CN107190103A

CN107190103A - 同时检测三种鱼类病毒的多重pcr引物组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN107190103A
Application number: CN201710469019.4A
Authority: CN
Inventors: 葛均青; 杨金先; 柯翎
Original assignee: Institute of Biotechnology of Fujian Academy of Agricultural Science
Current assignee: Institute of Biotechnology of Fujian Academy of Agricultural Science
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2017-06-20
Publication date: 2017-09-22
Anticipated expiration: 2037-06-20
Also published as: CN107190103B

Abstract

本发明提供用于同时检测鳗鲡疱疹病毒EHV、日本鳗鲡表皮细胞坏死病毒JEECV和花鳗鲡多瘤病毒AmPV的多重PCR引物组、试剂盒及检测方法，本发明根据获得的核酸序列，设计用于扩增EHV，JEECV和AmPV的特异性引物，避免引物之间形成稳定的引物二聚体，并对引物扩增序列的特异性进行分析，获得由6条核酸序列组成，可同时对EHV，JEECV和AmPV具有高的扩增灵敏性和特异性的引物组，包括：SEQ ID NO：1‑6。本发明可在同一PCR反应体系中同时检测和鉴别EHV，JEECV和AmPV，具有操作简便，特异性强等优点；而且本发明可根据扩增长度的不同直接判定结果，更高效、实用。

Description

同时检测三种鱼类病毒的多重PCR引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于水产病害微生物检测技术领域，具体涉及一种可同时检测鳗鲡疱疹病毒(Eel herpesvirus，EHV)、日本鳗鲡表皮细胞坏死病毒(Japanese eel endothelialcells-infecting virus，JEECV)和花鳗鲡多瘤病毒(Anguilla marmorata polyoma-likevirus，AmPV)三种DNA病毒的多重PCR引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

我国是世界主要的鳗鲡养殖国家之一，其产值在我国的水产品出口贸易中占有重要地位。养殖的品种主要日本鳗鲡(A.japonica)、欧洲鳗鲡(A. anguilla)、美洲鳗鲡(A.rostrata)、花鳗鲡(A.Marmorata)。由于大规模的集约化养殖，重大病毒性疫病爆发日益频繁，造成巨额的经济损失。明确疾病的的致病病原是有效开展疾病防控的重要前提。我们率先在国内建立了多种鳗鲡病毒的检测方法，开展了相关病毒的流行病学调查。鳗鲡疱疹病毒 (Eel herpesvirus,EHV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(Japanese eelendothelial cells-infecting virus,JEECV)和花鳗鲡多瘤病毒(Anguilla marmoratapolyoma-like virus，AmPV)同属于DNA病毒，这三种病毒对鳗鲡的致病性均表现为烂鳃、出血等症状，在临床诊断上难以区分。我们分别建立了这三种病毒的PCR检测方法，分别检测耗时费力；同时，也多次发现它们有混合感染的情况。

EHV是一种具有囊膜的双链DNA病毒，曾给多国欧洲鳗鲡和日本鳗鲡的养殖业者造成巨大经济损失，其也是引起野生欧洲鳗鲡减少的重要因素。我们前期的研究表明，其可在欧洲鳗鲡、日本鳗鲡、美洲鳗鲡和花鳗鲡上检出。临床和病理学研究表明，EHV可引起“烂鳃”、“脱粘”、“红头”等典型症状。但现有的PCR检测都是根据EHV的DNA聚合酶基因序列设计引物，因DNA聚合酶基因高度保守，在检测时可能会检出鳗鲡虹彩病毒，表现为 EHV假阳性。

JEECV是一种双链环状DNA病毒，具有与多瘤病毒的大T抗原基因同源且高度保守的LTLG基因,是日本鳗鲡内皮细胞坏死病(Viral endothelial cell necrosis of eel,VECNE)的致病病原。自上世纪80年代，VECNE就经常爆发，给日本鳗鲡的养殖业者造成巨大经济损失。其致病的典型症状包括鳗鲡的鳍条变红，腹部膨胀，鳃、肝脏充血等。我们在国内首次建立了JEECV的PCR 检测方法，并成功应用于疾病的诊断。

AmPV与JEECV一样，具有多瘤病毒的LTLG基因。序列分析表明，我们从患病的花鳗鲡中扩增到的序列与中国台湾分离的AmPV有较大差异，同源性为94％。AmPV可引起花鳗鲡烂鳃、体表出血等典型症状。

因此，亟需提供一种检测这三种病毒的多重PCR引物组，发明检测试剂盒及优化实验条件，实现这三种病毒的同时检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方便快捷、特异性强、准确率高、且能同时检测鳗鲡疱疹病毒(Eel herpesvirus，EHV)、日本鳗鲡表皮细胞坏死病毒(Japanese eel endothelialcells-infecting virus，JEECV)和花鳗鲡多瘤病毒(Anguilla marmorata polyoma-likevirus，AmPV)的多重PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明提供一种在同一PCR反应体系中同时检测EHV， JEECV和AmPV的多重PCR引物组及多重PCR检测试剂盒，并通过以下技术方案实现：

本发明根据获得的的核酸序列，设计用于扩增EHV，JEECV和AmPV的特异性引物，避免引物之间形成稳定的引物二聚体，并对引物扩增序列的特异性进行分析，获得由6条核酸序列组成，可同时对EHV，JEECV和AmPV 具有高的扩增灵敏性和特异性的引物组，包括：SEQID NO：1-6；具体的，可以分为由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的用于检测 EHV的引物组1，由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的用于检测JEECV的引物组2和由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的用于检测AmPV的引物组3组成。

引物对的特异性检测结果表明，该PCR反应体系特异性好。检测EHV的引物组1对锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)、鳗鲡虹彩病毒(Eel iridovirus，EIV)等同源性较近的病毒无非特异性扩增，检测JEECV的引物组2对AmPV无特异性扩增，检测AmPV的引物组3对JEECV无特异性扩增。

引物对的灵敏性试验结果表明，该多重PCR检测方法均可以检测最低10 个拷贝的EHV，JEECV和AmPV。

EHV，JEECV和AmPV多重PCR检测试剂盒包括上述6条核酸序列组成的引物组，PCR缓冲液，dNTP，Taq DNA聚合酶，ddH₂O及阳性对照DNA 质粒组成。其中，阳性对照质粒为连接pMD19-T载体的EHV，JEECV和AmPV 的扩增序列，浓度均为108拷贝/μL，扩增的DNA序列如下：

EHV质粒pMD19-EHV的***序列为SEQ ID No.7；

JEECV质粒pMD19-JEECV的***序列为SEQ ID No.8；

AmPV质粒pMD19-AmPV的***序列为SEQ ID No.9。

用上述检测引物组及检测试剂盒进行EHV，JEECV和AmPV的多重PCR 检测的方法如下：

制备待测样品DNA模板

利用组织基因组DNA提取试剂盒或病毒基因组DNA提取试剂盒提取待检样品中的基因组DNA。

PCR检测

取2μL上述方法中提取的样品DNA作为PCR模板，在冰上配制如下PCR 反应体系：

置于PCR仪进行PCR扩增，扩增条件为：

预变性：94℃3分钟；

循环：94℃变性10秒，60℃退火15秒，72℃延伸45秒，40个循环；

延伸：72℃5分钟；

结果判定

取10μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行电泳，如果电泳结果在240bp 位置有扩增条带，表示病料中具有EHV；如果电泳结果在505bp位置有扩增条带，表示病料中具有JEECV；如果电泳结果在793bp位置有扩增条带，表示病料中具有AmPV。如果电泳结果同时出现多条条带，表示病料中具有与条带大小对应病毒的混合感染。如果在上述三处位置均无可见扩增条带，表示病料中无上述三种病毒。

本发明还包括引物组在制备同时检测鳗鲡疱疹病毒EHV、日本鳗鲡表皮细胞坏死病毒JEECV和花鳗鲡多瘤病毒AmPV的制品中的应用。所述的制品包括用于检测三种鱼类病毒的试剂盒、基因探针、基因芯片等。其中，基因探针、基因芯片的制作方法可参考现有技术。

本发明提供的多重PCR检测引物组、检测试剂盒及检测方法，可在同一 PCR反应体系中同时检测和鉴别EHV，JEECV和AmPV，具有操作简便，特异性强等优点；而且本发明可根据扩增长度的不同直接判定结果，更高效、实用。

附图说明

图1是利用引物组1、引物组2、引物组3进行扩增特异性鉴定的电泳图。 M：DL2000标准分子量Marker；1：EHV；2：KHV；3：EIV；4：JEECV； 5：AmPV；6：AmPV；7：JEECV；

图2是利用引物组和试剂盒鉴定EHV，JEECV，AmPV的电泳图。M： DL2000标准分子量Marker；1：EHV；2：JEECV；3：AmPV；

图3是利用引物组和试剂盒鉴定EHV，JEECV，AmPV的灵敏度电泳图。M：DL2000标准分子量Marker；1：108copies；2：107copies；3： 106copies；4：105copies；5：104copies；6：103copies；7：102copies；8： 100copies；9：阴性对照；

图4是利用上述引物组和试剂盒鉴定EHV,JEECV，AmPV病料的电泳图。M：DL2000标准分子量Marker；1：阳性对照；2：EHV和JEECV混合感染；3：EHV和AmPV混合感染；4：EHV；5：JEECV；6：AmPV；7：未检出病料；8：阴性对照；

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

(1)引物的设计与优化

细胞分离、鉴定了8株EHV，克隆了EHV ORF8、ORF95等6个基因的开放阅读框序列，分析其同源性，在保守区设计了6对引物，扩增产物的大小均设定在约250bp。以细胞分离培养的EHV DNA为模板，以常规的PCR 方法进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析。筛选出扩增效率高的引物组1。

细胞分离、鉴定了3份JEECV阳性病料，克隆了JEECV LTLG的开放阅读框序列，分析其同源性，在保守区设计设计了2对引物，扩增产物的大小设定在约500bp。以JEECV阳性病料中提取的基因组DNA为模板，以常规的PCR方法进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析。筛选出扩增效率高的引物组2。

细胞分离、鉴定了5份AmPV阳性病料，克隆了AmPV LTLG的开放阅读框序列，分析其同源性，利用软件Primer Primer 5.0在保守区设计了2对引物，扩增产物的大小设定在约750bp。以AmPV阳性病料中提取的基因组DNA 为模板，以常规的PCR方法进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析。筛选出扩增效率高的引物组3。

(2)病料中基因组DNA的提取

收集鳗鲡疑似病毒性疾病病料，取肝、脾、肾等内脏组织，匀浆后用组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

(3)多重PCR检测的特异性

为检测上述引物组扩增的特异性，用与EHV同源性较高的KHV、EIV为模板检测引物组1扩增EHV的特异性；因为JEECV与AmPV的亲缘关系近，且未见其它鱼类多瘤病毒的报道，因此分别以JEECV和AmPV阳性病料中提取的基因组DNA为模板检测引物组2扩增JEECV的特异性以及引物组3扩增AmPV的特异性。结果表明，检测EHV的引物组1仅能特异性扩增EHV，不能扩增KHV、EIV；检测JEECV的引物组2仅能特异性扩增JEECV，不能扩增AmPV；检测AmPV的引物组3仅能特异性扩增AmPV，不能扩增JEECV (如图1所示)。

(4)多重PCR检测方法的建立

将引物组1、引物组2、引物组3按照1：1：1的比例混合，终浓度均为 10μM。分别在退火温度55、60、65条件下进行PCR扩增，然后通过扩增条件优化，建立如下多重PCR检测方法：10XPCR buffer(Mg2+plus)5μL、dNTP (2.5mM each)4μL、Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL、引物组2μL、补充 ddH₂O至50μL。置于PCR仪进行PCR扩增，扩增条件为：预变性：94预变性：94℃3分钟；循环：94℃变性10秒，60℃退火15秒，72℃延伸45秒， 40个循环；延伸：72℃5分钟。取10μL PCR产物，经1％琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像***观察拍照。以本发明建立的检测方法对细胞培养EHV及JEECV、AmPV阳性病料进行检测，结果均可高效检出相应病毒，未发现非特异性条带(如图2所示)。

(5)多重PCR的灵敏度

分别将用引物组1、引物组2、引物组3扩增的EHV、JEECV、AmPV序列连接至克隆载体pMD19-T，测序验证后，测定DNA含量，计算拷贝数，然后将三种质粒按照拷贝数1：1：1混合，浓度为108拷贝/μL，作为试剂盒的阳性对照。将阳性对照进行10倍的梯度稀释，用建立的多重PCR检测方法进行检测。结果表明，该方法可特异性检出最低10个拷贝的EHV、JEECV、AmPV(如图3所示)。

(6)多重PCR检测的阳性鳗鲡病料

为验证上述多重PCR检测方法的有效性，选择用常规PCR方法检测 EHV、JEECV、AmPV阳性的病料、混合感染病料及未检出病料，用上述多重PCR检测方法对病料进行检测，分别检出EHV、JEECV、AmPV阳性病料，及EHV和JEECV、EHV和AmPV混合感染的阳性病料，结果与用常规PCR 方法检测的结果完全一致(如图4所示)。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院生物技术研究所

<120> 同时检测三种鱼类病毒的多重PCR引物组、试剂盒及方法

<130> 2017

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actctggctc gcaaccaatc t 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccaccaaaca acccagcaca atc 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccaccagag gaaagacaaa gac 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

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<400> 4

caccgggttt gtctcatctt cca 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ataggttcgt gctgtccttc aa 22

<210> 6

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<212> DNA

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<400> 6

aaagggactg ccacctgaga tt 22

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

actctggctc gcaaccaatc tcagtctgtc agagattgtg gtcggagaaa attgcagcgg 60

tgtggactgg aaacaggtgc aaggagtgtg gtgcaattca acatactgtc cccagatgat 120

gagatcggaa gatgtggagt ctatgaggtc cgccatcgtc cacgttctgg agtcagagtc 180

gccgtttgac aagcagttca agtttggatc ctacgtgact ctgattgtgc tgggttgttt 240

<210> 8

<211> 505

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccaccagag gaaagacaaa gactggagca aaggctgaaa aggataaatg aggtatgggc 60

aaaatacctg gacatccatc agagacaaca gacgtggttt gacatatccc ccagtaaaag 120

ggggggcacg ctgactgtac ctgaatacct ggctaaatat tgcactacta tacaggatgg 180

tcagtttgtg cagactgtac tggtgcaggt gccctgggct aagctgggat cagtggtcac 240

agaactgaaa aaatacaaac atgtagatct aattgcaggc ggggaccccc gggaggaccc 300

cccaacaggc atagcagttg tgcaatttgt gcataggcaa aaggaatctg cattgaaggg 360

aaaatgcaat gctgtgacac ttgtgtgcaa tgtgatgcag gtagcaaata aatcatttac 420

tactgttaag caaatatgcc tagcgtattg gaaggaaaat accacagagc acggtcacgt 480

gatggaagat gagacaaacc cggtg 505

<210> 9

<211> 793

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atagggttcg tgctgtcctt caaaaggtca tctaggattt cggacagtct ttccatgtaa 60

aattcctgct cagttattgt ttggtatttc aacctttgat gcgccatcac tgttacagtc 120

gcattggcag ctaaacgttt cttgtccttt ttgcagctga aattgctgtg cattgttgaa 180

atgagtttga tgcaaattgt aatggctttc tgggtttctg acctcctcct gtgagggctc 240

tacacatcta gagcagtcgt caggtttgat tgctaattta tcatagttgc ctatgacagc 300

caggcagtct gtgaacccaa acaccatagc aaactcattt aacaacttaa tgctgaacgc 360

attctcgttt gcatcaccct cactgtcatt gaattcatga gactcagcga tggatggctg 420

actacagcga tcatgcaccg gctgacacct tagcctcagt ttgtgaactg attgggccca 480

cttcttggca agaacaaccc gtaccaggca gtgattgaca gatgtaaaca aagttttaag 540

cacattccga agcctagttt gcctatgagg actttgaaat cgcacaagtt gtacgaacat 600

gttgctatca tactcttcat aacaccctgt gacagtaccc tccacatccc ccacacttcc 660

caatgcagcc tgtacaacat catatttgca cctggaataa aacagcagaa gacaatgaac 720

agtgctgtgt gtgttcaaag ccttactcaa aaagtcctga aacaaaggag gaatctcagg 780

tggcagtccc ttt 793

Claims

1.一种用于同时检测鳗鲡疱疹病毒EHV、日本鳗鲡表皮细胞坏死病毒JEECV和花鳗鲡多瘤病毒AmPV的多重PCR引物组，其特征在于，所述的引物组中引物的序列分别为SEQ ID NO：1-6。

2.权利要求1所述的引物组在制备同时检测鳗鲡疱疹病毒EHV、日本鳗鲡表皮细胞坏死病毒JEECV和花鳗鲡多瘤病毒AmPV的制品中的应用。

3.一种用于同时检测鳗鲡疱疹病毒EHV、日本鳗鲡表皮细胞坏死病毒JEECV和花鳗鲡多瘤病毒AmPV的多重PCR检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，dNTPs混合溶液，引物组，Taq DNA聚合酶和灭菌去离子水，及可做为阳性对照的DNA质粒，其特征在于：所述检测引物组为权利要求1所述的多重PCR引物组。

4.一种同时检测鳗鲡疱疹病毒EHV、日本鳗鲡表皮细胞坏死病毒JEECV和花鳗鲡多瘤病毒AmPV的方法，其特征在于，

1)从待测样品中提取待检测病毒基因组DNA；

2)进行多重PCR扩增和产物标定；

在50μL PCR的反应体系中包含有Mg²⁺浓度为15mmol/L的10XPCR buffer 5μL，2.5mM/L的dNTPs 4μL，Taq酶0.5μL，10μM/L的引物组2μL，步骤1)中提取的待检测病毒基因组DNA 2μL作为模板，补充ddH₂O至50μL；

PCR扩增条件为：94℃变性3分钟，94℃10秒钟，60℃15秒钟，72℃45秒钟，40个循环，72℃延伸5分钟；

3)结果判定：取10μL步骤2)中的PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，其中鳗鲡疱疹病毒EHV阳性条带位于240bp；日本鳗鲡表皮细胞坏死病毒JEEC阳性条带位于505bp；花鳗鲡多瘤病毒AmPV阳性条带位于793bp；若无对应条带，则为对应病毒检测为阴性；若电泳结果同时出现与对应病毒阳性条带大小一致的多个条带，则判定为对应病毒的共感染。