取上清，优选为35000×g，4℃，30min。
6.根据权利要求1-5任一项所述的表达纯化方法，其特征在于，所述纯化包括以下步骤：将裂解菌体得到的粗产品依次经过肝素亲和层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析纯化，得限制性内切酶MnlI。
7.根据权利要求6所述的表达纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换缓冲液包括终浓度为5mmol/L～15mmol/L的KH2PO4、0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT、5％的甘油和40mmol/L～80mmol/L的Nacl。
8.根据权利要求6或7所述的表达纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换缓冲液包括终浓度为5mmol/L～15mmol/L的Tris-Hcl、0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT、5％的甘油和40mmol/L～80mmol/L的Nacl。
9.根据权利要求1-8任一项所述的表达纯化方法，其特征在于，还包括限制性内切酶MnlI的酶活检测，具体包括以下步骤：对经纯化后得到的限制性内切酶MnlI进行梯度稀释后，在1×FlashOneTM Buffer缓冲条件下、20μl反应体系中，与底物λDNA在37℃温育15min，然后以1％琼脂糖凝胶电泳检测底物的酶切情况。
10.一种如权利要求1-9任一项所述表达纯化方法制备得到的限制性内切酶MnlI。
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