CN117821642B - 一种用于鉴定蝴蝶兰品种的引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种用于鉴定蝴蝶兰品种的引物组、试剂盒及其应用。引物组包括：第1引物对至第501引物对，每个引物对均包括正向引物和反向引物，第1引物对的正向引物、第1引物对的反向引物至第501引物对的正向引物和第501引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：1002所示。利用该引物组可通过多重PCR扩增和高通量测序获得待测样本的DNA指纹数据，再通过比较待测样本间的DNA指纹数据得到品种鉴定结论，且准确率和数字化程度均较高，可以通过序列分析软件一次性比对成百上千个待测样本，快速获得品种鉴定结论，这能显著提高蝴蝶兰品种鉴定的准确率和效率。
Description
技术领域
本公开涉及分子鉴定技术领域，特别涉及一种用于鉴定蝴蝶兰品种的引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
蝴蝶兰(Phalaenopsis)形态优雅且花色美丽，具有极高的经济价值。近年，由于世界各地品种交换频繁，同物异名和同名异物的现象严重，同时随着繁育技术的提高，杂交新品种数量倍增，因此，对新品种的管理提出了较高的要求。
目前，蝴蝶兰的品种鉴定基于植物新品种(Distinctness UniformityStability，DUS)测试，主要以形态鉴定为主，较少利用DNA(Deoxyribo Nucleic Acid，脱氧核糖核酸)分子鉴定技术。少量研究报道了利用ISSR(Inter-simple sequence repeat，简单序列间重复)分子标记技术进行品种遗传关系的分析，然而ISSR分子标记技术基于PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)扩增后琼脂糖凝胶电泳，一次PCR扩增只能检测一个位点，这使其通量非常低，且DNA聚合酶反应时容易产生滑脱基因型，在电泳过程中，难以区分滑脱基因型与待测样本的主基因型，这容易导致鉴定结论错误，使得该方法不适用于对准确性要求颇高的品种鉴定。因此，开发能够准确鉴定蝴蝶兰品种的检测技术成为亟待解决的技术问题。
公开内容
为了解决现有技术的问题，本公开实施例提供了一种用于鉴定蝴蝶兰品种的引物组、试剂盒及其应用。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种用于鉴定蝴蝶兰品种的引物组，所述引物组包括：第1引物对至第501引物对，每个所述引物对均包括正向引物和反向引物，所述第1引物对的正向引物、所述第1引物对的反向引物至所述第501引物对的正向引物和第501引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：1002所示。
另一方面，本发明实施例提供了一种用于鉴定蝴蝶兰品种的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。
又一方面，本发明实施例提供了一种上述引物组在鉴定蝴蝶兰品种中的应用，所述应用包括：
利用权利要求1所述的引物组对待测样本的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；
纯化所述多重PCR扩增产物；
利用纯化后的所述多重PCR扩增产物构建高通量测序文库，获得所述待测样本的高通量文库；
纯化所述待测样本的高通量文库；
对所述待测样本的高通量文库进行测序，得到所述测序数据；
分析所述测序数据，获得DNA指纹数据；
将所述DNA指纹数据与对照样本进行比较，获得遗传相似系数；
根据所述遗传相似系数，获得所述待测样本与所述对照品种间的品种鉴定结论。
具体地，所述根据遗传相似系数，获得所述待测样本与所述对照品种间的品种鉴定结论包括：当所述遗传相似系数大于或等于99％时，判定所述待测样本与对照样本为极近似品种或相同品种。
本公开实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种用于鉴定蝴蝶兰品种的引物组、试剂盒及其应用，利用该引物组可通过多重PCR扩增和高通量测序获得待测样本的DNA指纹数据，再通过比较待测样本间的DNA指纹数据得到品种鉴定结论。其中DNA指纹数据是测序后获得的多个MNP标记的碱基序列，分辨率达到单碱基水平，且准确率和数字化程度均较高，可以通过序列分析软件一次性比对成百上千个待测样本，快速获得品种鉴定结论，这能显著提高蝴蝶兰品种鉴定的准确率和效率。本发明实施例提供的引物组用于蝴蝶兰品种鉴定，在蝴蝶兰品种鉴定和DNA指纹数据库构建等方面均具有良好的应用价值，为我国蝴蝶兰品种的知识产权保护提供技术支撑，可促进产业健康发展。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本公开实施例提供的待测样本的MNP标记检出位点数分布图，其中横坐标为待测样本，纵坐标为MNP位点数目；
图2是本公开实施例提供的MNP标记位点的差异比例分布图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本公开实施方式作进一步地详细描述。
本发明实施例提供了一种用于鉴定蝴蝶兰品种的引物组，该引物组包括：第1引物对至第501引物对，每个引物对均包括正向引物和反向引物，第1引物对的正向引物、第1引物对的反向引物至第501引物对的正向引物和第501引物对的反向引物依次如序列表中SEQID NO：1至SEQ ID NO：1002所示，具体如表1所示。
表1为501对引物对序列
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上述引物组中的引物间不干扰，保证每个引物对均能够在同一个扩增反应中正常反应，并特异扩增目标基因序列。
另一方面，本发明实施例提供了一种用于鉴定蝴蝶兰品种的试剂盒，该试剂盒采用上述引物组。
又一方面，本发明实施例提供了一种采用上述引物组鉴定蝴蝶兰品种的方法，该方法包括：
利用上述引物组对待测样本的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；
纯化多重PCR扩增产物；
利用纯化后的多重PCR扩增产物构建高通量测序文库，获得待测样本的高通量文库；
纯化待测样本的高通量文库；
对待测样本的高通量文库进行测序，得到测序数据；
分析测序数据，获得DNA指纹数据；
将DNA指纹数据与对照样本进行比较，获得遗传相似系数；
根据遗传相似系数，获得待测样本与对照品种间的品种鉴定结论。
具体地，根据遗传相似系数，获得待测样本与对照品种间的品种鉴定结论，包括：当遗传相似系数大于或等于99％时，判定待测样本与对照样本为极近似品种或相同品种。
实施例
本实施例中待测样本为江汉大学收集的蝴蝶兰样本中随机选取26份蝴蝶兰品种作为待测样本，26份蝴蝶兰品种为：奥尔堡、昂热、阿雷佐、布隆方丹、布卢明顿、加的斯、卡利、德班、菲拉拉、弗龙特拉、拉巴斯、朗布隆、孟斐斯、梅里达、蒙特雷、蒙彼利埃、纳博讷、诺丁汉、匹兹堡、鹿特丹、圣罗莎、斯图加特、都灵、图尔坎、突尼斯和沃尔泰拉。
提取待测样本的DNA：采用天根生化科技(北京)有限公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒(货号：DP320)提取上述26个蝴蝶兰品种的叶片DNA，操作步骤详细见该试剂盒的说明书，得到26个待测样本的DNA，然后分别取1μL待测样本的DNA用Qubit荧光定量仪测定待测样本的DNA浓度，在本实施例中，测得待测样本的DNA浓度均在20ng/μL～50ng/μL之间。
利用本发明实施例提供的引物组对待测样本的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物。
具体地，每个待测样本的扩增反应中均包括：4μL本发明实施例提供的引物组、4μL待测样本的DNA、10μL GenoPlexs 3×T Master Mix(生产商：石家庄博瑞迪生物技术有限公司)和12μL水，振荡混匀，得到混合物，将该混合物作为多重PCR扩增体系用于多重PCR扩增。多重PCR扩增程序：95℃3min；(95℃20sec，60℃4min)×17个循环；72℃4min，得到多重PCR扩增产物。
纯化多重PCR扩增产物。
具体地，然后使用DNA纯化磁珠(生产商：南京诺唯赞生物科技股份有限公司)对反应结束后的扩增产物进行纯化，操作步骤详细见该产品的说明书。
利用纯化后的多重PCR扩增产物构建高通量测序文库，获得待测样本的高通量文库。
具体地，向纯化后的多重PCR扩增产物中加入10μL GenoPlexs 3×T Master Mix、2μL浓度为5μM的illumina测序接头引物(博瑞迪生物技术有限公司生产)和16μL水，并按如下程序进行PCR扩增反应：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，70℃30s)×8个循环；72℃最后延伸5min，于16℃结束反应。反应结束后，获得待测样本的高通量测序文库。
纯化待测样本的高通量文库。具体地，使用DNA纯化磁珠对高通量测序文库进行纯化，得到纯化后的高通量测序文库，具体纯化方法参照DNA纯化磁珠产品的说明书。
对待测样本的高通量文库进行测序，得到测序数据。具体地，采用illuminaNextSeq550测序仪对高通量测序文库进行测序，得到待测样本的测序数据，测序详细步骤参见该测序仪的使用说明书。
分析测序数据，获得DNA指纹数据。具体地，利用数据比对软件Bowtie2(版本号2.1.0)进行序列分析，获得每个待测样本的MNP标记的DNA序列。
MNP标记的检出率
按照本发明实施例提供的引物组进行多重PCR扩增及测序文库的构建，对这26份蝴蝶兰DNA样本进行了多重扩增、二代高通量测序与数据分析，该501个标记在26个待测样本中均能检出，具体检出信息参见表2。
表2为26份蝴蝶兰品种检出信息
| 序号 | 样本编号 | 品种名称 | 检出位点数 | 检出率 |
| 1 | HDL220727001 | 奥尔堡 | 477 | 95.40％ |
| 2 | HDL220727002 | 昂热 | 475 | 95.00％ |
| 3 | HDL220727003 | 阿雷佐 | 470 | 94.00％ |
| 4 | HDL220727004 | 布隆方丹 | 479 | 95.80％ |
| 5 | HDL220727005 | 布卢明顿 | 473 | 94.60％ |
| 6 | HDL220727006 | 加的斯 | 489 | 97.80％ |
| 7 | HDL220727007 | 卡利 | 472 | 94.40％ |
| 8 | HDL220727008 | 德班 | 477 | 95.40％ |
| 9 | HDL220727009 | 菲拉拉 | 455 | 91.00％ |
| 10 | HDL220727010 | 弗龙特拉 | 465 | 93.00％ |
| 11 | HDL220727011 | 拉巴斯 | 455 | 91.00％ |
| 12 | HDL220727014 | 朗布隆 | 458 | 91.60％ |
| 13 | HDL220727015 | 孟斐斯 | 469 | 93.80％ |
| 14 | HDL220727016 | 梅里达 | 491 | 98.20％ |
| 15 | HDL220727018 | 蒙特雷 | 484 | 96.80％ |
| 16 | HDL220727019 | 蒙彼利埃 | 456 | 91.20％ |
| 17 | HDL220727020 | 纳博讷 | 464 | 92.80％ |
| 18 | HDL220727021 | 诺丁汉 | 455 | 91.00％ |
| 19 | HDL220727022 | 匹兹堡 | 469 | 93.80％ |
| 20 | HDL220727023 | 鹿特丹 | 482 | 96.40％ |
| 21 | HDL220727024 | 圣罗莎 | 481 | 96.20％ |
| 22 | HDL220727025 | 斯图加特 | 475 | 95.00％ |
| 23 | HDL220727026 | 都灵 | 457 | 91.40％ |
| 24 | HDL220727028 | 图尔坎 | 461 | 92.20％ |
| 25 | HDL220727029 | 突尼斯 | 472 | 94.40％ |
| 26 | HDL220727030 | 沃尔泰拉 | 473 | 94.60％ |
由表2可知，梅里达品种的检出标记数目最高为491个，平均每个品种可检出470.5个MNP标记，平均检出率达94.11％，待测样本的MNP标记检出位点数分布如图1所示。
准确率分析
为了检验引物对的准确率，对其中13个待测样本中的蝴蝶兰品种(弗龙特拉、鹿特丹、蒙特雷、朗布隆、图尔坎、孟斐斯、拉巴斯、突尼斯、菲拉拉、诺丁汉、匹兹堡、纳博讷和斯图加特)进行重现性实验(包括在不同人员、不同批次试剂和不同仪器下所做的两次独立实验)，比较分析每个待测样本的2次实验数据，按准确率＝1-(1-精确度)/2的公式计算分型的准确率。其中，精确度是指两次实验的分型结果一致的MNP标记位点占所有MNP标记位点的比例。统计结果见表3。
表3为501个蝴蝶兰MNP标记位点的准确率
由表3可知，总共比较了6034个MNP标记，不重现的位点数14个，分型准确率为99.88％。标记准确率高则说明鉴定结果不受不同人员、不同批次试剂和不同仪器影响，这为DNA指纹数据的共享提供技术保障。
MNP标记品种的区分度
将上述26份待测样本的所有检出的MNP标记基因型，进行两两比较，根据不同品种中同一MNP标记位点的等位基因型上的差异至少1个SNP被判为有差异的原则，统计这26个待测样本两两比较的差异MNP标记数目，共得到325对比较结果，平均每对待测样本的差异为375个标记位点，平均差异比例达83％，差异比例分布如图2所示。由图2可知，所筛选的MNP标记多态性高，能显著区分任一蝴蝶兰品种。
蝴蝶兰品种鉴定
将DNA指纹数据与对照样本进行比较，获得遗传相似系数；根据遗传相似系数，鉴定待测样本的品种。根据遗传相似系数，获得待测样本与对照品种间的品种鉴定结论包括：当遗传相似系数大于或等于99％时，判定待测样本与对照样本为极近似品种或相同品种。其中，对照样本可以与待测样本共同进行扩增测序并获得DNA指纹数据，也可以提前进行扩增测序后，再与待测样本进行比较，可根据实际情况而定。
具体地，对收集的另一份蝴蝶兰品种图尔坎(命名DC1)按照上述实验流程进行检测，然后与上述26份待测样本的DNA指纹数据进行比较，获得遗传相似系数，参照现有《植物品种鉴定MNP标记法》国家标准以遗传相似系数作为品种鉴定时结论判定的依据，当遗传相似系数(GS)大于或等于99％时，判定待测样本与对照样本为“极近似品种或相同品种”。结果见表4。
表4为图尔坎DC1与26份待测样本的DNA指纹数据比较结果
如表4所示，图尔坎DC1与26份待测样本中的图尔坎品种差异位点数目为0，GS值达到100％，则判定为极近似品种或相同品种；而与其它蝴蝶兰样本间差异位点数显著(大于等于331个位点)，且GS值极低(小于等于27.09％)，则判定为不同品种。由此可见，通过本发明实施例提供的引物组可将采集的待测样本的DNA指纹数据与已有数据进行比较分析，用于准确鉴别蝴蝶兰品种。
以上所述仅为本公开的可选实施例，并不用以限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用于鉴定蝴蝶兰品种的引物组，其特征在于，所述引物组包括：第1引物对至第501引物对，每个所述引物对均包括正向引物和反向引物，所述第1引物对的正向引物、所述第1引物对的反向引物至所述第501引物对的正向引物和第501引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：1002所示。
2.一种用于鉴定蝴蝶兰品种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。
3.一种如根据权利要求1所述的引物组在鉴定蝴蝶兰品种中的应用，其特征在于，所述应用包括：
利用权利要求1所述的引物组对待测样本的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；
纯化所述多重PCR扩增产物；
利用纯化后的所述多重PCR扩增产物构建高通量测序文库，获得所述待测样本的高通量文库；
纯化所述待测样本的高通量文库；
对所述待测样本的高通量文库进行测序，得到所述测序数据；
分析所述测序数据，获得DNA指纹数据；
将所述DNA指纹数据与对照样本进行比较，获得遗传相似系数；
根据所述遗传相似系数，获得所述待测样本与所述对照品种间的品种鉴定结论。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，根据遗传相似系数，获得所述待测样本与所述对照品种间的品种鉴定结论包括：当所述遗传相似系数大于或等于99％时，判定所述待测样本与对照样本为极近似品种或相同品种。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117821642A (zh) | 2024-04-05 |
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