CN104164486B - 一种桉树焦枯病原菌的lamp检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种桉树焦枯病原菌的lamp检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种桉树焦枯病原菌的LAMP检测试剂盒及其使用方法。本发明的试剂盒包括：(1)10×Thermopol Ⅱ；(2)100mM MgCl2；(3)2.5mM dNTPs；(4)5M甜菜碱溶液；(5)ddH2O；(6)40μM的内引物FIP和BIP，10μM的外引物F3和B3；10μM的环状引物LooPF和LooPB；(7)8U Bst DNA聚合酶大片；(8)SYBR Green I荧光染料。本发明能够快速准确定对桉树焦枯病原菌引起的多种林木病害进行分子鉴定病害的早期诊断。

Description

一种桉树焦枯病原菌的LAMP检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种桉树焦枯病原菌的LAMP检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
桉树(Eucalyptusspp.)是桃金娘科(Myrtaceae)桉树属植物的总称，是世界著名的速生树种，也是我国重要的三大速生用材树种之一。由于其具有品质优良，生长迅速，适应性强，用途广泛，以及较高的经济回报效率等特点而被在我国广泛引种，并大量栽培于广东、广西、福建、四川、云南、海南等南方地区。目前，由Cylindrocladiumscoparium(桉树焦枯病原菌)引起的桉树焦枯病被定义为一种世界性病害，严重威胁着澳大利亚、美国、中国、巴西、日本、印度尼西亚、泰国、越南等几十个桉树种植较为密集的国家。桉树焦枯病主要侵害桉树4龄及其以下的苗木，桉树焦枯病原菌侵染植株林区后，轻者易造成植株萎蔫及落枝、落叶等现象；重者则会出现感病苗木叶片全部脱落、顶枯、植株枝条全部枯死等现象，危害十分严重。由于桉树焦枯病可造成严重的经济损失，严重影响桉树生产林的建设，因此我国在1996年1月5日便将其列入森林植物检疫对象。因此检测桉树是否携带焦枯病原菌对于桉树焦枯病的防治意义重大，同时也是减少桉树经济损失的重要保障。
目前，经报道，在中国广西、福建、海南、四川等多个省市和地区具有桉树焦枯病的发生，其病原菌主要以Cylindrocladiumscoparium(桉树焦枯病原菌)为主。桉树焦枯病发生面积甚广，已严重威胁着中国现今桉树的林业生产建设。为此，亟需建立快速灵敏的检测方法，为桉树焦枯病的防治提供依据。
近年来，分子生物学技术发展迅速，已广泛应用于植物病原真菌的分类鉴定中。PCR技术及基于PCR的检测方法快速、准确、灵敏，在植物病害的检测上发挥着不可替代的作用。LAMP(Loop-mediatedisothermalamplification)，又称“环介导等温扩增反应”，是日本学者Notomi等发明的一种新型、快速、简便的核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件(一般在60-65℃之间)反应30-75分钟，即可实现核酸的快速扩增，目前已被广泛的应用于细菌、病毒、寄生虫的快速检测，但在真菌上的应用报道相对较少。与常规的PCR反应相比，LAMP方法操作简单，不需昂贵的PCR反应仪器即可实现病原菌的快速检测，且判断结果更为人性化，仅需加入荧光染色剂用肉眼判断，特异性和灵敏度也相对常规PCR反应高。
迄今为止，国内外对桉树焦枯病原菌在快速检测方面的报道仍处于空白，因此建立高效、快速的桉树焦枯病原菌(Cylindrocladiumscoparium)LAMP检测技术势在必行，同时为桉树焦枯病的发生和防治提供重要的技术手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在检测桉树焦枯病原菌中存在的不足，提供了一种桉树焦枯病原菌的LAMP检测试剂盒及其使用方法。
本发明的技术方案如下：
一种桉树焦枯病原菌的LAMP检测试剂盒，其包括：
(1)10×ThermopolⅡ；
(2)100mMMgCl2；
(3)2.5mMdNTPs；
(4)5M甜菜碱溶液；
(5)ddH2O；
(6)40μM的内引物FIP和BIP，10μM的外引物F3和B3；10μM的环状引物LooPF和LooPB；其中，前内引物FIP的序列为5＇－TGCGCGCTCTTTCGCTACATACACAACGGTACCTCCGACC－3＇，后内引物BIP的序列为5＇－CGCTCACCCTGCGAGAAACAGCGCGAGGAACATACTTGTT－3＇，前外引物F3的序列为5＇－CTCGACAGCAATGGTGTCT－3＇，后外引物B3的序列为5＇－GCTCAAGATCGACGAGGAC－3＇，环状引物LooPF的序列为5＇－GTAGACGTTCATGCGCTCC－3＇，环状引物LooPB的序列为5＇－ATTATTTGTGAGTGTGATAG－3＇；
(7)8UBstDNA聚合酶大片段；
(8)SYBRGreenI荧光染料。
所述的LAMP检测试剂盒的使用方法，其步骤如下：
(1)提取纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA；
(2)所述的反应体系50μL，包含：10×ThermopolⅡ2.5μl；100mMMgCl22μl；2.5mMdNTPs3.5μl；5M甜菜碱溶液3.0μl；ddH2O33.0μl；40μM内引物FIP/BIP各1μl；10μM外引物F3/B3各0.5μl；10μM环状引物LooPF/LooPB各1μl；8UBstDNA聚合酶大片段1μl；加纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA提取液2.0μL，组成反应混合液；
(3)PCR反应条件为：将反应混合液置于65℃的水浴锅中反应65min，随后80℃灭活3min结束反应；
(4)结果判定：①用肉眼观察反应液是否为白色浑浊，白色浑浊即为阳性，否则为阴性；②将反应产物PCR管放在紫外灯下照射，若有白色则说明样品中存在桉树焦枯病原菌，无白色则说明不含桉树焦枯病原菌；③在扩增产物中加入SYBRGreenI荧光染料观察颜色变化，反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，颜色保持不变为阴性；④扩增结束后取5.0μLPCR产物上样于含0.5μg/mLEB的2％琼脂糖凝胶上电泳，电压为9V/cm、时间为30min，在凝胶成像***上检测并拍照，观察是否产生特征性梯状电泳条带，有条带则说明样品中存在桉树焦枯病原菌，无条带则说明不含桉树焦枯病原菌。
本发明提供了用于桉树焦枯病原菌(Cylindrocladiumscoparium)LAMP检测的特异性引物组F3(前外引物)、B3(后外引物)、FIP(前内引物)、BIP(后内引物)、LooPF(环状引物)、LooPB(环状引物)及含有该引物组的LAMP试剂盒。本发明可快速准确定对桉树焦枯病原菌(Cylindrocladiumscoparium)引起的多种林木病害进行分子鉴定病害的早期诊断，对控制桉树焦枯病原菌(Cylindrocladiumscoparium)的检疫及病害的防治具有重要意义。
本发明利用beta-tubulingene保守区序列，比对后通过LAMP在线软件4.0(https://primerexplorer.jp/e/)进行桉树焦枯病原菌LAMP特异性引物组的设计。该方法可以克服传统病菌鉴定所存在的可靠性较低，费时费力，需要较高的专业技术知识，难掌握，不能准确判定等缺点，提高了病害检测的准确性，为其它病害的分子检测提供技术参考，为桉树焦枯病原菌为对象的鉴定和检测提供重要参考价值。
附图说明
图1为桉树焦枯病原菌LAMP检测技术实现图。
图2为LAMP紫外灯照射下检查结果；图中，1-4为桉树焦枯病原菌，5-12分别为表1中所对应参试菌，13为阴性对照。
图3为电泳检查结果；图中，泳道M为DL2000Marker，泳道1-4为桉树焦枯病原菌，泳道5-12分别为表1中所对应参试菌，泳道CK为阴性对照。
图4为灵敏度电泳检查结果；图中，泳道M为标准分子量大小，泳道CK为阴性对照，泳道1-6的桉树焦枯病原菌Cylindrocladiumscoparium基因组DNA浓度分别为400ng/μL，40ng/μL，4.0ng/μL，400pg/μL，40pg/μL，4.0pg/μL。
图5为桉树焦枯病原菌(Cylindrocladiumscoparium)的LAMP检测流程。
图6为紫外灯照射检查结果；图中，1-7分别为乐山、攀枝花、雅安、广元、新津、重庆、资阳7个地区的桉树焦枯病组织样品，8为健康组织样品，9为阴性对照。
图7为电泳检查结果；图中，1-7泳道分别为乐山、攀枝花、雅安、广元、新津、重庆、资阳7个地区的桉树焦枯病组织样品，8为健康组织样品，泳道CK为阴性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
图1为桉树焦枯病原菌LAMP检测技术实现图。
主要试剂：DNA提取试剂盒及回收试剂盒均购自天根生化科技公司，引物合成及PCR产物测序交由上海生工生物工程公司完成。
1、桉树焦枯病原菌的LAMP检测引物组的设计
(1)beta-tubulingene区引物设计：对分离自四川雅安，攀枝花，广元、乐山桉树栽培区的桉树焦枯病原菌纯化培养，其桉树焦枯病原菌及其他参试菌株信息详见表1。将菌株接种在PDA平板，28℃培养5d，使用打孔器取直径为5mm的菌饼分别转接至含有200mL马铃薯-葡萄糖液体(PDB)的锥形瓶中，置于28℃摇床振荡(转速140r/min)培养8d。用灭菌纱布过滤菌丝体后，收集菌丝，灭菌蒸馏水冲洗3次，冷冻干燥，存入灭菌EP管中于-20℃冰箱备用。
表1桉树焦枯病原菌及其它参试菌株
真菌基因组DNA提取采用CTAB法或试剂盒提取。以CTAB对病原菌总DNA提取实现为例。
1)取少量菌丝置于研钵中，加液氮后迅速研磨，至菌丝呈白色粉末状；
2)迅速转移适量粉末于1.5mLEP管中，加入800μL的裂解液(1mlLysisBuffer(150mmol/LEDTA，50mmol/LTrisPH8.0，3％SDS))，混匀后于65℃水浴1h；离心(12000r/min，4℃)l0min，取上清；
3)加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1(v/v/v)混合有机溶剂，离心(12000r/min，4℃)10min，取上清；
4)重复操作3)方法2次；
5)加入2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积3mol/L的醋酸钠溶液，-20℃沉淀1h后离心(12000r/min，4℃)10min，弃上清；
6)75％的酒精冲洗3次，待晾干后加入25μLddH2O溶解沉淀；
7)吸取5μL的DNA用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，其余DNA样品置于-20℃冰箱备用。
利用Cylindrocladium属真菌beta-tubulingene区通用引物BT-T1-S(5＇－AACATGCGTGAGATTGTAAGT－3＇)和BT-CYLTUBIR-A(5＇－AGTTGTCGGGACGGAAGAG－3＇)对Cylindrocladiumscoparium及所有参试真菌进行常规PCR扩增，扩增体系和程序如下：
PCR扩增体系(50μL)：10×PCRBuffer5.0μL，25mmol/LMg2+3μL，10mmol/LdNTP1.5μL，BT-T1-S(10pmol/μL)1.5μL，BT-CYLTUBIR-A(10pmol/μL)1.5μL，Tag聚合酶(5U/μL)0.3μL，ddH2O33.2μL，模板DNA4.0μL。
PCR反应条件：94℃热启动4min；94℃变性46s，54℃退火30s，72℃延伸40s，循环35次，最后72℃延伸8min。
PCR产物送往上海生工生物工程公司进行测序。根据测序结果，结合GENEbank中已知Cylindrocladium属菌株的beta-tubulingene区序列，比对后利用LAMP在线软件4.0(https://primerexplorer.jp/e/)其β微管蛋白保守区进行桉树焦枯病原菌LAMP特异性引物组的设计，通过基因库Blast比对验证引物的特异性。
设计的引物序列组如下：
F3(前外引物)：5＇－CTCGACAGCAATGGTGTCT－3＇
B3(后外引物)：5＇－GCTCAAGATCGACGAGGAC－3＇
FIP(前内引物)：5＇－TGCGCGCTCTTTCGCTACATACACAACGGTACCTCCGACC－3＇
BIP(后内引物)：5＇－CGCTCACCCTGCGAGAAACAGCGCGAGGAACATACTTGTT－3＇
LooPF(环状引物)：5＇－GTAGACGTTCATGCGCTCC－3＇
LooPB(环状引物)：5＇－ATTATTTGTGAGTGTGATAG－3＇
2、LAMP反应体系的建立
采用设计好的LAMP特异性引物组，分别以供试菌株作为模版进行进行LAMP反应，同时以加入等量ddH2O作模板扩增作为阴性对照。反应体系(50μL)中各组分的含量如表2所示。反应体系配好后混匀，置于65℃的水浴锅中反应65min，随后80℃灭活3min结束反应。反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳130V下40min，然后拍照观察。
反应所需的化学试剂：BstDNA聚合酶大片段(NEB，英国)；5M甜菜碱溶液(Sigma，美国)；硫酸镁、硫酸铵、氯化钾、Tris碱、脱氧核苷三磷酸(dNTP)(天根生化科技有限公司，北京)；SYBRGreenI(Sigma，美国)；100mMMgCl2；10×ThermopolⅡ(200mMTris-HCl；100mM(NH4)2SO4；100mMKCl；1％TritonX-100pH8.8)(NEB，英国)。
表2LAMP反应体系
3、LAMP反应结果的判断
1)采用肉眼观察
判断反应结果只需肉眼观察即可，若发生反应则反应液是为白色浑浊(白色浑浊即为阳性，否则阴性)，肉眼初步判断结果显示：Cylindrocladiumscoparium病原菌反应结束后可以看到白色浑浊液体，实质上是发生扩增反应后生产的焦磷酸物质，而对照组和参试菌没有发生变化。
2)紫外灯照射下拍照
紫外灯照射反应液结果显示(如图2所示)：Cylindrocladiumscoparium病原菌反应结束后可以看到白色浑浊液体，实质上是发生扩增反应后生产的焦磷酸物质，而对照组和参试菌没有发生变化。
3)添加荧光染料SYBRGreenI
在扩增产物中加入SYBRGreenI荧光染料观察颜色变化，反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，否则颜色保持不变。添加荧光染料SYBRGreenI结果显示：Cylindrocladiumscoparium病原菌反应结束后可以看到淡绿色液体，而对照组和参试菌没有发生变化，其颜色为SYBRGreenI本身颜色。
4)电泳检测
LAMP反应结束后，扩增结束后取5.0μLPCR产物上样于含0.5μg/mLEB的2％琼脂糖凝胶上电泳，电压为9V/cm、时间为30min，在凝胶成像***上检测并拍照。观察是否产生特征性梯状电泳条带，以证实是否发生了LAMP扩增反应。电泳检测结果显示(如图3所示)：病原菌组均产生瀑布形特征条带，且进一步对反应产物进行酶切结果分析，经DNAMAN分析软件分析，最终的扩增产物可被TAP1小花成短小片段。酶切反应体系为：Tap11μl，10×Tap1BasalBuffer2μl，0.1％BSA2μl，LAMP反应产物1μl，灭菌水补充至20μl，65℃反应2h。将反应后的产物送至上海生工有限公司测序，得到大小191bp和89bp大小的两条片段，与理论推导值相吻合，进一步说明检测成功。
实施例2LAMP反应DNA敏感度检测
分别稀释桉树焦枯病原菌Cylindrocladiumscoparium基因组DNA到：400ng/μL，40ng/μL，4.0ng/μL，400pg/μL，40pg/μL，4.0pg/μL浓度梯度，用于LAMP灵敏度检测。
LAMP反应体系和程序同实施例1。结果显示(图4)，LAMP具有较高检测灵敏度，可达到40pg/μL，完全符合田间检测的要求。
实施例3构建桉树焦枯病原菌(Cylindrocladiumscoparium)的LAMP检测试剂盒
1、检测试剂盒组分(50μL体系)包括：10×ThermopolⅡ2.5μl；MgCl2(100mM)2μl；dNTPs(2.5mM)3.5μl；甜菜碱溶液(5M)3.0μl；ddH2O33.0μl；内引物(40μM)各1μl；外引物(10μM)各0.5μl；环状引物(10μM)各1μl；BstDNA聚合酶大片段(8U)1μl。
2、桉树焦枯病原菌(Cylindrocladiumscoparium)的LAMP检测试剂盒的使用方法，其步骤如下：
(1)提取纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA；
(2)所述的反应体系(50μL)包含：10×ThermopolⅡ2.5μl；MgCl2(100mM)2μl；dNTPs(2.5mM)3.5μl；甜菜碱溶液(5M)3.0μl；ddH2O33.0μl；内引物(40μM)各1μl；外引物(10μM)各0.5μl；环状引物(10μM)各1μl；BstDNA聚合酶大片段(8U)1μl；加纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA提取液2.0μL，组成反应混合液。
(3)PCR反应条件为：将反应混合液置于65℃的水浴锅中反应65min，随后80℃灭活3min结束反应。
(4)结果判定：①用肉眼观察反应液是否为白色浑浊，白色浑浊即为阳性，否则为阴性；②将反应产物PCR管放在紫外灯下照射，若有白色则说明样品中存在桉树焦枯病原菌，无白色则说明不含桉树焦枯病原菌；③在扩增产物中加入SYBRGreenI荧光染料观察颜色变化，反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，颜色保持不变为阴性；④扩增结束后取5.0μLPCR产物上样于含0.5μg/mLEB的2％琼脂糖凝胶上电泳，电压为9V/cm、时间为30min，在凝胶成像***上检测并拍照，观察是否产生特征性梯状电泳条带，有条带则说明样品中存在桉树焦枯病原菌，无条带则说明不含桉树焦枯病原菌。
实施例4桉树焦枯病原菌(Cylindrocladiumscoparium)的LAMP检测试剂盒检测野外发病植株
图5为桉树焦枯病原菌(Cylindrocladiumscoparium)的LAMP检测流程。
1、基因组DNA提取
以CTAB法对病原菌总DNA提取实现为例。
(1)用解剖刀切取一段50-100mg疑是发病组织叶片或茎枝，75％酒精表面消毒，在蒸馏水下冲洗干净，用吸水纸吸干水后，转移至研钵中用液氮迅速研磨(为易于研磨可适当剪碎)为粉末状，装入1.5mL离心管。
(2)迅速转移适量粉末于1.5mLEP管中，加入800μL的裂解液(1mlLysisBuffer(150mmol/LEDTA，50mmol/LTrisPH8.0，3％SDS))，混匀后于65℃水浴1h；离心(12000r/min，4℃)l0min，取上清；
(3)加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1(v/v/v)混合有机溶剂，离心(12000r/min，4℃)10min，取上清；
(4)重复操作(3)方法2次；
(5)加入2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积3mol/L的醋酸钠溶液，-20℃沉淀1h后离心(12000r/min，4℃)10min，弃上清；
(6)75％的酒精冲洗3次，待晾干后加入25μLddH2O溶解沉淀；
(7)吸取5μL的DNA用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，其余DNA样品置于-20℃冰箱备用。
加入50-100μL1×TE溶液溶解后即得到菌株DNA溶液，-20℃保存。
若用试剂盒提取菌丝基因组或病组织DNA，可依TIANGEN公司PlantGenomicDNAKit说明书所述的方法提取。
2、利用试剂盒对所提DNA进行LAMP扩增
LAMP扩增体系(50μl)：10×ThermopolⅡ2.5μl；MgCl2(100mM)2μl；dNTPs(2.5mM)3.5μl；甜菜碱溶液(5M)3.0μl；ddH2O33.0μl；内引物(40μM)各1μl；外引物(10μM)各0.5μl；环状引物(10μM)各1μl；BstDNA聚合酶大片段(8U)1μl；植物组织基因组DNA提取液2.0μL，组成反应混合液。
LAMP扩增程序：置于65℃的水浴锅中反应65min，随后80℃灭活3min结束反应。
3、结果判定
①用肉眼观察反应液是否为白色浑浊，白色浑浊即为阳性，否则为阴性；②将反应产物PCR管放在紫外灯下照射，若有白色则说明样品中存在桉树焦枯病原菌，无白色则说明不含桉树焦枯病原菌；③在扩增产物中加入SYBRGreenI荧光染料观察颜色变化，反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，颜色保持不变为阴性；④扩增结束后取5.0μLPCR产物上样于含0.5μg/mLEB的2％琼脂糖凝胶上电泳，电压为9V/cm、时间为30min，在凝胶成像***上检测并拍照，观察是否产生特征性梯状电泳条带，有条带则说明样品中存在桉树焦枯病原菌，无条带则说明不含桉树焦枯病原菌。
4、用LAMP试剂盒分别对乐山、攀枝花、雅安、广元、新津、重庆、资阳7个地区的桉树栽培园区内的疑似桉树焦枯病进行采样，参照所述方法进行LAMP扩增。采用紫外灯照射和电泳检测判断反应结果如图6和图7。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种桉树焦枯病原菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，其包括：
(1)10×ThermopolⅡ；
(2)100mMMgCl2；
(3)2.5mMdNTPs；
(4)5M甜菜碱溶液；
(5)ddH2O；
(6)40μM的内引物FIP和BIP，10μM的外引物F3和B3；10μM的环状引物LooPF和LooPB；其中，前内引物FIP的序列为5＇－TGCGCGCTCTTTCGCTACATACACAACGGTACCTCCGACC－3＇，后内引物BIP的序列为5＇－CGCTCACCCTGCGAGAAACAGCGCGAGGAACATACTTGTT－3＇，前外引物F3的序列为5＇－CTCGACAGCAATGGTGTCT－3＇，后外引物B3的序列为5＇－GCTCAAGATCGACGAGGAC－3＇，环状引物LooPF的序列为5＇－GTAGACGTTCATGCGCTCC－3＇，环状引物LooPB的序列为5＇－ATTATTTGTGAGTGTGATAG－3＇；
(7)8UBstDNA聚合酶大片段；
(8)SYBRGreenI荧光染料。
2.根据权利要求1所述的LAMP检测试剂盒的使用方法，其特征是，其步骤如下：
(1)提取纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA；
(2)反应体系50μL，包含：10×ThermopolⅡ2.5μl；100mMMgCl22μl；2.5mMdNTPs3.5μl；5M甜菜碱溶液3.0μl；ddH2O33.0μl；40μM内引物FIP/BIP各1μl；10μM外引物F3/B3各0.5μl；10μM环状引物LooPF/LooPB各1μl；8UBstDNA聚合酶大片大片段1μl；加纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA提取液2.0μL，组成反应混合液；
(3)PCR反应条件为：将反应混合液置于65℃的水浴锅中反应65min，随后80℃灭活3min结束反应；
(4)结果判定：①用肉眼观察反应液是否为白色浑浊，白色浑浊即为阳性，否则为阴性；②将反应产物PCR管放在紫外灯下照射，若有白色则说明样品中存在桉树焦枯病原菌，无白色则说明不含桉树焦枯病原菌；③在扩增产物中加入SYBRGreenI荧光染料观察颜色变化，反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，颜色保持不变为阴性；④扩增结束后取5.0μLPCR产物上样于含0.5μg/mLEB的2％琼脂糖凝胶上电泳，电压为9V/cm、时间为30min，在凝胶成像***上检测并拍照，观察是否产生特征性梯状电泳条带，有条带则说明样品中存在桉树焦枯病原菌，无条带则说明不含桉树焦枯病原菌。
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