CN117004756A - 用于桂花品种鉴定的mnp标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于桂花品种鉴定的MNP标记位点，所述MNP标记位点为在桂花基因组中筛选的在桂花种群内具有多个核苷酸多态性的基因组区域，所述MNP标记位点包括MNP‑1～MNP‑50，还提供了检测上述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，包括50组引物对，引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:100所示。本发明的MNP标记位点以及引物组合物和包含引物组合物的试剂盒可以对桂花品种进行鉴定、对古桂花树产品进行溯源，且区分力强、鉴定通量高、结果准确。

Description

用于桂花品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其 应用

技术领域

本发明涉及分子鉴定技术领域，具体涉及一种用于桂花品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用。

背景技术

桂花(Osmanthus fragrans Lour.)是传统十大名花之一，在我国有着悠久的栽培历史。桂花资源丰富，有四季桂、银桂、丹桂和金桂等主要四个类群，包含150多个品种。我国咸宁作为中国桂花之乡，百年以上的古桂花树有2000余株，而该独特的地方优质自然资源却未得到充分的开发利用，其中重要原因在于无法实现古桂树与所产桂花间的精准鉴定。如果能实现古桂树和所产桂花的精准对应，对古桂花资源的保护与开发利用，具有重要意义。

目前桂花的品种鉴定主要以形态鉴定、DNA条形码和SSR标记技术为主。形态鉴定受环境影响，且依赖于鉴定者的经验，因此鉴定准确性和稳定性较差，不适用于产品的鉴定；DNA条形码主要用于物种鉴定，不能鉴定种下的分类单元，比如品种间的鉴定；SSR标记以其多态性高和操作简便已在品种鉴定种广泛应用，但是SSR标记法一次PCR扩增不超过5个位点，通量较低，且DNA聚合酶扩增时容易产生滑脱基因型，难以区分滑脱基因型与样本的主基因型，因此SSR标记不适用于具有多个基因型的多倍体植物和混杂样品。目前桂花品种鉴定的研究中，主要基于少量桂花SSR标记开展工作，如李军等于2018年发表的论文“桂花EST-SSR引物开发及在品种鉴定中的应用”中仅研究了19个EST-SSR位点，虽然能达到品种区分的效果，但鉴定结果为图形，难以实现数据的数字化管理。因此，开发用于桂花品种鉴定的高多态性的新型分子标记及其检测技术，成为亟待解决的技术问题。

MNP标记是指在基因组上一段区域内由多个核苷酸变异产生的多态性标记。MNP标记等位基因丰富，多态性高，理论上单个MNP位点上有2ⁿ种等位基因型(n为MNP标记中SNP的数目)，MNP标记品种区分能力强，由于MNP标记等位基因型丰富，仅利用少数标记位点就可以实现大量样本的区分。MNP标记鉴定流程效率高，单个PCR反应中可同事扩增成百上千个标记位点，例如国标GB/T 38551中可同时扩增317-1042个MNP标记。MNP标记鉴定准确度高，通过二代高通量测序对每条MNP标记的PCR产物测序数百次，极大降低实验误差导致的基因型分型错误。基于以上优点，MNP标记技术已经广泛应用于水稻、玉米、番茄、猕猴桃等作物中，目前在桂花品种鉴定中尚未有关于MNP标记的研究报道，也缺乏相应的技术。

发明内容

为解决背景技术中存在的问题，本发明提供了一种用于桂花品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒，不仅可以对桂花品种进行品种鉴定、也可以对古桂花树产品进行溯源，具有区分力强、鉴定通量高、结果准确的特点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种用于桂花品种鉴定的MNP标记位点，所述MNP标记位点为在桂花基因组中筛选的在桂花种群内具有多个核苷酸多态性的基因组区域，所述MNP标记位点包括MNP-1～MNP-50，MNP-1～MNP-50在桂花基因组GCA_019395295上的位置如下表所示：

MNP-1～MNP-50在桂花的其它基因组中的位置通过序列比对直接获得。

第二方面，本发明提供了检测上述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，包括50组引物对，50组引物对的序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:100所示。

第三方面，本发明提供了一种用于检测上述MNP标记位点的试剂盒，包含上述的多重PCR引物组合物。

第四方面，本发明提供了上述MNP标记位点或多重PCR引物组合物或试剂盒在桂花品种鉴定中的应用。

第五方面，本发明提供了上述MNP标记位点或多重PCR引物组合物或试剂盒在古桂花树产品溯源中的应用。

第六方面，本发明提供了上述MNP标记位点或多重PCR引物组合物或试剂盒在构建桂花品种DNA指纹数据库中的应用。

第七方面，本发明提供了用于检测上述MNP标记位点的产品在桂花品种鉴定种的应用。

第八方面，本发明提供了用于检测上述MNP标记位点的产品在古桂花树产品溯源中的应用。

第九方面，本发明提供了一种鉴定桂花品种的方法，以上述MNP标记位点作为标记，鉴定待测桂花样本的品种。

进一步，基于所述MNP标记位点，判断待测样本与对照品种的遗传相似系数，当遗传相似系数大于或等于99％时，判定待测样品与对照品种为极近似品种或相同品种，遗传相似度的计算公式为：

其中，GS为待测样品与对照品种的遗传相似系数，n_ij为待测样品与对照品种中均检出的但基因型无差异的标记位点的数目，N_ij为待测样品与对照品种中均检出的标记位点的数目。

本发明的有益效果是：通过本发明提供的MNP位点以及引物组和试剂盒。通过多重扩增和高通量测序获得待测样本的DNA指纹数据，进而通过数据分析获得品种鉴定结论。其中DNA指纹数据是测序后获得的碱基序列，分辨率达到单碱基水平，数据准确性和数字化程度高，可以通过序列分析软件一次性比对成百上千个样品，快速得到品种鉴定结论。同时，基于多个标记检测的策略，具有靶标多、通量高、准确性高的特点，可以大大提高桂花衍生产品鉴定的准确性和效率，为古桂花树产品溯源提供技术手段。该专利用于桂花品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒，在桂花产品鉴定、DNA指纹数据库构建、古桂花树产品溯源等应用场景中具有较好的应用价值，为我国桂花品种的分子育种和知识产权保护提供技术支撑，促进产业的健康发展。

附图说明

图1为本发明实施例2中桂花MNP标记位点检出位点数分布图；

图2为本发明实施例2中桂花样品间MNP标记差异比例分布图。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

MNP标记技术已经广泛应用于水稻、玉米、番茄、猕猴桃中，目前在桂花中尚未有关于MNP标记的研究报道，也缺乏相应的技术。

本发明基于桂花参考基因组并结合主要桂花品种的测序数据，通过发明人研发的标记筛选规则(具体见实施例1)，筛选了一套多态性高的桂花MNP标记位点，所述标记位点为在桂花基因组上筛选的在桂花种群内具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括桂花基因组MNP-1～MNP-50的标记位点，MNP-1～MNP-50标记位点具体如说明书表1所示，表1中标注的MNP标记的起始和终止位点是基于桂花参考基因组GCA_019395295的序列确定的，MNP标记位点在桂花其它基因组中的位置可以根据序列比对获得。

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1用于桂花品种鉴定的MNP标记位点的筛选和多重PCR扩增引物的设计

对采集的桂花品种进行简化基因组测序，以公开发布的桂花基因组序列GCA_019395295为参考基因组，首先采用Samtools(Version 1.2)和BCFtools(Version:1.2)进行序列分析获得桂花基因组上的SNP位点，并与NCBI的NT库进行比较分析，按以下原则进行MNP标记的筛选：(1)标记的核酸序列在桂花中特有，不在其它物种中出现；(2)标记序列上有三个及以上不连续的SNP差异；(4)标记序列的长度小于250bp；进一步利用已测得的桂花品种简化测序数据分析筛选出的候选MNP标记的区分度，并结合目前我国桂花树的育种水平，最后确定出50个具有高多态性的候选MNP标记位点，分别为MNP-1～MNP-50，MNP-1～MNP-50在GCA_019395295为参考基因组上的位置如表1所示，在其它桂花基因组中的位置可以根据序列比对得到。

根据上述MNP标记位点设计了其多重PCR引物组，该引物组包括第1引物对至第50引物对，每个引物对均包含正向引物和反向引物，第1引物对的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，以此类推，第50引物对的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID:99和SEQ ID NO:100所示，所述引物在反应时互相不冲突，可以通过多重PCR同时扩增上述50个MNP标记位点，扩增效率高，鉴定准确度高，满足桂花品种鉴定和DNA指纹数据库构建的要求，鉴定准确度高，引物组对应的检测标记及引物组信息如下表1所示。

表1 50个桂花MNP标记位点在参考序列上的位置及50对检测引物序列

上述多重PCR引物组合物可以用于检测MNP标记位点的试剂盒，该引物组合物和试剂盒可以应用于桂花品种鉴定、DNA指纹数据库构建、古桂花树产品溯源以及其它相关领域中。

实施例2、桂花品种鉴定的MNP标记、引物组合物及试剂盒的评估采用50对引物分析桂花的MNP标记，50对引物合成后，每条引物取5μL等量混合组成引物mix。从本单位收集的桂花样品中随机选取25份桂花品种，对开发的MNP标记、引物以及试剂盒进行评估，测试MNP标记位点的检出率、准确性和区分度，其中材料的详细信息如表2所示。

表2、25份桂花品种信息

具体实验流程如下：

DNA提取，以获得待测样本的DNA。

具体地，采用植物基因组DNA提取试剂盒(生产商：天根生化科技(北京)有限公司货号：DP320)提取上述桂花品种(待测样本)的叶片DNA，操作步骤详细见该试剂盒的说明书，得到上述25个待测样本的DNA，然后分别取1μL待测样本的DNA用Qubit荧光定量仪测定待测样本的DNA浓度，测得待测样本的DNA浓度都在20ng/μL-50ng/μL之间。

多重PCR扩增MNP标记位点，得到多重PCR扩增产物。

具体地，每个待测样品的扩增反应中加入4μL本发明实施例提供的引物组、4μL待测样本的DNA、10μL GenoPlexs 3×T Master Mix(生产商：石家庄博瑞迪生物技术有限公司)和12μL水，并振荡混匀，得到混合物，将该混合物用于多重PCR扩增。多重PCR扩增程序：95℃3min；(95℃20sec，60℃4min)×17个循环；72℃4min。

然后使用DNA纯化磁珠(生产商：南京诺唯赞生物科技股份有限公司)对反应结束后的扩增产物进行纯化，方法参照产品说明书。

构建高通量测序文库

具体地，向纯化后的多重PCR扩增产物中加入如下反应试剂10μLGenoPlexs 3×TMaster Mix、2μL浓度为5μM的illumina测序接头引物和16μL水，按如下程序进行PCR反应：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，70℃30s)×8个循环；72℃最后延伸5min，于16℃结束反应。

反应结束后，获得待测样本的高通量测序文库。然后使用DNA纯化磁珠对高通量测序文库进行纯化，得到纯化后的高通量测序文库，纯化方法参照该产品的说明书。

文库测序

采用illumina NextSeq550测序仪对高通量测序文库进行测序，得到待测样本的测序数据，测序详细步骤参见该测序仪的说明书，测序结束后将测序数据拷贝至移动硬盘。

测序数据分析

利用数据比对软件Bowtie2(版本号2.1.0)，将待测样本的测序数据比对到桂花参考基因组上，获得每个待测样本的MNP标记的DNA序列。比对结果采用SAM(The SequenceAlignment/Map format，序列比对格式)格式保存。

(1)MNP标记检出率

按照本发明的试剂盒进行多重PCR扩增及测序文库的构建，对这25份桂花DNA样本进行了多重扩增、二代高通量测序与数据分析，该50个标记在这25个样品中都能检出，其中莲籽丹桂品种中检出标记数目最高为49个，平均每个品种可检出46.4个MNP标记，检出率达92.88％，桂花MNP标记检出位点数分布如图1所示。

(2)桂花MNP标记的准确性分析

为了检验桂花MNP标记的准确定，对其中10个桂花品种进行重现性实验(指由不同人员、不同批次试剂、不同仪器下所做的两次独立实验)，比较分析每个样品的2次实验数据，按准确率＝1-(1-精确度)/2的公式计算分型的准确率。其中，精确度是指两次实验的分型结果一致的标记位点占所有标记位点的比例。统计结果见表2，结果显示，总共比较472个MNP标记，不重现的位点数1个，分型准确率为99.89％。标记准确率高说明由不同实验室或不同时间采集的DNA指纹数据间可以相互进行准确的比较，为DNA指纹数据的共享提供技术保障。

表2、50个桂花MNP标记位点准确性评估信息表

(3)桂花MNP标记品种区分度

将这25份桂花样品的所有检出的MNP标记基因型，进行两两比较，基于不同品种中同一MNP标记位点等位基因型上差异至少1个SNP判为有差异的原则，统计这25个样品两两比较的差异MNP标记数目，共得到300对比较结果，平均每对样品差异40.4个标记位点，差异比例在90.55％，差异比例分布如图2所示，所筛选的标记能显著区分任一桂花品种。

实施例3古桂花树产品的溯源鉴定

对在咸宁赤壁市赵李桥镇羊楼洞村羊楼洞小学和桂花源风景区采集的3份古桂花树的桂花样本古桂花-1、古桂花-2、古桂花-3，按照实施例2所述的实验流程进行检测，然后与上述25份样品的DNA指纹数据进行比较，获得遗传相似系数，结果见表3、表4和表5。参照现有《植物品种鉴定MNP标记法》国家标准以遗传相似系数作为品种鉴定时结论判定的依据，当GS大于或等于99％时，判定待测样品与对照样品为“极近似品种或相同品种”。如结果所示，每株古树上采取的桂花与对应古树间差异位点数目为0，GS值达到100％；而与其它桂花样品间差异位点数显著(大于等于37个位点)，GS值极低(小于等于21.28％)，判定为不同品种；结果说明通过本发明可准确鉴别桂花来源于哪一株古桂花树，可应用于古桂花树产品的溯源。

表3古桂花-1的鉴定结果(仅列出遗传相似度最高的前10个品种)

表4古桂花-2的鉴定结果(仅列出遗传相似度最高的前10个品种)

表5古桂花-3的鉴定结果(仅列出遗传相似度最高的前10个品种)

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以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于桂花品种鉴定的MNP标记位点，其特征在于，所述MNP标记位点为在桂花基因组中筛选的在桂花种群内具有多个核苷酸多态性的基因组区域，所述MNP标记位点包括MNP-1～MNP-50，MNP-1～MNP-50在桂花基因组GCA_019395295上的位置如下表所示：

MNP-1～MNP-50在桂花的其它基因组中的位置通过序列比对直接获得。

2.一种用于检测权利要求1所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，其特征在于，包括50组引物对，所述50组引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:100所示。

3.一种用于检测权利要求1所述的MNP标记位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的多重PCR引物组合物。

4.权利要求1所述的MNP标记位点或权利要求2所述的多重PCR引物组合物或权利要求3所述的试剂盒在桂花品种鉴定中的应用。

5.权利要求1所述的MNP标记位点或权利要求2所述的多重PCR引物组合物或权利要求3所述的试剂盒在古桂花树产品溯源中的应用。

6.权利要求1所述的MNP标记位点或权利要求2所述的多重PCR引物组合物或权利要求3所述的试剂盒在构建桂花品种DNA指纹数据库中的应用。

7.用于检测权利要求1所述的MNP标记位点的产品在桂花品种鉴定种的应用。

8.用于检测权利要求1所述的MNP标记位点的产品在古桂花树产品溯源中的应用。

9.一种鉴定桂花品种的方法，其特征在于，以权利要求1所述的MNP标记位点作为标记，鉴定待测桂花样本的品种。

10.根据权利要求9所述的鉴定桂花品种的方法，其特征在于，基于所述MNP标记位点，判断待测样本与对照品种的遗传相似系数，当遗传相似系数大于或等于99％时，判定待测样品与对照品种为极近似品种或相同品种，遗传相似度的计算公式为：

其中，GS为待测样品与对照品种的遗传相似系数，n_ij为待测样品与对照品种中均检出的但基因型无差异的标记位点的数目，N_ij为待测样品与对照品种中均检出的标记位点的数目。