CN110791554A - 一种微量dna的定量方法 - Google Patents

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CN110791554A CN201911082549.9A CN201911082549A CN110791554A CN 110791554 A CN110791554 A CN 110791554A CN 201911082549 A CN201911082549 A CN 201911082549A CN 110791554 A CN110791554 A CN 110791554A
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唐嘉婕
李文涛
徐辉
杨敬敏
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明提供一种微量DNA的定量方法，至少包括以下步骤：设计内标模板；设计能够同时扩增目标模板和内标模板的引物对；利用所述引物对，将待测DNA序列和内标模板混合后进行PCR扩增；将扩增产物用二代测序平台对应的接头引物对进行再次扩增，获得二代测序文库；对所述二代测序文库进行二代测序平台测序；根据公式待测DNA的拷贝数=C*A1/A2，计算得目标模板的拷贝数，即为待测DNA的拷贝数；其中，C为内标模板的拷贝数；A1为目标模板序列的测序覆盖深度；A2为内标模板序列的测序覆盖深度。本发明不仅可以准确定量微量DNA，还可以直接读取目标DNA模板的序列，定量结果准确性不受非特异性扩增的影响。

Description

一种微量DNA的定量方法
技术领域
本发明涉及生物信息学和生物技术领域，特别是涉及一种微量DNA的定量方法。
背景技术
在分子生物学研究工作中，常常需要知道微量甚至痕量DNA的准确浓度，或者需要检测DNA中特定稀有模板的拷贝数。常见的DNA定量手段主要有紫外分光光度法和荧光染料法。紫外分光光度法定量操作简单，对设备的要求也低。缺点是灵敏度和特异性都较低，只能测得总核酸量，不能区分核酸的种类，并且易受样品中其他杂质的干扰(如蛋白、盐类、有机物质等)。荧光染料法是基于荧光染料与核酸分子结合发出荧光信号的强度与结合的核酸分子数成正比的原理，灵敏度和特异性都较高，但仍然受DNA浓度的限制，无法准确检测或检测不到微量DNA，且会受到其他类型核酸的干扰。紫外分光光度法和荧光染料法均无法检测DNA中特定序列模板的拷贝数。
近年来，荧光定量PCR和数字PCR常常用于微量DNA及特定序列模板拷贝数的定量。荧光定量PCR是通过荧光基团发出荧光信号的积累来实时检测PCR的反应过程，最后通过相对定量或绝对定量的方法对未知浓度的核酸进行定量分析。但是在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微时，其检测灵敏度、精确度都受到了限制。数字PCR通过将微量样品做大倍数分级稀释和分液，再将所有细分样品在相同条件下进行PCR扩增，使含有1个目标分子的细分样品中的目标分子放大几百万倍，产生非常强的荧光信号，然后对发生了扩增反应的细分样品进行计数，使用泊松统计将阳性信号的计数转换为一个绝对值，即获得原始样品中所含目标核酸的绝对定量拷贝数。数字PCR可以直接计数目标分子，不再依赖任何校准物或外标，可确定低至单个待测分子的绝对数目。但荧光定量PCR和数字PCR都是基于荧光信号的有无和高低来反应DNA或特定模板的量，无法直接读取DNA序列，其准确性和可靠性都十分基于引物和探针的设计。结果的准确性可能会受到非特异性扩增的影响。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种微量DNA的定量方法。所述定量方法至少包括以下步骤：
(1)设计内标模板，所述内标模板与目标模板的序列仅有一个或几个碱基不一致；所述目标模板为待测DNA序列的一段或全部；
(2)设计扩增引物对，所述扩增引物对满足以下条件：
能够同时特异性扩增目标模板和内标模板；
所述引物与内标模板的结合部位位于内标模板与目标模板不一致碱基的两侧；
上游引物及下游引物的5’端设有二代测序平台接头互补段；
(3)利用步骤(2)获得的引物对，将待测DNA序列和已知拷贝数的内标模板混合后进行PCR扩增；
(4)将步骤(3)获得的扩增产物用二代测序平台对应的接头引物对进行再次扩增，获得二代测序文库；
(5)对所述二代测序文库进行二代测序平台测序；
(6)根据步骤(5)中的测序结果，根据公式(I)，计算得目标模板的拷贝数，即为待测DNA的拷贝数；
待测DNA的拷贝数＝C*A1/A2 (I)
其中，C为内标模板的拷贝数；
A1为目标模板序列的测序覆盖深度；
A2为内标模板序列的测序覆盖深度。
本发明还提供前述的微量DNA的定量方法在DNA定量领域的用途。
如上所述，本发明的微量DNA的定量方法，具有以下有益效果：
本发明不仅可以准确定量微量DNA，还可以直接读取目标DNA模板的序列，定量结果准确性不受非特异性扩增的影响。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，如本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
本发明的微量DNA的定量方法，至少包括以下步骤：
(1)设计内标模板，所述内标模板与目标模板的序列仅有一个或几个碱基不一致；所述目标模板为待测DNA序列的一段或全部；
(2)设计扩增引物对，所述扩增引物对满足以下条件：
能够同时特异性扩增目标模板和内标模板；
所述引物与内标模板的结合部位位于内标模板与目标模板不一致碱基的两侧；
上游引物及下游引物的5’端设有二代测序平台接头互补段；
(3)利用步骤(2)获得的引物对，将待测DNA序列和已知拷贝数的内标模板混合后进行PCR扩增；
(4)将步骤(3)获得的扩增产物用二代测序平台对应的接头引物对进行再次扩增，获得二代测序文库；
(5)对所述二代测序文库进行二代测序平台测序；
(6)根据步骤(5)中的测序结果，根据公式(I)，计算得目标模板的拷贝数，即为待测DNA的拷贝数；
待测DNA的拷贝数＝C*A1/A2 (I)
其中，C为内标模板的拷贝数；
A1为目标模板序列的测序覆盖深度；
A2为内标模板序列的测序覆盖深度。
测序数据中可以直接读取目标模板和内标模板的序列，并通过序列中不一致碱基来区分目标模板和内标模板，分别计算目标模板或内标模板的覆盖深度。由于文库中每个分子在测序中被测到的机会次数是等同的，所以两者覆盖深度(即被测到的次数)的比例，即为两者在文库中拷贝数的比例，即为两者在扩增前初始模板中拷贝数的比例。在内标模板拷贝数已知的前提下，即可计算目标模板的拷贝数。
其中，步骤(1)中，所述内标模板的序列长度可以为10bp-1000bp。具体的，可以为10bp-100bp，100bp-200bp，200bp-300bp，300bp-400bp，400bp-500bp，500bp-600bp，600bp-700bp，700bp-800bp，800bp-900bp，900bp-1000bp，100bp-1000bp，200bp-1000bp，300bp-1000bp，400bp-1000bp，500bp-1000bp，600bp-1000bp，700bp-1000bp，800bp-1000bp。
进一步的，步骤(1)中，当内标模板和目标模板不一致碱基的位置如果正好为SNP位点时，所述内标模板的该位点设计为SNP等位基因外的其他碱基。若内标模板在该位置的碱基为目标模板SNP不同等位基因中的一个，则测序数据中内标模板和目标模板可能无法通过该位置的碱基区分。
步骤(2)中，所述上游引物和所述下游引物的长度一般分别为10bp-100bp。具体的，可以为10bp-20bp，20bp-30bp，30bp-40bp，40bp-50bp，50bp-60bp，60bp-70bp，70bp-80bp，80bp-90bp，90bp-100bp，20bp-100bp，30bp-100bp，40bp-100bp，50bp-100bp，60bp-100bp，70bp-100bp，80bp-100bp。
步骤(2)中，所述上游引物及下游引物的3‘端避开目标模板最小等位基因频率大于0.01的SNP位点，避免由于引物结合处存在最小等位基因频率较高的SNP，而导致扩增不同等位基因的扩增效率相差较大。
所述引物对可以同时扩增已知模板和内标模板，由于两个模板在引物结合位置序列完全一致，扩增产物长度也完全一致，则扩增效率完全一致。
步骤(6)中，所述内标模板的拷贝数根据公式(II)获得：
Figure BDA0002264403950000041
在一种实施方式中，所述二代测序平台选自illumina测序平台。
可选的，所述二代测序平台对应的接头引物对包括如SEQ ID NO：1所示的上游引物和如SEQ ID NO：2所示的下游引物。
Illumina平台接头上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC。
下游引物序列为如SEQ ID NO：2所示，具体为：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC。其中，NNNNNN为index序列，用于下机数据中拆分每个文库的数据。
本发明中，所述微量DNA是指，浓度小于1ng/μL的DNA。
本发明还提供前述微量DNA的定量方法在DNA定量领域的用途。
实施例1
对低于常规定量方法检测下限的微量DNA进行定量，微量DNA中已知一段序列A1如SEQ ID NO：3所示，具体为：
AGTTTGTGAGAATGAAAAATGAACCTTCATTCCACTATTCCCTTAACTTGCCCTGAGATTGGCTGTTCTGTCATGTGTGTCTTGACTCAGAAACCCTGTTCTCCTCTACATATCTCCCCACCGCATCTCTTTCAGCAGTTGTTTCTAAAAATATCCTCCTAGTTTCATTTTTGCAGAAGT。
其中标注下划线的A碱基位置为SNP位点(rs3813727)，位于第11号染色体第5255912个碱基，其两个等位基因为A\G。内标模板序列与已知模板序列在除rs3813727位点外，其余序列完全一致。
合成的内标模板序列A2如SEQ ID NO：4所示，具体为：
AGTTTGTGAGAATGAAAAATGAACCTTCATTCCACTATTCCCTTAACTTGCCCTGAGATTGGCTGTTCTGTCATGTGTGTCTTGACTCAGAAACCCTGTTCTCCTCTTCATATCTCCCCACCGCATCTCTTTCAGCAGTTGTTTCTAAAAATATCCTCCTAGTTTCATTTTTGCAGAAGT。
其中，标注下划线的T为已知模板序列不一致碱基，且非SNP位点(rs3813727)两个等位基因(A\G)中的一个。
扩增A1和A2的上下游引物序列包含与illumina测序平台接头引物互补序列，以及与内标模板和目标模板序列互补序列。
上游引物FA序列为如SEQ ID NO：5所示，具体为：
ACACGACGCTCTTCCGATCTGAACCTTCATTCCACTATTCCCTTAACTT。
下游引物RA序列如SEQ ID NO：6所示，具体为：
CCTTGGCACCCGAGAATTCCAAGGAGGATATTTTTAGAAACAACTGCTGAAA。
微量DNA中另外一段序列B1如SEQ ID NO：7所示，具体为：
GAATTGCTTATAAAGCACGGAGTGTGTGTGTGTGCATGAAATAAATAAGAAAAATATAAAAATATAAAAAATGGTGTGGGGGAGGGTTTGGAAAGATTTTTTGGGTAGTATAGAGAAGTTTATTGTGGCTGGGGTCAAGAGAGGTCACAAGTAATACGTGAGCAATGAATCTTGACTGAA。
其中标下划线的G碱基位置为SNP位点(rs12222763)，其三个等位基因为G\C\T。内标模板序列与已知模板序列在除rs12222763位点外，其余序列完全一致。
合成的内标模板序列B2如SEQ ID NO：8所示，具体为：
GAATTGCTTATAAAGCACGGAGTGTGTGTGTGTGCATGAAATAAATAAGAAAAATATAAAAATATAAAAAATGGTGTAGGGGAGGGTTTGGAAAGATTTTTTGGGTAGTATAGAGAAGTTTATTGTGGCTGGGGTCAAGAGAGGTCACAAGTAATACGTGAGCAATGAATCTTGACTGAA。
其中，标下划线的A为已知模板序列不一致碱基，且非SNP位点(rs12222763)三个等位基因(G\C\T)中的一个。
上下游引物序列包含与illumina测序平台接头引物互补序列，以及与内标模板和已知模板序列互补序列。
扩增B1和B2序列的上游引物FB序列如SEQ ID NO：9所示，具体为：
ACACGACGCTCTTCCGATCTAGTGTGTGTGTGTGCATGAAATAAATAAGA。
下游引物RB序列如SEQ ID NO：10所示，具体为：
CCTTGGCACCCGAGAATTCCACACGTATTACTTGTGACCTCTCTTGACC。
Illumina平台接头上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC。
下游引物序列为如SEQ ID NO：2所示，具体为：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC。其中，NNNNNN为index序列，用于下机数据中拆分每个文库的数据。
已知模板序列A1和B1的拷贝数一致。
首先，从待定量DNA中取3份，每份1μL。将其中2份分别稀释10倍。待定量DNA原液及两份稀释液，分别命名为tDNA-1，tDNA-2和tDNA-3。
将内标模板A2和B2分别梯度稀释至0.00001ng/μL。两个模板序列长度均为140bp，按照如下公式，将内标模板质量换算为拷贝数，为约65151个拷贝/μL。
Figure BDA0002264403950000061
内标模板拷贝数＝摩尔量(mol)×6.02×1023
分别取tDNA-1，tDNA-2和tDNA-3各1μL，3份待定量DNA中均加入浓度为0.00001ng/μL的内标模板A2和B2各1μL。用两对引物扩增混合DNA。
PCR体系和程序如下：
Figure BDA0002264403950000062
Figure BDA0002264403950000071
Figure BDA0002264403950000072
然后用illumina测序平台接头引物扩增上一轮PCR产物。PCR体系和程序如下：
试剂 体积(μL)
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 20ul
DNA 19ul
Illumina平台接头引物 1ul
total 40ul
Figure BDA0002264403950000073
扩增产物即为二代测序文库，可于illumina测序平台测序。
对测序数据中两个位点分别进行基因分型，其中，tDNA-1分型结果如下：
#CHROM POS REF ALT FORMAT GENOTYPE
chr11 5255912 A T,G,C PL:DP:AD 171,215,0,65,237,173,255,255,249,255:75650:5673,63218,6478,281
chr11 5253477 G A,C,T PL:DP:AD 219,255,0,116,255,207,243,255,250,255:90184:7489,74592,8003,100
上表中，第二行最后一列中，75650为rs3813727这个SNP位点处的总测序覆盖深度，5673为tDNA-1中已知模板序列A1其中一个等位基因A测序覆盖深度，6478为另一个等位基因G测序覆盖深度，已知模板序列的总测序覆盖深度为12151(即5673+6478)。63218为内标模板序列A2等位基因T的测序覆盖深度。已知模板序列A1和内标模板序列A2的测序覆盖深度的比值(12151/63218)，理论上应为其在文库中拷贝数的比值，理论上应为其在扩增前初始混合DNA中拷贝数的比值。内标模板序列加入至待定量DNA中的拷贝数为65151，则tDNA-1中模板序列A1的拷贝数计算值为12523。
同理，第三行最后一列中，90184为rs12222763这个SNP位点处的总测序覆盖深度，7489为待测DNA中已知模板序列B1其中一个等位基因G测序覆盖深度，8003为另一个等位基因C测序覆盖深度，已知模板序列的总测序覆盖深度为15492(即7489+8003)。74592为内标模板序列B2等位基因A的测序覆盖深度。已知模板序列B1和内标模板序列B2的测序覆盖深度的比值(15492/74592)，理论上应为其在文库中拷贝数的比值，理论上应为其在扩增前初始混合DNA中拷贝数的比值。内标模板序列加入至待定量DNA中的拷贝数为65151，则tDNA-1中模板序列B1的拷贝数计算值为13531。
tDNA-2分型结果如下：
#CHROM POS REF ALT FORMAT GENOTYPE
chr11 5253477 G A,C,T PL:DP:AD 255,255,0,255,255,255,255,255,255,255:84623:1085,82844,621,73
chr11 5255912 A T,G,C PL:DP:AD 255,255,0,255,255,255,255,255,255,255:82260:1058,80263,671,268
tDNA-3分型结果如下：
#CHROM POS REF ALT FORMAT GENOTYPE
chr11 5253477 G A,C,T PL:DP:AD 255,255,0,255,255,255,255,255,255,255:82620:1150,80893,498,79
chr11 5255912 A T,G,C PL:DP:AD 255,255,0,255,255,255,255,255,255,255:89527:1304,87454,475,294
由此，计算出tDNA-2中A1的拷贝数为1403，B1的拷贝数为1342；tDNA-3中A1的拷贝数为1325，B1的拷贝数为1327。
综上，3份待测DNA中模板序列A1和模板序列B1的拷贝数均接近一致，精密度CV约为3.6％。现有技术中，数字PCR方法的CV在±10％(数据来自Bio-Rad QX200官方技术指标)。本发明要优于该方法。tDNA-2和tDNA-3为待测DNA的10倍稀释液，两者计算出的拷贝数接近一致。tDNA-1为待测DNA原液，计算出的拷贝数约为tDNA-2和tDNA-3的10倍，表明结果稳定可靠。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海韦翰斯生物医药科技有限公司
<120> 一种微量DNA的定量方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatc 57
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttccttggca cccgagaatt 60
c 61
<210> 3
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtttgtgag aatgaaaaat gaaccttcat tccactattc ccttaacttg ccctgagatt 60
ggctgttctg tcatgtgtgt cttgactcag aaaccctgtt ctcctctaca tatctcccca 120
ccgcatctct ttcagcagtt gtttctaaaa atatcctcct agtttcattt ttgcagaagt 180
<210> 4
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtttgtgag aatgaaaaat gaaccttcat tccactattc ccttaacttg ccctgagatt 60
ggctgttctg tcatgtgtgt cttgactcag aaaccctgtt ctcctcttca tatctcccca 120
ccgcatctct ttcagcagtt gtttctaaaa atatcctcct agtttcattt ttgcagaagt 180
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acacgacgct cttccgatct gaaccttcat tccactattc ccttaactt 49
<210> 6
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccttggcacc cgagaattcc aaggaggata tttttagaaa caactgctga aa 52
<210> 7
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaattgctta taaagcacgg agtgtgtgtg tgtgcatgaa ataaataaga aaaatataaa 60
aatataaaaa atggtgtggg ggagggtttg gaaagatttt ttgggtagta tagagaagtt 120
tattgtggct ggggtcaaga gaggtcacaa gtaatacgtg agcaatgaat cttgactgaa 180
<210> 8
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaattgctta taaagcacgg agtgtgtgtg tgtgcatgaa ataaataaga aaaatataaa 60
aatataaaaa atggtgtagg ggagggtttg gaaagatttt ttgggtagta tagagaagtt 120
tattgtggct ggggtcaaga gaggtcacaa gtaatacgtg agcaatgaat cttgactgaa 180
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acacgacgct cttccgatct agtgtgtgtg tgtgcatgaa ataaataaga 50
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccttggcacc cgagaattcc acacgtatta cttgtgacct ctcttgacc 49

Claims (10)

1.一种微量DNA的定量方法，其特征在于，所述定量方法至少包括以下步骤：
(1)设计内标模板，所述内标模板与目标模板的序列仅有一个或几个碱基不一致；所述目标模板为待测DNA序列的一段或全部；
(2)设计扩增引物对，所述扩增引物对满足以下条件：
能够同时特异性扩增目标模板和内标模板；
所述引物与内标模板的结合部位位于内标模板与目标模板不一致碱基的两侧；
上游引物及下游引物的5’端设有二代测序平台接头互补段；
(3)利用步骤(2)获得的引物对，将待测DNA序列和已知拷贝数的内标模板混合后进行PCR扩增；
(4)将步骤(3)获得的扩增产物用二代测序平台对应的接头引物对进行再次扩增，获得二代测序文库；
(5)对所述二代测序文库进行二代测序平台测序；
(6)根据步骤(5)中的测序结果，根据公式(I)，计算得目标模板的拷贝数，即为待测DNA的拷贝数；
待测DNA的拷贝数＝C*A1/A2 (I)
其中，C为内标模板的拷贝数；
A1为目标模板序列的测序覆盖深度；
A2为内标模板序列的测序覆盖深度。
2.如权利要求1所述的微量DNA的定量方法，其特征在于，步骤(1)中，所述内标模板的序列长度为10bp-1000bp。
3.如权利要求1所述的微量DNA的定量方法，其特征在于，步骤(1)中，当内标模板和目标模板不一致碱基的位置如果正好为SNP位点时，所述内标模板的该位点设计为SNP等位基因外的其他碱基。
4.如权利要求1所述的微量DNA的定量方法，其特征在于，步骤(2)中，所述上游引物和所述下游引物的长度分别为10bp-100bp。
5.如权利要求3所述的微量DNA的定量方法，其特征在于，步骤(2)中，所述上游引物及下游引物的3‘端避开目标模板最小等位基因频率大于0.01的SNP位点。
6.如权利要求1所述的微量DNA的定量方法，其特征在于，步骤(6)中，所述内标模板的拷贝数根据公式(II)获得：
Figure FDA0002264403940000021
7.如权利要求1所述的微量DNA的定量方法，其特征在于，所述二代测序平台选自illumina测序平台。
8.如权利要求7所述的微量DNA的定量方法，其特征在于，所述二代测序平台对应的接头引物对包括如SEQ ID NO：1所示的上游引物和如SEQ ID NO：2所示的下游引物。
9.如权利要求1所述的微量DNA的定量方法，其特征在于，所述微量DNA是指，浓度小于1ng/μL的DNA。
10.如权利要求1-9任一所述的微量DNA的定量方法在DNA定量领域的用途。
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