CN113462749A - 一种高灵敏扩增子建库试剂盒以及建库方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高灵敏扩增子建库试剂盒以及建库方法和应用,属于测序建库技术领域。所述试剂盒包括:(1)至少一个用于扩增目标区域的特异性引物对;(2)用于添加特异性分子标签UMI(Unique Molecular Identifiers)的引物对;(3)用于添加测序接头的引物对。本发明进一步包括利用所述试剂盒进行建库的方法,包括利用(1)的引物对进行第一轮PCR扩增,再利用(2)的引物对进行第二轮PCR扩增,最后利用(3)的引物对进行第三轮PCR扩增,即完成建库,可用于基于高通量测序进行突变检测。利用本发明建库,结果测序和分析,可以对低频率突变进行检测,灵敏度高,应用十分广泛。
Description
技术领域
本发明属于测序建库技术领域,具体地,涉及一种高灵敏扩增子建库试剂盒以及建库方法和应用。
背景技术
扩增子测序是一种高度靶向的方法,能让研究者分析特定基因组区域的遗传变异。 PCR产物(扩增子)的超深度测序可以有效地识别并表征变异。该方法采用寡核苷酸探针来靶向并捕获感兴趣的区域,随后再进行新一代测序(NGS)。扩增子测序具有以下优点:采用高度靶向的方法,能让研究者高效地发现、验证和筛选遗传变异;每次反应能进行成百上千个扩增子的多重分析,可实现高覆盖度;即使在难以测序的区域,例如高GC区域,也能提供高度靶向的多重测序;非常灵活,可应用于广泛的实验设计;与全基因组测序等范围更广的方法相比,可减少测序成本和周转时间。
在扩增子测序中,建库是重要的步骤,其直接决定了检测的成功与否。常规的扩增子测序建库方法包括:通过PCR扩增富集目标区域,纯化后混样,然后进行末端修复和加A,再加接头,纯化样品,跑胶回收目的条带,然后PCR扩增,最后再跑胶回收主带。该种常规的建库方法步骤繁琐,浪费时间,工作量大,不利于大量样品的测序建库。
艾吉泰康等常规的扩增子建库流程包括两轮PCR扩增,第一轮使用带部分接头序列多重引物进行PCR扩增,经纯化后利用完整接头序列引物进行第二轮PCR扩增,但其建库方法检测限为1%。Thermofisher的扩增子建库流程同样包括两轮PCR扩增,第一轮使用带UMI的特异性引物进行2轮PCR扩增标记模板,纯化后第二步使用区分样本条形码的引物进行扩增,纯化后上机测序,该建库方法检测限低,能检测0.1%以上的变异,但对0.1%以下的变异模板容易标记失败。
发明内容
为了解决上述技术问题中的至少一个,本发明旨在提供一种高灵敏扩增子建库的技术手段。为了完成该目的,本发明采取的技术方案如下:
本发明第一方面提供一种高灵敏扩增子建库试剂盒,包括:
(1)至少一个用于扩增目标区域的特异性引物对;
(2)用于添加特异性分子标签(Unique Molecular Identifier,UMI)的引物对;
(3)用于添加测序接头的引物对,
其中,所述用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物从5'端到3'端依次包括连接序列和靶向所述特异性引物对的扩增产物的第一靶向序列,用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物中至少一个的连接序列和第一靶向序列之间还连接有特异性分子标签序列;所述用于添加测序接头的引物对的上游引物和下游引物从5'端到3'端依次包括测序接头序列和靶向所述连接序列的第二靶向序列。
在本发明中,所述特异性分子标签又叫分子条形码,通过给每一条DNA片段加上一段特有的标签序列,经进一步PCR扩增后一起进行测序。由此,根据不同的标签序列就可以区分不同来源的DNA模板,分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变,哪些是真正的携带的突变,从而提高检测灵敏度和特异性。
在本发明中,所述用于扩增目标区域的特异性引物对主要用于放大起始模板的数量,由此使得用于添加UMI分子标签的引物更加容易添加UMI标签。由此,用于添加特异性分子标签的引物对的靶标序列小于或者等于用于扩增目标区域的特异性引物对的扩增产物。
本发明首先利用特异性引物扩增目标区域,进一步利用带UMI标签的引物进行标记,最后利用用于添加测序接头的引物对添加测序接头,其中,带UMI标签的引物包括特异性引物序列和连接序列,可以精准对第一轮PCR扩增的产物进行标记;所述用于添加测序接头的引物对包括测序接头序列和靶向所述连接序列的序列,用于精准对目标序列添加接头。三类引物对彼此关联,相互支撑,共同提高了突变检测的灵敏度。
在本发明中,所述目标区域可以有多个,针对特定的目标区域,也可以有多个特异性引物对。
在本发明的一些实施方案中,所述目标区域选自包括chr1:19018357-19018507、chr1:43806091-43806241、chr1:47746603-47746753、chr1:65311187-65311337、 chr1:110883842-110883992和chr1:157545309-157545459的组中的至少一个,包含的突变位点信息如下:
目标区域 | 变异起始 | 变异终止 | 参考碱基 | 变异碱基 |
chr1:19018357-19018507 | 19018405 | 19018405 | G | A |
chr1:43806091-43806241 | 43806166 | 43806166 | G | A |
chr1:47746603-47746753 | 47746678 | 47746678 | G | C |
chr1:65311187-65311337 | 65311262 | 65311262 | G | A |
chr1:110883842-110883992 | 110883917 | 110883917 | A | G |
chr1:157545309-157545459 | 157545384 | 157545384 | T | C |
在本发明的一个具体实施方案中,用于扩增目标区域chr1:19018357-19018507的特异性引物对分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列;用于扩增目标区域chr1:43806091-43806241的特异性引物对分别具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列;用于扩增目标区域chr1:47746603-47746753的特异性引物对分别具有SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列;用于扩增目标区域 chr1:65311187-65311337的特异性引物对分别具有SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列;用于扩增目标区域chr1:110883842-110883992的特异性引物对分别具有 SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示核苷酸序列;用于扩增目标区域 chr1:157545309-157545459的特异性引物对分别具有SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12 所示核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中,所述用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物的连接序列分别具有SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中,用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物的连接序列和第一靶向序列之间均连接有特异性分子标签序列。
在本发明的一些实施方案中,所述特异性分子标签序列包括3~10nt随机序列,即N3~10。其中,N表示A、T、C或G。N3~10可以形成43~10个不同的标签,用于对序列进行标记。例如,如果选择3nt随机序列作为特异性分子标签序列,即,所述特异性分子标签序列具有SEQ IDNO.15所示核苷酸序列,可以形成43也就是64种不同的序列标签。
利用带特异性分子标签序列的引物,无需跟踪拷贝数,可达到区分来自单个分子冗余的PCR重复序列,减少重复定量,屏蔽PCR偏好性,矫正测序错误,以达到绝对定量;相同UMI标记的reads可进行相互矫正,对于测定的reads均会保留,而不会被当作背景噪音剔除,相比常规建库方式得到的有效数据量增多,可将部分低丰度转录本准确鉴定到;UMI标签降低了文库构建过程中的扩增及测序错误引入的假阳性,在进行突变分析中获得的信息更为准确。
在本发明的一些实施方案中,所述用于添加测序接头的引物对的上游引物和下游引物的测序接头序列分别具有SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示核苷酸序列。在本发明的一些具体实施方案中,所述用于添加测序接头的引物对的上游引物和下游引物分别具有SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示核苷酸序列。
本发明的第二方面提供一种高灵敏扩增子测序的方法,包括以下步骤:
S1,获得待测序DNA样本或cDNA样本;
S2,利用用于扩增目标区域的特异性引物对对步骤S1获得的待测序DNA样本或cDNA样本进行第一轮PCR扩增,得到第一PCR扩增产物;
S3,利用用于添加特异性分子标签的引物对对步骤S2获得的所述第一PCR扩增产物进行扩增,得到第二PCR扩增产物;
S4,利用用于添加测序接头的引物对对步骤S3获得的所述第二PCR扩增产物进行扩增,得到第三PCR扩增产物,即得到用于扩增子测序的DNA文库,
其中,所述用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物从5'端到3'端依次包括连接序列和靶向所述特异性引物对的扩增产物的第一靶向序列,用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物中至少一个的连接序列和第一靶向序列之间还连接有特异性分子标签序列;所述用于添加测序接头的引物对的上游引物和下游引物从5'端到3'端依次包括测序接头序列和靶向所述连接序列的第二靶向序列。
在本发明中,第一轮PCR扩增的目的是为了放大起始模板的数量,需要根据待测序样本的量或靶标序列的丰度,合理设置扩增循环数目。在本发明的一些实施方案中,所述第一轮PCR扩增的循环数目不小于5。在本发明的一些具体实施方案中,所述第一轮PCR扩增的循环数目为10~30。在本发明的一些优选实施方案中,所述第一轮PCR 扩增的循环数目为5。
在本发明中,第二轮PCR扩增的目的是为了给第一轮PCR扩增的扩增产物添加 UMI标签。在本发明的一些实施方案中,所述第二轮PCR扩增的循环数目为2~10。在本发明的一些具体实施方案中,所述第二轮PCR扩增的循环数目为3。
在本发明的一些实施方案中,所述目标区域选自包括chr1:19018357-19018507、chr1:43806091-43806241、chr1:47746603-47746753、chr1:65311187-65311337、 chr1:110883842-110883992和chr1:157545309-157545459的组中的至少一个,包含的突变位点信息如下:
目标区域 | 变异起始 | 变异终止 | 参考碱基 | 变异碱基 |
chr1:19018357-19018507 | 19018405 | 19018405 | G | A |
chr1:43806091-43806241 | 43806166 | 43806166 | G | A |
chr1:47746603-47746753 | 47746678 | 47746678 | G | C |
chr1:65311187-65311337 | 65311262 | 65311262 | G | A |
chr1:110883842-110883992 | 110883917 | 110883917 | A | G |
chr1:157545309-157545459 | 157545384 | 157545384 | T | C |
在本发明的一个具体实施方案中,用于扩增目标区域chr1:19018357-19018507的特异性引物对分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列;用于扩增目标区域chr1:43806091-43806241的特异性引物对分别具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列;用于扩增目标区域chr1:47746603-47746753的特异性引物对分别具有SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列;用于扩增目标区域 chr1:65311187-65311337的特异性引物对分别具有SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列;用于扩增目标区域chr1:110883842-110883992的特异性引物对分别具有 SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示核苷酸序列;用于扩增目标区域 chr1:157545309-157545459的特异性引物对分别具有SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12 所示核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中,所述用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物的连接序列分别具有SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中,用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物的连接序列和第一靶向序列之间均连接有特异性分子标签序列。
在本发明的一些实施方案中,所述特异性分子标签序列包括3~10nt随机序列,即N3~10。其中,N表示A、T、C或G。在本发明的一些具体实施方案中,所述特异性分子标签序列具有SEQ ID NO.15所示核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中,所述第一轮PCR扩增的体系如下:
组分 | 用量(μL) |
2×Pfu Mix | 25 |
特异性引物(各5μM) | 2 |
待测序DNA样本或cDNA样本(1%,50ng) | 1 |
灭菌水 | 补足至50 |
在本发明的一些实施方案中,所述第一轮PCR扩增的程序如下:
在本发明的一些实施方案中,所述第二轮PCR扩增的体系如下:
在本发明的一些实施方案中,所述第二轮PCR扩增的程序如下:
在本发明的一些实施方案中,所述第三轮PCR扩增的体系如下:
在本发明的一些实施方案中,所述第三轮PCR扩增的程序如下:
在本发明的一些实施方案中,所述第一PCR扩增产物和所述第二PCR扩增产物在进行下一轮PCR扩增之前,进一步包括纯化的步骤。在本发明的一些具体实施方案中,利用磁珠对所述第一PCR扩增产物和所述第二PCR扩增产物进行纯化。在本发明的一些优选实施方案中,纯化时磁珠用量与扩增产物用量相同。在本发明的另一些优选实施方案中,纯化后利用TE缓冲液洗脱。
本发明的第三方面提供利用本发明第一方面任一所述的试剂盒或利用本发明第二方面任一所述的方法构建的DNA文库。
本发明的第四方面提供引物对组合在制备用于基于高通量测序检测低频率突变的试剂盒中的应用,所述引物对组合包括:
(1)至少一个用于扩增目标区域的特异性引物对;
(2)用于添加特异性分子标签的引物对;
(3)用于添加测序接头的引物对,
其中,所述用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物从5'端到3'端依次包括连接序列和靶向所述特异性引物对的扩增产物的第一靶向序列,用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物中至少一个的连接序列和第一靶向序列之间还连接有特异性分子标签序列;所述用于添加测序接头的引物对的上游引物和下游引物从5'端到3'端依次包括测序接头序列和靶向所述连接序列的第二靶向序列。
在本发明的一些实施方案中,所述目标区域选自包括chr1:19018357-19018507、chr1:43806091-43806241、chr1:47746603-47746753、chr1:65311187-65311337、 chr1:110883842-110883992和chr1:157545309-157545459的组中的至少一个,包含的突变位点信息如下:
目标区域 | 变异起始 | 变异终止 | 参考碱基 | 变异碱基 |
chr1:19018357-19018507 | 19018405 | 19018405 | G | A |
chr1:43806091-43806241 | 43806166 | 43806166 | G | A |
chr1:47746603-47746753 | 47746678 | 47746678 | G | C |
chr1:65311187-65311337 | 65311262 | 65311262 | G | A |
chr1:110883842-110883992 | 110883917 | 110883917 | A | G |
chr1:157545309-157545459 | 157545384 | 157545384 | T | C |
在本发明的一个具体实施方案中,用于扩增目标区域chr1:19018357-19018507的特异性引物对分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列;用于扩增目标区域chr1:43806091-43806241的特异性引物对分别具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列;用于扩增目标区域chr1:47746603-47746753的特异性引物对分别具有SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列;用于扩增目标区域 chr1:65311187-65311337的特异性引物对分别具有SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列;用于扩增目标区域chr1:110883842-110883992的特异性引物对分别具有 SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示核苷酸序列;用于扩增目标区域 chr1:157545309-157545459的特异性引物对分别具有SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12 所示核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中,所述用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物的连接序列分别具有SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中,用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物的连接序列和第一靶向序列之间均连接有特异性分子标签序列。
在本发明的一些实施方案中,所述特异性分子标签序列包括3~10nt随机序列,即N3~10。其中,N表示A、T、C或G。在本发明的一些具体实施方案中,所述特异性分子标签序列具有SEQ ID NO.15所示核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中,所述突变包括SNP和Indel突变。
在本发明的一些实施方案中,所述高通量测序平台采用边合成边测序的测序平台。在本发明的一些具体实施方案中,所述高通量测序采用Illumina二代测序平台。
本发明的有益效果
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
本发明采用三轮PCR扩增进行扩增子测序建库,灵敏度高。
本发明利用带特异性分子标签序列的引物,无需跟踪拷贝数,可达到区分来自单个分子冗余的PCR重复序列,减少重复定量,屏蔽PCR偏好性,矫正测序错误,以达到绝对定量;相同UMI标记的reads可进行相互矫正,对于测定的reads均会保留,而不会被当作背景噪音剔除,相比常规建库方式得到的有效数据量增多,可将部分低丰度转录本准确鉴定到;UMI标签降低了文库构建过程中的扩增及测序错误引入的假阳性,在进行突变分析中获得的信息更为准确。
本发明首先利用特异性引物扩增目标区域,进一步利用带UMI标签的引物进行标记,最后利用用于添加测序接头的引物对添加测序接头,其中,带UMI标签的引物包括特异性引物序列和连接序列,可以精准对第一轮PCR扩增的产物进行标记;所述用于添加测序接头的引物对包括测序接头序列和靶向所述连接序列的序列,用于精准对目标序列添加接头。三类引物对彼此关联,相互支撑,共同提高了突变检测的灵敏度。
附图说明
图1示出了本发明实施例1建库方法的流程示意图。
图2示出了经过三轮PCR扩增后构建的测序文件的凝胶电泳检测结果。1: Target-Specific PCR扩增产物(纯化后);2:第三轮PCR扩增产物;3:纯化后的第三轮PCR扩增产物。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例,否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量,且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下,本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考,且其等价的同族专利也引入作为参考,特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致,则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值,因此除非另有说明,否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值,条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如,如果记载组分、物理或其它性质(如分子量,熔体指数等)是100至1000,意味着明确列举了所有的单个数值,例如100,101,102等,以及所有的子范围,例如100到166,155到170,198到200 等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1,1.5等)的范围,则适当地将1个单位看作0.0001,0.001,0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5) 的个位数的范围,通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例,并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
术语“包含”,“包括”,“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在,且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问,除非明确说明,否则本申请中所有使用术语“包含”,“包括”,或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反,除了对操作性能所必要的那些,术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明,否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白,下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术,因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白,这里所公开的特定实施例可以做很多修改,仍然能得到相同的或者类似的结果,而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义,所有在此使用的技术和科学的术语,和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同,在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法,均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林,2017)一书中所列的具体方法进行,或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备,如无特殊说明,均为实验室常规仪器设备;下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1三轮PCR扩增建库方法的建立
本实施例提供一种高灵敏扩增子测序的试剂盒及使用方法。
试剂盒包括三种引物对:用于扩增目标区域的特异性引物对;用于添加特异性分子标签(Unique Molecular Identifier,UMI)的引物对;用于添加测序接头的引物对。其中,用于添加UMI的引物对的引物从5'端到3'端依次包括连接序列、UMI序列和靶向特异性引物对的扩增产物的序列;用于添加测序接头的引物对的引物从5'端到3'端依次包括测序接头序列和靶向连接序列的序列。
利用上述试剂盒进行建库,包括以下步骤(如图1所示):
(1)获得待测序DNA样本或cDNA样本;
(2)利用用于扩增目标区域的特异性引物对对步骤(1)获得的待测序DNA样本或cDNA样本进行第一轮PCR扩增;
(3)利用用于添加特异性分子标签的引物对对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行扩增;
(4)利用用于添加测序接头的引物对对步骤(3)获得的PCR扩增产物进行扩增,得到用于扩增子测序的DNA文库。
实施例2利用实施例1的建立的建库方法进行建库
发明人获得两个个体人的DNA样本,分别进行全外显子测序(Whole ExomeSequencing,WES),获得低频率位点。
(1)第一轮PCR扩增
选择表1所示变异位点进行靶向扩增测序。
表1靶向扩增测序变异位点信息
变异位点编号 | 变异位点所在染色体 | 起始 | 终止 | 参考碱基 | 变异碱基 |
1 | chr1 | 19018405 | 19018405 | G | A |
2 | chr1 | 43806166 | 43806166 | G | A |
3 | chr1 | 47746678 | 47746678 | G | C |
4 | chr1 | 65311262 | 65311262 | G | A |
5 | chr1 | 110883917 | 110883917 | A | G |
6 | chr1 | 157545384 | 157545384 | T | C |
根据表1中变异位点选择靶向扩增区域并分别设计特异性引物,扩增区域及引物序列信息如表2所示。
表2靶向扩增区域及引物序列信息
注:F表示正向引物,R表示反向引物。
发明人进一步在100ng纯合子DNA样本中混合1ng杂合子DNA样本,构建变异频率为0.5%的样本,作为标准品DNA。以该标准品DNA为模板,利用上述引物进行第一轮PCR扩增,第一轮PCR扩增的体系和程序分别如表3和表4所示。
表3第一轮PCR扩增体系
组分 | 用量(μL) |
2×Pfu Mix | 25 |
引物(各5μM) | 2 |
标准品DNA(1%,50ng) | 1 |
灭菌水 | 补足至50 |
表4第一轮PCR扩增程序
PCR扩增产物纯化使用AMPure XP磁珠,按照说明书中的步骤进行:
(1)将AMPure XP磁珠提前30min从4℃冰箱中取出,颠倒混匀后静置使其温度平衡至室温。
(2)待AMPure XP磁珠充分混匀后,转移全部PCR产物和等体积AMPure XP 磁珠至EP管中,低速涡旋振荡混合均匀,室温静置5min。
(3)将管置于磁力架上约2min,直至液体澄清,用移液器小心吸弃上清,不要吸到磁珠。
(4)加入200μL 80%乙醇,静置30sec,用移液器小心吸弃上清,不要吸到磁珠。
(5)加入200μL 80%乙醇,静置30sec,用移液器小心吸弃上清,不要吸到磁珠,短暂离心。置于磁力架上约2min,待磁力架吸附磁珠后,用20μL移液器将管底残留液体吸取,不要吸到磁珠。
(6)室温晾干2-5min,至磁珠表面不反光,注意勿让磁珠晾干至出现裂痕。
(7)从磁力架上取下EP管,加入52μL无菌水,低速涡旋振荡混合均匀,室温静置5min,短暂离心,将管置于磁力架上2min直至液体澄清,小心吸取50μL上清,并转移至新的1.5mL无菌EP管中。
(8)加入40μL AMPure XP磁珠,低速涡旋振荡混合均匀,室温静置5min。
(9)将管置于磁力架上2min,直至液体澄清。小心吸取85μL上清至新的1.5mL 无菌EP管中,注意不要吸到磁珠。
(10)向上清中加入10μL涡旋振荡后的AMPure XP磁珠,低速涡旋振荡混合均匀,室温静置5min。
(11)将管置于磁力架上约2min,直至液体澄清。用移液器小心吸弃上清,不要吸到磁珠。
(12)加入200μL 80%乙醇,静置30sec,用移液器小心吸弃上清,不要吸到磁珠。
(13)加入200μL 80%乙醇,静置30sec,用移液器小心吸弃上清,不要吸到磁珠置于磁力架上2min,待磁力架吸附磁珠后,用20μL移液器将管底残留液体吸取。
(14)室温晾干2-5min,至磁珠表面不反光,注意勿让磁珠晾干至出现裂痕。
(15)从磁力架上取下EP管,加入TE缓冲液,低速涡旋振荡混合均匀,室温静置5min,短暂离心。将管置于磁力架上2min直至液体澄清。
(16)小心转移上清至0.2mL PCR反应管中,注意不要吸到磁珠。纯化产物标记为:3step1产物。
(2)第二轮PCR扩增
以第一轮PCR扩增并纯化得到的3step1产物为模板,利用带UMI标签的引物进行第二轮扩增。在本实施例中,带UMI标签的引物从5'端到3'端依次包括连接序列、 UMI标签序列和上述特异性引物序列(target序列)。
对于上游引物,连接序列如下(SEQ ID NO.13):
5'-CCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
对于下游引物,连接序列如下(SEQ ID NO.14):
5'-CATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
其中,UMI标签包括3nt随机核苷酸,即NNN(SEQ ID NO.15)。
由此,带UMI标签的上游引物序列如下:
5'-CCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNN+target-3'
带UMI标签的下游引物序列如下:
5'-CATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNN+targ et-3'
第二轮PCR扩增的体系和程序分别如表5和表6所示。
表5第二轮PCR扩增体系
表6第二轮PCR扩增程序
利用前述方法对第二轮PCR扩增产物进行纯化,AMPure XP磁珠:第二轮PCR 产物=1:1进行纯化,最后加25μL TE洗脱,纯化产物标记为:3step2产物。
(3)第三轮PCR扩增
以第二轮PCR扩增并纯化得到的3step2产物为模板,利用用于添加测序接头的引物对进行第三轮扩增。其中,本实施例中用于添加测序接头的引物对的引物从5'端到 3'端依次包括测序接头序列和靶向上述特异性分子标签序列的序列。
对于用于添加测序接头的引物对的上游引物,测序接头序列为P5接头序列,其核苷酸序列如下(SEQ ID NO.16):
5'-AATGATACGGCGACCA-3'
对于用于添加测序接头的引物对的下游引物,测序接头序列为P7接头序列,其核苷酸序列如下(SEQ ID NO.17):
5'-CAAGCAGAAGACGG-3'
靶向UMI标签的序列同上述UMI标签序列。
由此,用于添加测序接头的引物对的上游引物的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.18):
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT CCGATCT-3'
用于添加测序接头的引物对的上游引物的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.19):
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC TTCCGATCT
-3'
第三轮PCR扩增的体系和程序分别如表7和表8所示。
表7第三轮PCR扩增体系
组分 | 用量(μL) |
2×Pfu Mix | 25 |
P5/P7引物(各10μM) | 2 |
3step2产物 | 20 |
灭菌水 | 补足至50 |
表8第三轮PCR扩增程序
利用前述方法对第三轮PCR扩增产物进行纯化,AMPure XP磁珠:第三轮PCR 产物=1:1进行纯化,最后加25μL TE洗脱。纯化前和纯化后分别取1μL进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图2所示。
由图1可知,利用三轮PCR扩增后,得到的文库条带单一、明亮,表示建库质量好,可进行下一步测序。
实施例3实施例2建立的文库的测序与分析
将实施例2构建的文库上机至illumina NovaseqPE150进行测序1M的reads数进行分析。
通过UMI2_PowerScan6(www.genekras.com)进行计算,所得分析结果:
作为对比,发明人利用两步法进行建库(相对于实施例2,省略第二步利用带UMI标签进行扩增的步骤,其余步骤均相同),对得到的文库利用同样的方法进行测序、分析。
利用实施例2构建的文库进行测序分析,结果如表9所示。
表9实施例1构建的文库的测序分析结果
注:
CHROM:参考序列名称。
POS:变异所在的left-most位置(1-base position),即发生变异的位置的第一个碱基所在的位置。
ID:变异的ID,对应着dbSNP数据库中的ID,若没有,则默认使用“.”。
REF:参考序列的等位碱基,即参考序列该位置的碱基类型。
ALT:变异的等位碱基,即变异所支持的碱基类型。
QUAL:变异的质量。
FILTER:此位点是否要被过滤掉,如果是PASS,则表示此位点可以考虑为变异位点。
INFO:变异的相关信息,ADP代表Phred质量值≥15的碱基的平均样本深度; WT代表归为参考(野生型)样本的数目;HET代表归为杂合样本的数目;NC代表未归类样本的数目。
FORMAT:变异的格式,GT代表基因型(Genotype),0/0表示样本中该位点为纯合位点,和REF的碱基类型一致,0/1表示样本中该位点为杂合突变,有REF和 ALT两个基因型(部分碱基与REF碱基类型一致,部分碱基与ALT碱基类型一致), 1/1表示样本中该位点为纯合突变,总体突变类型和ALT碱基类型一致;GQ代表“基因型的质量值”;SDP代表“由SAMtools报告的原始Read的深度”;DP代表“Phred质量值≥15的碱基的深度”;RD代表“支持参考碱基的深度(reads1)”;AD代表“支持变异碱基的深度(reads2)”;FREQ代表“变异等位基因频率”;PVAL代表“来自Fisher 精确检验的P值”;RBQ代表“支持参考碱基的平均质量(qual1)”;ABQ代表“支持变异碱基的平均质量(qual2)”;RDF代表“正向链支持参考碱基的深度(reads1plus)”; RDR代表“反向链支持参考碱基的深度(reads1minus)”;ADF代表“正向链支持变异碱基的深度(reads2plus)”;ADR代表“反向链支持变异碱基的深度(reads2minus)”。
SAMPLE:样本的值,对应FORMAT各个内容。
未使用带UMI标签引物进行扩增的测序分析结果如表10所示。
表10未使用带UMI标签引物进行扩增的测序分析结果
从表9和表10结果可知,在扩增子测序建库中,在利用靶标引物进行扩增后,再经带UMI标签的引物进行扩增,得到的文库进行测序后,分析结果中测序背景大大减少,灵敏度得到大大提高,尤其适用于低频率突变的检测。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州东盛生物科技有限公司
<120> 一种高灵敏扩增子建库试剂盒以及建库方法和应用
<130> XYD202110570
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> misc_feature
<400> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
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<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> misc_feature
<400> 19
caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatct 58
Claims (10)
1.一种高灵敏扩增子建库试剂盒,其特征在于,包括:
(1)至少一个用于扩增目标区域的特异性引物对;
(2)用于添加特异性分子标签的引物对;
(3)用于添加测序接头的引物对,
其中,所述用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物从5'端到3'端依次包括连接序列和靶向所述特异性引物对的扩增产物的第一靶向序列,用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物中至少一个的连接序列和第一靶向序列之间还连接有特异性分子标签序列;所述用于添加测序接头的引物对的上游引物和下游引物从5'端到3'端依次包括测序接头序列和靶向所述连接序列的第二靶向序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物的连接序列分别具有SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述特异性分子标签序列包括3~10nt随机序列。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述特异性分子标签序列具有SEQ IDNO.15所示核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述用于添加测序接头的引物对的上游引物和下游引物的测序接头序列分别具有SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示核苷酸序列。
6.一种利用权利要求1-5任一所述试剂盒进行高灵敏扩增子测序的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1,获得待测序DNA样本或cDNA样本;
S2,利用所述用于扩增目标区域的特异性引物对对步骤S1获得的待测序DNA样本或cDNA样本进行第一轮PCR扩增,得到第一PCR扩增产物;
S3,利用所述用于添加特异性分子标签的引物对对步骤S2获得的所述第一PCR扩增产物进行扩增,得到第二PCR扩增产物;
S4,利用所述用于添加测序接头的引物对对步骤S3获得的所述第二PCR扩增产物进行扩增,得到第三PCR扩增产物,即得到用于扩增子测序的DNA文库。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述第一轮PCR扩增的循环数目不小于5。
8.根据权利要求5或6任一所述的方法,其特征在于,所述第二轮PCR扩增的循环数目为2~10。
9.利用权利要求1-3任一所述的试剂盒或利用权利要求4-8任一所述的方法构建的DNA文库。
10.引物对组合在制备用于基于高通量测序检测低频率突变的试剂盒中的应用,所述引物对组合包括:
(1)至少一个用于扩增目标区域的特异性引物对;
(2)用于添加特异性分子标签的引物对;
(3)用于添加测序接头的引物对,
其中,所述用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物从5'端到3'端依次包括连接序列和靶向所述特异性引物对的扩增产物的第一靶向序列,用于添加特异性分子标签的引物对的上游引物和下游引物中至少一个的连接序列和第一靶向序列之间还连接有特异性分子标签序列;所述用于添加测序接头的引物对的上游引物和下游引物从5'端到3'端依次包括测序接头序列和靶向所述连接序列的第二靶向序列。
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