CN117467648B - 一种酵母酶解物在制备饲料添加剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酵母酶解物在制备饲料添加剂中的应用，属于饲料制备技术领域。通过构建同时表达β‑葡聚糖酶和β‑甘露聚糖酶突变体的重组毕赤酵母菌株，两种酶协同酶解自体细胞壁，酶解液喷雾干燥制成饲料添加剂。本发明提供了一组酵母细胞壁降解酶，包括一种β‑葡聚糖酶突变体和一种β‑甘露聚糖酶突变体两种酶。两种酶突变体在酵母最适生长温度酶活性高，联用起到了功能协同促进作用，能将酵母细胞壁中水不溶的葡聚糖和甘露聚糖充分酶解成水溶性寡糖，释放酵母活性成分。本发明酵母酶解物制备饲料添加剂具有改善雏鸡拉稀症状、降低肉鸡料肉比、提高疫苗免疫抗体效价的有益效果。
Description
技术领域
本发明属于饲料制备技术领域，尤其涉及一种酵母酶解物在制备饲料添加剂中的应用。
背景技术
酵母细胞壁是一种绿色添加剂，富含β-葡聚糖和甘露聚糖等多种生物活性物质，具有吸附病原菌、吸附霉菌毒素、增强免疫、促进生长、缓解应激、补充营养等多种生理功能。甘露聚糖约占酵母细胞壁干重的30%，β-葡聚糖约占30%，葡聚糖和甘露聚糖的交联在酵母细胞壁的合成中具有重要作用。传统方法制备酵母多糖需要经过酵母高温自溶、机械破碎处理、添加细胞壁降解酶降解细胞壁等步骤，裂解细胞壁耗时长，且需要用到高压均质机、玻璃珠研磨破碎机等昂贵设备，存在能耗高、细胞壁破碎效率低、水溶性多糖提取效率低的问题。
酵母高温自溶或者机械破碎过程产热均会导致部分热不稳定成分生物活性下降。简单自溶或机械破碎的酵母细胞壁破碎不充分，葡聚糖和甘露聚糖交联构成的细胞壁主体仍然以水不溶的形式存在于沉淀物中。这些水不溶成分饲喂动物消化利用度低，生物活性低下。只有将细胞壁中水不溶的葡聚糖和甘露聚糖充分酶解成水溶性寡糖，才能充分发挥其生物活性，避免有用资源浪费。现有技术通过添加细胞壁降解酶降解酵母细胞壁，需要严格调控温度、pH、盐离子浓度等反应条件，且存在酶活性低的问题。因此，需要开发在酵母生理条件下能够简单、高效降解酵母细胞壁的酶，用于制备含有酵母酶解物的饲料添加剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酵母酶解物在制备饲料添加剂中的应用，属于饲料制备技术领域。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
其一，本发明提供了一组酵母细胞壁降解酶，所述酵母细胞壁降解酶包括一种β-葡聚糖酶突变体和一种β-甘露聚糖酶突变体两种酶。
进一步地，所述β-葡聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述β-甘露聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
其二，本发明提供了一种含有酵母酶解物的饲料添加剂，所述酵母酶解物为通过重组毕赤酵母菌表达β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶协同酶解自体细胞壁所制成的酵母酶解物。
进一步地，所述β-葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述β-甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
进一步地，所述β-葡聚糖酶的氨基酸序列176位和183位的Trp突变为Ala；所述β-甘露聚糖酶的氨基酸序列196位、198位和199位的Trp突变为Ala。
进一步地，所述饲料添加剂在饲料中的添加量的质量比为1:1000。
进一步地，所述饲料添加剂能够用于改善雏鸡拉稀症状、降低肉鸡料肉比、提高疫苗免疫抗体效价。
本发明的有益效果在于，构建同时表达β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶突变体的重组毕赤酵母菌株，β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶由严谨诱导型醇氧化酶启动子控制，增菌发酵阶段不表达酶，高密度发酵后经甲醇诱导启动酶表达。两种酶突变体在酵母最适生长温度下比未突变的酶活性更高，适用于工业发酵条件下酶解酵母细胞壁。本发明减少了额外添加酵母细胞壁降解酶的过程，简化了额外添加酵母细胞壁降解酶对温度、pH、盐离子浓度的调控过程。细胞壁从内到外酶解自溶，两种酶联用起到了功能协同促进作用，将水不溶性葡聚糖和甘露聚糖酶解成具有更高生物活性的葡聚糖寡糖和低聚甘露糖。酵母酶解物制备饲料添加剂能够改善动物腹泻拉稀症状、提高疫苗免疫抗体效价、延长疫苗免疫期。
附图说明
图1：摇床培养条件下不同毕赤酵母菌株细胞壁多糖酶解效果图。
图2：发酵罐培养条件下重组毕赤酵母菌株细胞壁多糖酶解效果图。
图3：酵母酶解物饲料添加剂对鸡免疫性能的影响。
具体实施方式
实施例1：基于计算机辅助设计的酶结构改造和突变体设计
解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶GenBank登录号为：AAA87323.1，解淀粉芽孢杆菌β-甘露聚糖酶GenBank登录号为：ACX94042.1。应用Discovery Studio 软件对两种酶氨基酸序列进行分析。β-葡聚糖酶活性中心位于171位~183位之间，通过降低酶蛋白活性中心的空间位阻，对β-葡聚糖酶进行点突变，将176位和183位的Trp突变为Ala，β-葡聚糖酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.1；β-甘露聚糖酶活性中心位于193~201位之间，通过降低酶蛋白活性中心的空间位阻，β-甘露聚糖酶进行点突变，将196位、198位和199位的Trp突变为Ala，β-甘露聚糖酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
实施例2：同时表达β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶的重组毕赤酵母菌株构建
1.1基因合成
根据毕赤酵母偏嗜密码子合成β-葡聚糖酶突变体DNA序列SEQ ID NO.3，β-甘露聚糖酶突变体DNA序列SEQ ID NO.4。上下游分别添加XhoI和NotI限制性内切酶位点，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并克隆到pUC57质粒上获得pUC57-bglA质粒和pUC57-bman；
1.2 β-葡聚糖酶重组表达载体的构建
(1)利用限制性内切酶XhoI和NotI对pUC57-bglA质粒进行双酶切，并回收bglA基因片段；
(2)利用限制性内切酶XhoI和NotI双酶切表达载体pPICZαA，并回收基因片段；
(3)将步骤(1)、(2)中双酶切回收的核酸片段用T4 DNA连接酶连接，再转化到大肠杆菌E .coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，XhoI和NotI双酶切鉴定，获得重组表达质粒pPICZα-bglA。
1.3 β-甘露聚糖酶重组表达载体的构建
(1)利用限制性内切酶XhoI和NotI对pUC57-bman质粒进行双酶切，并回收bman基因片段；
(2)利用限制性内切酶XhoI和NotI双酶切表达载体pPICZαA，并回收基因片段；
(3)将步骤(1)、(2)中双酶切回收的核酸片段用T4 DNA连接酶连接，再转化到大肠杆菌E .coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，XhoI和NotI双酶切鉴定，获得重组表达质粒pPICZα-bman。
1.4 同时表达β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶的重组毕赤酵母菌株构建
(1)用PmeI酶分别酶切质粒pPICZα-bman和pPICZα-bglA，乙醇沉淀回收线性化质粒；
(2)线性化质粒pPICZα-bman和pPICZα-bglA混合后电转化毕赤酵母X-33感受态细胞；含1000ug/ml博莱霉素的YPD平板筛选有抗性的单菌落。筛选出的单菌落用bmanf/bmanr和bglAf/bglAr两对引物进行检测。仅bmanf/bmanr检测阳性的菌落为只表达β-甘露聚糖酶的重组酵母菌株，命名为X33/bman；仅bglAf/bglAr检测阳性的菌落为只表达β-葡聚糖酶的重组酵母菌株，命名为X33/bglA；两对引物检测均为阳性的菌落为同时表达β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶的重组毕赤酵母菌株，命名为X33/bman-bglA。引物序列：
bmanf：CTCGAGATGCTCAAAAGGTTAGCAGTC，SEQ ID NO.5；
bmanr：GCGGCCGCTTATTCCGTGATCGGCGTCAAGG，SEQ ID NO.6；
bglAf：CTCGAGATGAAACGAGTGTTGCTAATTC，SEQ ID NO.7；
bglAr：GCGGCCGCTTATTTTTTTCTATAGCGCATCC，SEQ ID NO.8；
1.5 重组毕赤酵母菌株的诱导表达和细胞壁多糖酶解
(1)分别挑取重组毕赤酵母菌株X33/bman、X33/bglA、X33/bman-bglA单菌落接种含有 5mlYPD 培养基的50ml离心管，置于 30℃，250rpm摇床过夜培养；
(2)接种2ml种子培养液至200ml BMGY 培养基的1000ml 摇瓶中，30℃，250rpm培养24h；
(3)向摇瓶中添加0.5%的甲醇，置于30℃，250rpm 摇床进行诱导发酵培养24小时，表达β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶，菌体细胞壁多糖酶解。诱导发酵期间每隔6h取样1ml，5000rpm/min离心3min，测量菌体湿重。
从图1可以看出，其中空白X33酵母加甲醇培养24h菌体湿重由192g/L持续增加到333g/L；X33/bman酵母加甲醇培养前6h菌体湿重增长，之后降低，至24h降低到143g/L；X33/bglA酵母加甲醇培养前6h菌体湿重增长，之后降低，至24h降低到130g/L；X33/bman-bglA酵母加甲醇培养前6h菌体湿重增长，之后降低，至18h降低到47g/L，至24h为46g/L基本不再降低。
同时表达β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶的重组毕赤酵母菌株诱导24小时，菌体不可溶成分湿重比单纯表达β-葡聚糖酶的菌株降低了64.62%，比单纯表达β-甘露聚糖酶的菌株降低了67.83%。两种酶联用起到了功能协同促进作用，能将细胞壁中水不溶的葡聚糖和甘露聚糖充分酶解成水溶性寡糖。
实施例3：利用发酵罐制备酵母酶解物发酵方法
(1) 种子培养
①将-80℃冻存的工程菌X33/bman-bglA在含1000ug/ml博莱霉素的YPD平板划线，28℃培养72h左右，挑取单克隆于5ml BMGY 培养基中，30℃，250r/min，振荡培养16～24h ；
②取200μl上述种子液接种于200ml BMGY培养基 (1000ml 的锥形瓶 ) 中，共5瓶，30℃，250r/min，12～14h，至OD600＝2～6，作为上罐种子液。
(2) 甘油增菌培养
①调校设备：校准发酵罐的pH电极、溶氧电极，并进行蠕动泵的流量校准；
②配制60L BMGY培养基，加入100L发酵罐，121℃，30min高压灭菌培养基、发酵罐及管道；
③待发酵罐内培养液冷却到 30℃时，用 28％氨水调节培养基的 pH 值至 5.0，而后按照 4.0ml PTM1/L BMGY的比例加入PTM1微量元素 ；
④将上述摇瓶培养菌种加入发酵罐中，开始发酵罐培养，此为第一阶段即甘油培养扩增菌体，发酵罐参数设置分别为搅拌速度500～800r/min，罐内压力 9psi，温度30℃，设定DO值 (溶解氧) 在 20％以上，以P-I-D 方式控制 ；
⑤当 DO 值上升至接近100％ (约30h)；说明培养液中甘油已消耗殆尽，转入补充甘油阶段，以进一步增加菌体密度，测菌体湿重，此时菌体湿重约为 150g/L ；
⑥按照每升12ml PTM1微量元素的比例在高压灭菌后的50％甘油中加入 PTM1微量元素，混匀后，以18.0ml/h/L的速率加入到发酵罐中，至菌体湿重达 380～400g/L；
⑦停止补加甘油后，观测DO值上升至接近100％后，继续维持“甘油饥饿”状态60min，转入甲醇诱导表达阶段；
(3)甲醇诱导β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶的表达
①将甲醇以3.0ml/h/L的速率加入到发酵罐中诱导表达，维持此低速率3h，以使酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境。在此期间，DO值变得不稳定，波动较大，在酵母适应环境后，DO值即保持稳定，继续维持此低速率补加甲醇2h；
②补加甲醇的速率升为8.0ml/h/L，以此速率维持至甲醇终浓度为0.5%，停止补加甲醇；
③开始诱导表达后，每隔4h取样1次，测菌体湿重，分析酵母菌生长状态；
④诱导发酵24h，菌体湿重降至约100g/L，与20小时相比没有明显下降，结束发酵。留取少量上清，4℃保存，以备后续检测使用。发酵结束后，发酵液经喷雾干燥机干燥处理成粉末状，塑料袋分装制成酵母酶解物饲料添加剂。
从图2可以看出，X33/bman-bglA酵母加甲醇培养前8h菌体湿重继续增长，之后降低，至20h降低到104g/L，至24h为99g/L基本不再降低。诱导发酵20h能使酵母菌细胞壁多糖充分酶解成水溶性寡糖。
实施例4：酵母酶解物饲料添加剂对鸡生长性能的影响
β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶突变体酵母酶解物饲料添加剂分别按不同比例加进基础饲料中，充分搅拌均匀。按饲料添加剂重量：基础饲料重量，1:100、1:1000、1:10000配制三种饲料。并设相同比例添加未突变的β-葡聚糖酶、未突变的β-甘露聚糖酶酵母酶解物饲料添加剂组和基础饲料对照组。
700只1日龄健康白羽肉鸡随机分为7组，100只/组，隔离饲养；
每天8：00和16：00各饲喂一次，自由采食、饮水，试验期为40天，饲养期间按照白羽肉鸡常规免疫程序免疫和饲养管理，期间每天观察试验鸡生长情况，实验结束统计鸡料肉比。
表1 不同比例酵母酶解物饲料添加剂饲喂对白羽肉鸡生长的影响
从表1可以看出，本发明所制备的β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶突变体酵母酶解物饲料添加剂按1:100、1:1000、1:10000配比加入基础饲料中饲喂白羽肉鸡，均能明显降低料肉比，效果明显优于添加未突变的β-葡聚糖酶、未突变的β-甘露聚糖酶酵母酶解物饲料添加剂。其中β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶突变体酵母酶解物饲料添加剂按1:100与1:1000比例添加效果相当，因此本发明酵母酶解物饲料添加剂在饲料中的添加量的质量比为1:1000，拌料添加能增加肉鸡养殖效益。并且按1:1000及以上剂量拌料饲喂均能改善雏鸡拉稀便症状，有益雏鸡健康。
实施例5：酵母酶解物饲料添加剂对鸡免疫性能的影响
（1）β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶突变体酵母酶解物饲料添加剂在饲料中的添加量的质量比1:1000加进基础饲料中，充分搅拌均匀。并设相同比例添加未突变的β-葡聚糖酶、未突变的β-甘露聚糖酶酵母酶解物饲料添加剂组和基础饲料对照组。
（2）60只1日龄SPF鸡随机分为3组，20只/组，隔离饲养；颈部皮下注射新城疫灭活疫苗，每只0.3ml（1羽份）。于免疫后15日、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月各组采血，分离血清，检测HI抗体，计算各组HI抗体几何平均值。
（3）每天8：00和16：00各饲喂一次，自由采食、饮水，试验期为6个月。
从图3可以看出，本发明所制备的β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶突变体酵母酶解物饲料添加剂按质量比1:1000加入基础饲料中饲喂SPF鸡，免疫新城疫灭活疫苗后半个月HI抗体几何平均值比基础饲料对照组高1.8个滴度，比添加未突变的β-葡聚糖酶、未突变的β-甘露聚糖酶酵母酶解物饲料添加剂组高1个滴度。免疫后1个月，酶突变体酵母酶解物组HI抗体峰值明显高于其他两组。免疫后6个月，对照组HI抗体已经衰减到3.6，添加未突变的β-葡聚糖酶、未突变的β-甘露聚糖酶酵母酶解物饲料添加剂组HI抗体衰减到5.1，而酶突变体酵母酶解物组仍维持较高HI抗体6.4。因此本发明酵母酶解物饲料添加剂按1:1000质量比拌料添加能提高疫苗免疫抗体效价。
Claims (2)
1.一组酵母细胞壁降解酶，其特征在于，所述酵母细胞壁降解酶包括一种β-葡聚糖酶突变体和一种β-甘露聚糖酶突变体两种酶，所述β-葡聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO.1，所述β-甘露聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
2.一种含有酵母酶解物的饲料添加剂，其特征在于，所述酵母酶解物为通过重组毕赤酵母菌表达β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶协同酶解自体细胞壁所制成的酵母酶解物；所述β-葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述β-甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；所述饲料添加剂在饲料中的添加量的质量比为1:1000；所述饲料添加剂能够用于改善雏鸡拉稀症状、降低肉鸡料肉比、提高疫苗免疫抗体效价。
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