CN114276946A - 植物乳杆菌、菌剂以及饲料及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物和畜牧养殖领域，公开了一株植物乳杆菌、菌剂以及饲料及其应用。本发明提供的植物乳杆菌具有胞外多糖产量高、抑菌效果好等优势，将其添加于饲料中时，不仅能够提高养殖动物的免疫力，还具有促进动物生长的作用。

Description

植物乳杆菌、菌剂以及饲料及其应用

技术领域

本发明涉及微生物和畜牧养殖领域，具体涉及一株植物乳杆菌、菌剂以及饲料及其应用。

背景技术

随着社会和经济的发展，畜牧养殖业越来越趋于规模化、标准化发展。然而，规模化养殖在具有提高产量、便于管理等优势的同时，也面临着很多问题，例如，随着养殖规模的扩大，对于养殖动物的健康管理压力也随之加大。目前，在将抗生素作为饲料添加剂加入饲料中用于养殖动物饲喂是提高养殖动物免疫力，降低养殖动物病害发生的主要手段之一。然而，抗生素的不合理使用导致致病菌产生耐药性，养殖动物免疫力下降，为此，为了确保药效，抗生素的用量不得不随之提高，从而形成恶性循环，不仅提高了饲养成本，对产业的发展也造成严重阻碍。此外，抗生素的大量使用还会导致养殖动物体内药物残留量大，从而使得动物源食品的品质下降。此外，随着人们对食品安全问题重视度的提高，产业中对于抗生素的使用和对动物产品中药物残留量的管控也日渐严格。因此，为了确保产业健康、可持续发展，提高动物源食品品质，开发新型、安全的抗生素替代品的研究迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的畜牧养殖业中抗生素的大量不合理使用使得产业发展受阻、产品品质下降、饲养成本提高等问题，提供一株植物乳杆菌、菌剂以及饲料及其应用。本发明提供的植物乳杆菌的胞外多糖产量高、抑菌效果好，并且将其应用于饲料中时，不仅能够提高养殖动物的免疫力，还具有促进动物生长的作用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，所述植物乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2021608。

本发明第二方面提供如上所述的植物乳杆菌在抑制其他细菌中的应用。

本发明第三方面提供一种菌剂，所述菌剂中包含如前所述的植物乳杆菌。

本发明第四方面提供一种饲料，所述饲料中含有如前所述的植物乳杆菌或菌剂。

本发明第五方面提供如前所述的植物乳杆菌、菌剂或饲料在提高养殖动物免疫力中的应用。

本发明第六方面提供如前所述的植物乳杆菌、菌剂或饲料在促进养殖动物生长中的应用。

通过上述技术方案，本发明能够取得如下有益效果：

(1)本发明提供的植物乳杆菌的胞外多糖产量高，抑菌效果好；

(2)本发明提供的植物乳杆菌对养殖动物免疫力的提高水平与抗生素相当，能够替代抗生素作为饲料添加剂使用；

(3)本发明提供的植物乳杆菌用于禽、畜、水产等多种类养殖动物的饲养时，均可显著提高养殖动物的免疫力，适用范围广；

(4)用于畜类和水产养殖时(例如仔猪和鱼类养殖)，本发明提供的植物乳杆菌还具有降低养殖动物料重比等效果。

生物保藏

本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HJJBC 30195，已于2021年05月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO:M 2021608。

附图说明

图1是实施例1中获得的植物乳杆菌HJJBC 30195在MRS培养平板上的菌落特征图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明中，未做特殊说明的情况下，“(本发明提供的)植物乳杆菌”、“植物乳杆菌HJJBC 30195”等均指保藏编号为CCTCC NO:M 2021608的植物乳杆菌。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是一种厌氧或兼性厌氧的乳酸菌，常用于乳酸发酵生产工程菌。有研究表明，部分植物乳杆菌在生长代谢过程中，除乳酸外，还会产生具有抗菌功能的胞外分泌物，例如粘液多糖、荚膜多糖等胞外多糖，这些胞外多糖可以改善产品的组织状态、改善动物消化***黏膜功能，具有抗菌、提高免疫力等作用。而且，植物乳杆菌还是一种益生菌，能够促进养殖动物的消化吸收功能，具有良好的养殖动物保健作用。

本发明的发明人在研究的过程中筛选获得一株植物乳杆菌，该植物乳杆菌胞外多糖产量高，抑菌效果好，能够提高养殖动物的免疫力，并且具有良好的促生长效果。

本发明一方面提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，所述植物乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2021608。

本发明第二方面提供如上所述的植物乳杆菌在抑制细菌中的应用。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述其它细菌选自动物致病菌，例如沙门氏菌等。

本发明第三方面提供一种菌剂，所述菌剂中包含如前所述的植物乳杆菌。

本发明提供的菌剂可以作为饲料添加剂，用于抑制致病菌，提高养殖动物免疫力，提高养殖动物生长性能等。因此，本发明提供的菌剂中，植物乳杆菌CCTCC NO:M 2021608的含量没有特别限制，只要能够起到前述作用即可。为了获得更好、更稳定的动物保健效果，根据本发明的优选实施方式，其中，以活菌数计，所述植物乳杆菌的含量为1×10¹⁰-1×10¹¹/g。即，每克菌剂中，含有1×10¹⁰-1×10¹¹个植物乳杆菌CCTCC NO:M 2021608活菌细胞。

本发明提供的菌剂可以为任意本领域现有用作饲料添加剂的菌剂类型，例如，可以为固体菌剂，也可以为液体菌剂。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述菌剂为水含量不超过15重量％的固体菌剂。

优选地，所述菌剂中水含量为10-12重量％。

本发明提供的菌剂中可以仅含有植物乳杆菌CCTCC No:M2021608作为活性组分，也可以含有其他成分(例如该植物乳杆菌的代谢产物等)，以提高该菌剂的效果，例如抑菌效果、提高动物免疫力或生长性能等动物保健效果等。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述菌剂中还包括所述植物乳杆菌的代谢产物。

优选地，所述植物乳杆菌的代谢产物包括胞外多糖，例如粘液多糖、荚膜多糖等。

更优选地，所述菌剂中，所述胞外多糖的含量可以为0.1-0.5g/L，优选为0.25-0.35g/L。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述菌剂中还可以包括辅料。

所述辅料可以为本领域任意能够用于饲料添加剂，尤其是生物添加剂中的辅料，例如用于提高菌剂品质的辅料、用于提高该菌剂效果的辅料等。优选地，所述辅料选自脱脂豆粕、高粱粉、花生粕和麸皮中的至少一种。

本发明提供的菌剂可以采用任意本领域现有菌剂(饲料添加剂)制备方法制备获得。根据本发明的优选实施方式，其中，所述菌剂的制备方法可以包括：将植物乳杆菌CCTCCNO:M 2021608接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得发酵液。所述发酵液可以直接(或在浓缩后)用作液体菌剂使用，也可以将其进行干燥处理，制成固体菌剂使用。

根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述菌剂的制备方法可以包括：

(1)制备种子液：将植物乳杆菌CCTCC NO:M 2021608接种至种子培养基中，进行种子培养，获得植物乳杆菌种子液；

(2)种子液发酵：将植物乳杆菌种子液接种至发酵培养基中，进行发酵培养，获得植物乳杆菌发酵液。

优选地，步骤(1)中，所述种子培养基可以为任意本领域用于培养(扩培)植物乳杆菌的培养基，例如MRS培养基、LB培养基等。所述种子培养及可以为商购获得的相关产品，也可以是根据现有技术自行配制的培养基。

优选地，步骤(1)中，所述种子培养的条件可以包括：植物乳杆菌接种量1-5重量％(使得种子培养体系中植物乳杆菌的含量为1×10⁸-1×10⁹CFU/mL)，温度35-40℃，时间20-80h。

优选地，步骤(2)中，所述发酵培养基可为任意本领域用于植物乳杆菌发酵培养的培养基，例如MRS培养基、LB培养基等。所述发酵培养及可以为商购获得的相关产品，也可以是根据现有技术自行配制的培养基。

更优选地，所述发酵培养基的配方可以包括：碳源70-80重量％、氮源10-20重量％、无机盐1-3重量％、生物素0.01-0.1重量％、水1-10重量％。其中，所述碳源可以选自玉米粉、高粱粉中的至少一种。所述氮源可以选自(脱脂)豆粕粉、花生粕中的至少一种。所述无机盐可以选自铵盐、钠盐(例如食盐)中的至少一种。

优选地，步骤(2)中，所述植物乳杆菌种子液与发酵培养基的体积比为1:2-10，优选为1:3-5。优选所述植物乳杆菌种子液的用量使得发酵培养体系中植物乳杆菌的含量为1×10⁸-1×10⁹CFU/mL。

优选地，步骤(2)中，所述发酵培养的条件可以包括：温度30-40℃，时间20-80h。本发明提供的方法中，发酵培养的时间并不限于20-80h，优选当发酵培养体系中水含量达到30-40重量％，pH达到3.2-4时，即可结束发酵。也即，若达到上述条件时发酵时间不足20h，也可立即停止发酵，若发酵80h后仍未达到该条件，则可以适当延长发酵时间。

所述植物乳杆菌发酵液可以直接用作液体菌剂，也可浓缩处理后用作液体菌剂。所述液体菌剂的特征如前所述，在此不再赘述。

优选地，所述方法还可以包括任选的步骤(3)：将所述植物乳杆菌发酵液进行干燥处理，获得固体菌剂。所述固体菌剂的特征如前所述，在此不再赘述。所述干燥处理可以采用任意本领域现有的用于固体菌剂制备的干燥方式，例如喷雾干燥、冷冻干燥等。

更优选地，所述干燥处理的条件可以包括：温度40-50℃，时间10-20h。

本发明第四方面提供一种饲料，所述动物饲料中含有如前所述的植物乳杆菌或菌剂。

本发明提供的饲料中，所述植物乳杆菌或菌剂的用量没有特别限制，可以根据实际情况(例如养殖动物种类、养殖动物年龄等)进行调整。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述饲料中植物乳杆菌或所述菌剂的添加量使得在所述饲料中，以活菌数计，所述植物乳杆菌的含量为1×10⁷-1×10⁸/g。

优选地，所述饲料中所述植物乳杆菌的含量为1×10⁷-5×10⁷/g。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述饲料中还可以含有所述植物乳杆菌的代谢产物。

优选地，所述植物乳杆菌的代谢产物包括胞外多糖的至少一种。

更优选地，所述饲料中，所述胞外多糖的含量可以为0.5-2.5mg/L，优选为1.25-1.75mg/L。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述饲料中还可以含有辅料，例如用于稳定菌剂效果的辅料，用于增加碳源、氮源的辅料等。

优选地，所述辅料可以包括脱脂豆粕、高粱粉、花生粕和麸皮中的至少一种。

本发明第五方面提供如前所述的植物乳杆菌、菌剂或饲料在提高养殖动物免疫力中的应用。

本发明中，所述养殖动物可以为现有技术中任意用于提供动物源性食品和/或副食品的动物。例如，可以为禽类、畜类、养殖水产等。

本发明第六方面提供如前所述的植物乳杆菌、菌剂或饲料在促进养殖动物生长中的应用。

本发明中，所述养殖动物可以为现有技术中任意用于提供动物源性食品和/或副食品的动物。例如，可以为禽类、畜类、养殖水产等。

本发明中，所述促进养殖动物生长可以包括提高养殖动物的生长性能。例如，可以为提高养殖动物的增重率、降低养殖料重比等。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步详细解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。

以下实施例中，未作特殊说明的情况下，采用的化学/生物试剂均购自正规试剂供应商，纯度为分析纯。

以下实施例中，MRS培养基的制备方法如下：蛋白胨10g/1000mL，牛肉浸粉5g/1000mL，酵母浸粉4g/1000mL，葡萄糖20g/1000mL，磷酸氢二钾2g/1000mL，柠檬酸三铵2g/1000mL，醋酸钠5g/1000mL，硫酸镁0.2g/1000mL，硫酸锰0.05g/1000mL，吐温80为1g/1000mL。按照如上比例称取原料，溶于去离子水中，调节pH至6.2±0.2，121℃高压灭菌15min，即得MRS液体培养基。在灭菌前，按照15g/1000mL的用量加入琼脂，灭菌后冷却凝固即得MRS固体培养基。

在灭菌后，待培养基冷却至不烫手的程度(约50℃)，将其倒入平板培养皿中，冷却凝固后即得MRS培养平板。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的植物乳杆菌CCTCC NO:M 2021608的分离、筛选及保藏。

(一)菌株分离

自健康仔猪小肠食糜中取样，使用MRS培养平板进行菌株初步分离筛选，从中挑取长势较好、生长较快、形态学特征较为明显的单菌落接种至MRS液体培养基中，添加生物素(约1g/mL)，37℃培养24h，划线法接种至MRS培养平板中，从中挑选出菌体特征明显、生长快的15株菌株，分别对其进行16S rDNA基因测序鉴定(委托生工生物工程公司完成)，其结果显示，其中8株与Lactobacillus plantarum有100％的同源性，结合生理生化鉴定结果，综合认定这8株菌为植物乳杆菌，依次编号为LP01至LP08(图1中示出了LP05，即HJJBC 30195在MRS培养平板上进行培养时的菌落特征)。

(二)菌株筛选

胞外多糖产量筛选：分别将LP01至LP08接种至MRS液体培养基中，37℃培养24h。将培养产物8000rpm离心10min，取上清液。采用斐林试剂法检测上清液中胞外多糖的含量。检测结果详见表1。

表1

菌株	LP01	LP02	LP03	LP04	LP05	LP06	LP07	LP08
									胞外多糖产量(g/L)	0.31	0.21	0.32	0.3	0.35	0.28	0.31	0.23

根据表1的结果，选取胞外多糖产量较高(≥0.3g/L)的LP01、LP03、LP04、LP05和LP07进行进一步的抑菌效果筛选。

抑菌效果筛选：分别将LP01、LP03、LP04、LP05和LP07接种至MRS液体培养基中，37℃培养24h，获得培养液。

将沙门氏菌ATCC25922(购自ATCC)均匀涂布于MRS培养平板上，取无菌牛津杯(购自上海精密科学仪器仪表公司，直径为70mm)置于其上。分别在牛津杯中加入LP01、LP03、LP04、LP05和LP07的培养液(加入量为150μL)，37℃培养12h，测量抑菌圈直径。测量结果详见表2。

表2

菌株	<u>LP01</u>	<u>LP03</u>	<u>LP04</u>	<u>LP05</u>	<u>LP07</u>
						抑菌圈直径(mm)	19	17	21	24	20

结合表1和表2的结果，可以看出，LP05的胞外多糖产量最高，抑菌效果亦最好，因此，将其选作动物饲料备选菌株。

(三)菌株保藏

于2021年05月24日，将植物乳杆菌LP05(即HJJBC 30195)保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO:M 2021608。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的植物乳杆菌CCTCC NO:M 2021608菌剂的制备。

(1)制备种子液：将实施例1中获得的植物乳杆菌菌株LP05接种至MRS液体培养基中，使得培养体系中LP05的含量为10⁶CFU/mL。37℃培养72h，获得种子液(经检测，其中LP05的含量为10⁹CFU/mL)；

(2)种子液发酵：按照表3中的比例和方法将发酵培养基与种子液混合，37℃发酵培养。至发酵体系中水含量达到35重量％，pH达到3.5±0.3时(约72h)，结束发酵，获得发酵液。

表3

(3)将发酵液于45℃干燥12h，将获得的干燥产物粉碎过筛(50目)，获得淡黄色粉末状固体菌剂。

经检测，该固体菌剂中，LP05活菌数约为5×10¹⁰/g，水含量约为12重量％，胞外多糖含量0.34g/L。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的植物乳杆菌CCTCC NO:M 2021608菌剂作为饲料添加剂时对养殖动物的饲喂效果。

本实施例中采用的蛋鸡基础饲料、仔猪基础饲料和鱼基础饲料均购自正大实业有限公司。抗生素为金霉素(购自金河生物)。本实施例中采用的菌剂即为实施例2中获得的菌剂。

(一)蛋鸡饲喂试验

选购40只体重2.5±0.3kg的健康成年蛋鸡，随机分为4组，每组10只，分别采用表4中的饲料进行饲喂，具体饲喂方法为：每日2次，每次饲喂量为体重的4％。除饲料不同外，各组蛋鸡的饲养方式和条件均相同。喂养2周后，对各组蛋鸡的脾脏指数和胸腺指数进行检测，检测结果详见表4。

表4

组别	饲料	添加剂/重量‰	脾脏指数	胸腺指数
					对照组I	基础饲料	/	1.90±0.14	6.94±0.55
对照组II	基础饲料+抗生素	0.05	2.11±0.13	10.92±0.84
					实验组I	基础饲料+菌剂	5	2.23±0.25	11.02±1.02
实验组II	基础饲料+菌剂	5	2.30±0.19	10.89±0.94

根据表4的结果可以看出，相比于仅采用基础饲料进行饲喂的蛋鸡，添加了本发明提供的菌剂的饲料喂养的蛋鸡的脾脏指数和胸腺指数均有所提高(分别约提高了21％和58％)，说明本发明提供的菌剂能够提高蛋鸡的免疫能力。而且，经过对比可以看出，本发明提供的菌剂对蛋鸡免疫能力的提高水平与抗生素对蛋鸡免疫能力的提高水平相当，由此说明了，本发明提供的菌剂具有替代抗生素的潜力。

(二)仔猪饲喂试验

选购40头体重6.21±0.43kg的健康21日龄仔猪，随机分为4组，每组10头，分别采用表5中的饲料进行饲喂，具体饲喂方法为：每日2次，每次饲喂量为体重的4％。除饲料不同外，各组仔猪的饲养方式和条件均相同。喂养2周后，对各组仔猪血清中Ig G含量进行检测，并按照以下公式计算料重比，结果详见表5。

料重比＝(实验终仔猪体重平均值-实验初仔猪体重平均值)/饲料消耗量

表5

组别	饲料	添加剂(重量‰)	Ig G(g/L)	料重比
					对照组I	基础饲料	/	1.50±0.04	2.45±0.15
对照组II	基础饲料+抗生素	0.05	3.01±0.22	2.57±0.18
					实验组I	基础饲料+菌剂	5	2.93±0.21	1.96±0.09
实验组II	基础饲料+菌剂	5	2.85±0.16	2.03±0.14

根据表5的结果可以看出，相比于仅采用基础饲料进行饲喂的仔猪，添加了本发明提供的菌剂的饲料喂养的仔猪的血液中Ig G的含量有所提高(约提高了95％)，说明本发明提供的菌剂能够提高仔猪的免疫能力。经过对比还可以看出，本发明提供的菌剂对仔猪免疫能力的提高水平与抗生素对仔猪免疫能力的提高水平相当，由此说明了，本发明提供的菌剂具有替代抗生素的潜力。

而且，与仅采用基础饲料进行饲喂的仔猪相比，添加本发明提供的菌剂的饲料喂养仔猪的料重比下降了约20％，而添加抗生素的饲料喂养仔猪时料重比则是上升了约5％。

(三)鱼饲喂试验

选购80尾体重50±0.22g的健康罗非鱼，随机分为4组，每组20尾，分别采用表6中的饲料进行饲喂，具体饲喂方法为：每日2次，每次饲喂量为体重的4％。除饲料不同外，各组鱼苗的饲养方式和条件均相同。喂养2周后，对各组鱼血清中Ig G含量进行检测，并按照以下公式计算料重比，结果详见表6。

料重比＝(实验终鱼体重平均值-实验初鱼体重平均值)/饲料消耗量

表6

组别	饲料	添加剂(重量‰)	Ig G(g/L)	料重比
					对照组I	基础饲料	/	14.23±1.16	2.88±0.21
对照组II	基础饲料+抗生素	0.05	20.02±1.95	2.93±0.15
					实验组I	基础饲料+菌剂	5	18.55±1.09	2.10±0.20
实验组II	基础饲料+菌剂	5	19.82±0.98	2.21±0.12

根据表6的结果可以看出，相比于仅采用基础饲料进行饲喂的鱼，添加了本发明提供的菌剂的饲料喂养的鱼的血液中Ig G的含量有所提高(约提高了39％)，说明本发明提供的菌剂能够提高鱼的免疫能力。经过对比还可以看出，本发明提供的菌剂对鱼免疫能力的提高水平与抗生素对鱼免疫能力的提高水平相当，由此说明了，本发明提供的菌剂具有替代抗生素的潜力。

而且，与仅采用基础饲料进行饲喂的鱼相比，添加本发明提供的菌剂的饲料喂养鱼的料重比下降了约27％，而添加抗生素的饲料喂养鱼时料重比则是上升了约1.7％。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其特征在于，所述植物乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2021608。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌在抑制其它细菌中的应用。

3.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂中包含权利要求1所述的植物乳杆菌。

4.根据权利要求3所述的菌剂，其中，以活菌数计，所述植物乳杆菌的含量为1×10¹⁰-1×10¹¹/g。

5.根据权利要求3或4所述的菌剂，其中，所述菌剂为水含量不超过15重量％的固体菌剂；

优选地，所述菌剂中水含量为10-12重量％。

6.根据权利要求3所述的菌剂，其中，所述菌剂中还包括所述植物乳杆菌的代谢产物；

和/或，所述菌剂中还可以包括辅料；

优选地，所述植物乳杆菌的代谢产物包括胞外多糖；

优选地，所述辅料选自脱脂豆粕、高粱粉、花生粕和麸皮中的至少一种。

7.一种饲料，其特征在于，所述动物饲料中含有权利要求1所述的植物乳杆菌或权利要求3-6中任意一项所述的菌剂。

8.根据权利要求7所述的饲料，其中，所述饲料中植物乳杆菌或所述菌剂的添加量使得在所述饲料中，以活菌数计，所述植物乳杆菌的含量为1×10⁷-1×10⁸/g；

优选地，所述饲料中所述植物乳杆菌的含量为1×10⁷-5×10⁷/g。

9.权利要求1所述的植物乳杆菌、权利要求3-6中任意一项所述的菌剂或权利要求7或8所述的饲料在提高养殖动物免疫力中的应用。

10.权利要求1所述的植物乳杆菌、权利要求3-6中任意一项所述的菌剂或权利要求7或8所述的饲料在促进养殖动物生长中的应用。

Images