CN112011517B - 大熊猫lbp单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，本发明属于大熊猫血液、尿液等样品中LBP浓度检测技术领域。本发明提供了大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株LBP_panda_1和LBP_panda_2，保藏号分别为CCTCC NO：C202084和CCTCC NO：C202085。本发明利用细胞融合技术，建立分泌抗LBP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，收集并纯化细胞株培养上清，获得高特异性LBP单克隆抗体应用于western blot蛋白检测，为LBP蛋白的定位和组织表达信息，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对大熊猫LBP蛋白质进行检测，并建立检测技术体系，同时作为大熊猫炎症状态判断指标之一。以及利用LBP高特异性的单克隆抗体对LBP受体的配体、拮抗物、抗拮抗物进行深入研究。脂多糖结合蛋白抗体应用于IHC、WB、IF、IP、ELISA等科研实验。

Description

大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明属于大熊猫血液/尿液LBP浓度检测技术领域，具体涉及大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

脂多糖(LPS)又称内毒素，是革兰阴性菌外膜的主要成分。LPS与急性期蛋白脂多糖结合蛋白(LPS Binding Protein，LBP)结合，可导致炎症反应失控及免疫防御屏障机能下降，引起全身炎性反应综合征、脓毒性休克、急性肺损伤甚至多器官功能障碍综合征.LBP属于I型急性期反应蛋白，相对分子质量为60000，存在于人和许多动物血清内。以单链多肽的形式在肝细胞内合成，应激时肝外组织也能合成，但合成量较少。LBP除主要在肝脏表达外，在肾脏、肺、小肠上皮等组织中也表达，对局部组织的炎症反应也具有重要作用。在致炎因素的刺激下，LBP的浓度可升高100至1000倍。LBP可催化LPS与CD14结合，LBP蛋白相对保守，大熊猫LBP与人的LBP蛋白序列相似度为80％，与狗的LBP蛋白序列相似度为89.32％。因此大熊猫LBP的检测，有助于研究大熊猫炎症反应机制，但目前没有快速有效的方法检测大熊猫LBP，无法精确检测大熊猫的LBP水平。

发明内容

本发明的目的在于提供大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，以解决现有技术无法精确检测大熊猫的LBP水平的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株LBP_panda_1和LBP_panda_2，保藏号分别为CCTCC NO：C202084和CCTCC NO：C202085。大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株LBP_panda_1和LBP_panda_2于2020年7月8日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏，保藏地址：中国武汉大学。

大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株LBP_panda_1或LBP_panda_2用于产生抗大熊猫LBP单克隆抗体。

抗大熊猫LBP单克隆抗体，由大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株LBP_panda_1或LBP_panda_2产生，亚型均为IgG1。

抗大熊猫LBP单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)根据NCBI数据库大熊猫LBP亚基氨基酸序列，序列如SEQ ID NO：1所示，选取其中如SEQ ID NO：2所示的一段进行人工合成，并与KLH蛋白偶联，作为生产特异性抗体的免疫原LBP-KLH；

(2)将步骤(1)中的免疫原LBP-KLH和佐剂一起注射至小鼠腹腔免疫小鼠，多次免疫，直至血清效价达标为止；

(3)采用常规方法对骨髓瘤细胞与脾细胞进行细胞融合，得到杂交瘤细胞；

(4)对杂交瘤细胞进行检测，筛选出抗体阳性最高的若干杂交瘤细胞，取其细胞分泌液做抗体亚型鉴定；

(5)将步骤(4)中抗体亚型鉴定为IgG1单克隆抗体的杂交瘤细胞大量培养，细胞长好后将细胞冻存，细胞分泌液收集后过柱纯化即得到抗体亚型鉴定为IgG1的抗大熊猫LBP单克隆抗体。

大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株LBP_panda_1和LBP_panda_2的制备方法，包括如下步骤：

(1)取抗体亚型鉴定为IgG1的抗大熊猫LBP单克隆抗体，偶联标记成LBP-HRP；

(2)再取对应的抗体亚型鉴定为IgG1的抗大熊猫LBP单克隆抗体，按照包被ELISA板子的方法包被板子，包被抗体浓度2ug/ml，与对应的LBP-HRP进行两两配对筛选；

(3)通过ELISA检测，筛选得到配对最好的两组LBP抗体与LBP-HRP，即筛选得到两株对应的抗大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株LBP_panda_1和LBP_panda_2。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明利用细胞融合技术，建立分泌抗LBP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，收集并纯化细胞株培养上清，获得高特异性LBP单克隆抗体应用于ELISA、western blot等蛋白检测，提高了大熊猫LBP检测特异性，进而精确检测大熊猫LBP水平；

2、本发明对LBP蛋白的定位和组织表达信息，酶联免疫吸附试验(ELISA)蛋白质检测，及利用LBP高特异性的单克隆抗体对LBP受体的配体、拮抗物、抗拮抗物进行了更为深入的研究；

3、本发明对LBP分泌及基因进行了进一步了解，为揭示生理规律提供了新的资料，筛选出来的抗体还可应用于IHC、wB、IF、IP、ELISA等科研实验。

附图说明

图1为LBP多肽倍比梯度稀释标准曲线图。

具体实施方式

下面结合各实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。

实施例1

本实施例提供一种抗大熊猫LBP单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

1.特异多肽片段的设计与合成：

根据NCBI数据库大熊猫LBP亚基氨基酸序列，序列如SEQ ID NO：1所示，选取其中如SEQ ID NO：2所示的一段进行人工合成，并与KLH蛋白偶联，作为生产特异性抗体的免疫原(LBP-KLH)，浓度为1mg/ml，氨基酸人工合成部分委托上海生工生物公司完成。

2.抗原免疫小鼠：

实验小鼠准备：8-10周龄Balb/c雌性小鼠3只，适应环境1周。

抗原处理：在免疫之前准备灭菌的玻璃注射器、一次性三通管、一次性注射器。先用无菌的玻璃注射器将抗原吸进注射器中(共1000μl，四只的量)，再用无菌的玻璃注射器将佐剂吸入注射器中(共1000μl，四只的量)；最后将两支玻璃注射器连在三通管上进行乳化，将抗原LBP-KLH和佐剂按照1∶1的比例混合乳化完全后(乳化大概5分钟，至油包水状态即可)，最后再将乳化好的混合液转入一次性注射器。

免疫小鼠：通过小鼠腹腔注射乳化混合液，以达到免疫小鼠的目的，且需要经过多次免疫，采集小鼠尾部血液，分离血清检测免疫效价，直至血清效价达标为止。首次免疫佐剂为弗氏完全佐剂，之后注射用量为首次免疫的一半，且采用弗氏不完全佐剂进行乳化。若抗原浓度大，体积小，可用氯化钠稀释后再与佐剂1∶1混合乳化。首免，腹腔注射，250μl一只(抗原量为150ug/只)。两周后进行第二次免疫，腹腔注射，250μl一只(从第二次免疫开始抗原都为75ug/只，之后免疫间隔时间为一周)。

免疫效价检测：第三次免疫后3到4天进行小鼠尾部采血，血液经12000rpm，离心8min，取血清进行ELISA实验测定其效价，效价达标后即可准备融合，效价不够高者需继续免疫直至达标，正常情况下需要免疫3-6次，根据测定结果决定是否加强免疫。

包被ELISA板子：

(1)多肽储存浓度为1.0mg/ml，需要包被工作浓度为2ug/ml，每块板子5.5ml，因而配1ELISA板(96孔板)需要取11μl 1.0ml/ml的多肽与5.5ml的包被液混匀，然后分别50μl/孔加样至ELISA板中，完成后用封板膜密封，放入4℃冰箱过夜(每次包被ELISA板的时间应相对固定，同一批次应包被多一些ELISA板子，以减小误差)。

(2)将上述的96孔板用洗板机添加洗液或手动洗涤3-5次后拍干板中液体。

(3)用包被液配制2.5％BSA封闭液，加封闭液200μl/孔，用封板膜密封，室温放置半天。

(4)板子中液体甩掉并在吸水纸上拍干液体。

(5)迅速用真空包装机抽真空，并做好标记，放入-20℃的冰箱中保存备用。

小鼠血清效价测定(ELISA)：

(1)取血清：小鼠尾部采血10滴左右，12000rpm，离心8min，取血清做好标记，将待测血清稀释到一定的倍数。

表1血清稀释表

稀释倍数	血清量(μl)	稀释液(PBS/μl)	终体积(μl)
				100	2	198	160
500	40(从上一管100倍稀释取)	160	150
				2000	50	150	120
5000	80	120	100
				10000	100	100	100
20000	100	100	100
				40000	100	100	200

(2)加样：分别在相应孔中加入待测血清(每个稀释倍数的血清做1孔)、阴性对照1孔，各加50μl/孔。

(3)温育：用封板膜封板后置于37℃温育箱(水平振荡200rpm)中温育30分钟。

(4)洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机或手动洗涤3-5次，尽量扣干板内液体。

(5)加双抗：羊抗鼠HRP稀释5000倍，50μl/孔。

(6)温育：用封板膜封板后置于37℃温育箱中温育30分钟。

(7)洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机或手动洗涤3-5遍，尽量扣干板内液体。

(8)显色：每孔加显色剂TMB 100μl，轻轻振荡混匀，温育箱内温育并观察，显色6-10min。

(9)比色测定：每孔加终止液50μl(1M HCl)，轻轻振荡混匀，酶标仪设置450nm波长读数，保存结果并分析。

3.细胞融合

3.1 SP2细胞的复苏

首先要严格按照无菌操作规范进行细胞培养实验，事先将15ml的离心管中加入5-10ml无菌的PBS缓冲液。冻存的SP2细胞(骨髓瘤细胞)从液氮中取出后快速放于37℃水浴锅中融化，使细胞松散；将细胞加入PBS中，混匀，1000rpm，5min，离心，弃上清，用PBS重复两次清洗SP2细胞后，用1ml事先准备好的10％DMEM完全培养液将细胞悬浮后，将细胞转入DMEM培养瓶中，做好标记，显微镜下观察细胞密度，最后将培养瓶放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

3.2 SP2细胞的传代

当培养瓶中的细胞长满瓶底80％左右，就可进行细胞传代。用枪头将细胞吹打下来，将培养液转至15ml离心管内，1000r/min，离心5分钟；弃上清，加5-10ml PBS，轻轻吹打混匀，再次离心弃上清，重复PBS洗涤步骤2次。洗涤后加2ml 10％DMEM完全培养液重悬细胞，取适量细胞至培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中传代培养。(需传代足够多SP2细胞用于细胞融合)

3.3免疫脾细胞制备

(1)处死小鼠

小鼠眼眶采血后，12000r/min离心8min，分装血清，-20℃保存备用。再断颈椎处死小鼠(不要伤及内脏)，放入75％酒精中浸泡。

(2)取小鼠脾脏

首先要严格按照细胞培养的无菌操作规范进行实验，处死小鼠后，将其在75％的酒精中浸泡5-10分钟，放在9cm的无菌平皿中，摆放在利于自己操作的位置(超净台中)，进行解剖。通过无菌操作取出小鼠脾脏，并尽量去除脾脏表面的脂肪组织。

(3)脾细胞悬液制备

先用PBS洗涤脾脏，洗3-5次后，将脾脏置于无菌平皿中，用眼科剪刀将脾脏尽可能的剪碎后，加PBS轻吹洗涤，用70微米的细胞过滤筛进行过滤，并收集分离的脾细胞悬液，1000r/min，离心5分钟，弃上清；再用5-10ml PBS洗涤，1000r/min，离心5分钟；重复三次，洗涤结束后加2ml不完全培养液(DMEM)重悬细胞，取10μl细胞稀释100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。

3.4 SP2细胞悬液的制备

将提前培养好的SP2细胞用移液枪吸取细胞液吹扫瓶底使绝大部分细胞悬浮，再将所有细胞液转移至50ml离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，再加PBS 5-20ml，混匀，1000r/min，离心5分钟，重复洗涤两次，洗涤结束后加2ml DMEM不完全培养液重悬细胞；取10μl细胞稀释100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。

3.5细胞融合

(1)细胞计数后，再将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶4(1∶10至1∶2之间)的比例混合；600rpm，离心3min；弃上清。轻轻弹击离心管底，使沉淀的细胞松动散开成为细胞悬液。

(2)1min内缓慢加入0.4-0.7ml提前37℃预热好的50％PEG溶液(根据细胞量的多少而增减PEG用量)，边加边轻微摇动和叩击。加完后静置1min。在聚乙二醇(PEG)作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

(3)开始匀速缓慢加10ml 37℃预热的DMEM不完全培养液以终止PEG的作用，边滴边叩击并旋转离心管，加完后静置2min。

(4)离心，800rpm，5min，弃上清；再用5-10ml PBS或DMEM不完全培养液洗涤2次，以去除残留的PEG。

(5)离心后弃上清，用40ml HAT选择培养液(39.2ml 10％DMEM完全培养液+0.8mlHAT)重悬细胞。

(6)上述融合细胞加入96孔细胞培养板内(若准备了巨噬细胞，将细胞培养液吸干，加100μl不完全培养液静置5-10min后吸干培养液，最后将融合细胞加入巨噬细胞培养板中)，每孔加200μl；将培养板置于CO₂培养箱中培养。

3.6选择培养

培养的第四天通过半液法换HAT培养液：用移液枪将96孔板中的上清液每孔吸取100μl，弃掉，再加入新的每孔100μl HAT培养液(HAT培养液配制为：10％的完全培养液∶HAT＝1∶50)，每块板子需要在10ml完全培养液中加入200μl 50×HAT。

培养的第七天半液法换HT培养液，用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100μl，弃掉，再加入新的每孔100μl HT培养液(HT培养液的配制为：10％的完全培养液∶HT＝1∶50)，每块板子需要在9.8ml完全培养液中加入200μl 50×HT。

3.7检测培养液中的抗体

对杂交瘤细胞进行检测，筛选出抗体阳性杂交瘤细胞：在培养7天左右可见孔内明显的克隆细胞，待克隆细胞长得足够多时(大概在第10-13天)，可吸取培养液检测其有无分泌抗体。

(1)将LBP多肽包被的ELISA板从冰箱拿出，恢复室温后，吸取事先确定需要检测的细胞孔的细胞分泌液100μl/孔，分别加至包被板中(注意不要污染细胞)，并事先做好标记留两孔做阴阳性对照，阴性对照用10％的DMEM完全培养液，阳性对照用稀释10000倍的血清(用融合前小鼠眼眶采血的血清)。

(2)温育：用封板膜封板后置于37℃温育箱中200rpm水平振荡1小时。

(3)洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机或手动洗涤3-5次，最后尽量扣干液体。

(4)加双抗：将羊抗鼠HRP稀释5000倍，50μl每孔。

(5)温育：用封板膜封板后置37℃温育箱30分钟。

(6)洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机或手动洗涤3-5遍，最后尽量扣干液体。

(7)显色：每孔加显色剂TMB100μl，轻轻振荡混匀，温育箱显色6-10min。

(8)比色测定：每孔加终止液50μl(1M HCl)，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长为450nm，测定OD值。

选取OD值高的细胞孔(至少为阴性对照的3倍)扩至多孔培养后，再次重复上述ELISA试验检测细胞分泌液中抗体，最后选择能够保持高OD值的9组细胞进行后续有限稀释实验。

3.8有限稀释筛选单克隆细胞

(1)阳性孔细胞的计数：先将孔中的细胞悬浮后转移到15ml的离心管中(边吹打边旋转，使细胞悬浮)，再补加10％的DMEM完全培养液至2ml；进行细胞计数之后取只含1000个细胞的细胞液进行下一步实验。

(2)将细胞液加入37℃预热的200ml完全培养液中，混匀，加入96孔培养板(边加边轻轻摇晃加样槽，使细胞均匀分布，从而每200μl含有单个细胞)，200μl/孔，共十块96孔板。

(3)将培养板置于CO₂培养箱中培养。

(4)培养4-5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，观察细胞的生长情况，记录只有单个克隆的孔。

(5)培养第4-7天给有记录的单个细胞的孔进行半液法换液，加10％完全培养液100μl/孔。

(6)第8-10天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测，将有单个细胞生长并且生长情况比较好的孔进行培养液的检测(做ELISA实验)，记录抗体阳性孔。找出的单个克隆阳性较强的孔，继续扩大培养，取细胞分泌液做抗体亚型鉴定，判断细胞株抗体亚型。

3.9细胞株抗体亚型鉴定(ELISA)

使用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用ELIsA试剂盒进行亚型鉴定。试剂盒信息：北京博奥龙免疫技术有限公司，货号：BF16001规格：2*96孔板。

实验步骤：

(1)首先将试剂盒恢复室温，然后用纯水把清洗液配成工作浓度(1份浓缩清洗液加19份纯水)。

(2)取出酶标版。每个样本需要8孔，阳性对照8孔，阴性对照8孔。

(3)将样本检测孔先加入样本稀释液各50μl/孔，然后将50μl细胞培养上清液加入酶标微孔板，每个样本加8孔；阳性对照和阴性对照不加样本稀释液也是各加8孔，100μl/孔。贴上封板膜37℃温育30分钟。

(4)弃去板内液体，洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干。再在每个样本的8个孔中分别加入8种酶标二抗(lgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、Kappa、Lambda)各100μl/孔，通用阳性、阴性对照的各孔也一样。贴上封板膜37℃温育30分钟。

(5)吸弃板内液体，洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干。每孔分别加入显色剂A和显色剂B各50μl，换一张新的封板膜避光37℃温育20分钟。

(6)将会看到孔内液体变成蓝色，显示蓝色的孔所对应的酶标二抗即为此标本的Ig类或亚类。将反应终止液(50μl/孔)终止反应后用酶标仪450nm测定波长，参考高值所对应的酶标二抗，阳性对照OD值一般不小于0.8，阴性对照一般不高于0.15，阳性判定标准：样品OD值大于OD+0.15，阴性OD低于0.05按0.05算。

结果：若为单抗，每个样品应在IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、lgM、lgA六个中只有一个孔显色，即只有一个亚型，若有多个孔显色，所选出的细胞分泌的并不是单抗，应继续筛选。Kappa、Lambda都属于免疫球蛋白的轻链。每一轻链上的型别只能属于两型别中的某一型别，而不能两者皆显色。

亚型鉴定结果如下表2所示。

表2亚型鉴定结果

如上表所示，9组LBP抗体在IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA六个指标中，均只有IgG1显色，筛选出LBP抗体1/LBP抗体2/LBP抗体4/LBP抗体9四组阳性最强单克隆龙抗体以及对应的杂交瘤细胞用于后续细胞株筛选试验。

3.10细胞株的扩大培养

(1)批量培养：将进行了亚型鉴定，结果为单抗的细胞孔转移到24孔板中(边旋转边吹打，使细胞悬浮，进行完全转移)培养，并加1000μl的10％完全培养液培养。

(2)观察细胞的生长情况，长得比较多之后进行效价测定，效价高的细胞进行转移，转移到小的培养瓶中培养(先将24孔板中的细胞吹打使细胞悬浮，在用加样枪将细胞转移到培养瓶中，补加10％的完全培养液7-9ml)。

(3)观察细胞生长情况，长得比较好之后再转移至大的培养瓶中培养。一个小的培养瓶分别转移两个大的培养瓶中进行培养(细胞传代)。

(4)可传5-10个大培养瓶进行培养，细胞长好后将细胞冻存，细胞分泌液收集，用于下一步抗体过柱纯化试验。

3.11抗体纯化

所用柱子为Pierce^TM Protein G Agarose。

(1)准备待过柱样品(细胞培养液或血清)，从冰箱中取出在常温下融化(选择9株细胞的细胞培养液进行过柱)。

(2)填充柱子，柱体积为2-5ml。

(3)洗柱：用25ml PBS洗涤(五倍柱子容积的PBS)。

(4)纯化：再向柱内持续加入5ml待纯化的样品，收集通过柱子的样品。

(5)洗涤：用40ml PBS洗涤(八倍柱子容积的PBS)，再用约20ml的甘氨酸洗脱(加入甘氨酸后先静置10分钟)。

(6)用EP管收集过滤后的液体，每管1ml(每管加5μl 1M Tris，调pH)。

(7)用考马斯亮初测浓度，如不变蓝则不继续收集。

(8)洗柱：用20ml PBS冲洗。

(9)保护柱体：加5ml的PBS和2％NaN₃保护柱床，4℃保存。

(10)将收集的样品加入到10000MWCO的离心管中。

(11)离心浓缩，5000rpm，15min，至液体只剩1-2ml为止。

(12)测定抗体浓度。

(13)将9个抗体分别分装后，-80℃保存。

3.12细胞冻存

(1)将鉴定的抗大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株LBP_panda_1和LBP_panda_2培养稳定后，将培养瓶中的细胞吹打使细胞悬浮在培养液中(细胞一般悬浮在培养液中或贴壁生长)，在将细胞转移至15ml或50ml的离心管中。

(2)离心，1000转/5分钟。

(3)用PBS洗涤两次：先将离心管中的上清液吸出，弃掉，加PBS，混匀，离心1000转/5分钟，最后预估细胞量加入10ml PBS悬浮。

(4)取10微升悬浮细胞稀释100倍，进行细胞计数，冻存细胞密度至少为1*10⁶/ml，活细胞率大于80％。

(5)将悬浮细胞离心后，用移液枪吸出上清液，再向细胞中加入适量冻存液(冻存液＝9ml胎牛血清+1ml DMS0，颠倒混匀，过滤备用)，混匀。

(6)最后加入冻存管中，每管1ml细胞液。放入冻存盒，先放-80℃24小时后，再将细胞放入液氮中长期保存。

4.通过ELISA检测法筛选特异性好、灵敏度高的抗大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株，包括如下步骤：

(1)取抗体亚型鉴定为IgG1的4组抗大熊猫LBP单克隆抗体，分别偶联标记LBP-HRP，此步骤委托上海生工生物公司完成。

(2)将4组抗大熊猫LBP单克隆抗体包被ELISA板子(包被抗体浓度2ug/ml)，与其对应的4个LBP-HRP进行两两配对，并通过调整LBP-HRP的稀释倍数以筛选ELISA反应特异性、灵敏性较好的配对，其中检测阳性对照样本为50μl/孔、5μg/ml的LBP多肽，用PBS 50μl/孔作为阴性对照。

(3)通过ELISA检测，筛选得到配对最好的两组LBP抗体与LBP-HRP，即筛选得到两株对应的抗大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株LBP_panda_1和LBP_panda_2。

本实施例最终从筛选到的9株阳性效价高的细胞中再次筛选得到两株特异性好、灵敏度高的抗大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株LBP_panda_1(保藏编号为CCTCC NO：C202084)和LBP_panda_2(保藏编号为CCTCC NO：C202085)。

实施例2

本实施例提供一种大熊猫血清中LBP浓度检测方法，包括如下步骤。

(1)用筛选确定的LBP抗体包被ELISA板子。

(2)用LBP多肽倍比梯度稀释作为标准曲线，向板中加入50μl/孔。LBP多肽梯度稀释浓度为25ug/ml、12.5ug/ml、6.25ug/ml、3.125ug/ml、1.5625ug/ml、0.78125ug/ml、0.390625ug/ml，标准曲线见图1。标准曲线显示该抗体在稀释倍数0.39-25范围内与抗体浓度呈现显著的线性关系。

(3)大熊猫个体血清样品检测：血清50ul/孔(若检测出浓度过高，超出检测范围时，需要稀释样品后重新检测)。

(4)温育：用封板膜封板后置37℃温育箱中温育30分钟。

(5)洗涤：小心揭掉封板膜，洗板机或者手动洗涤3-5次，最后尽量扣干水分。

(6)加LBP-HRP：用PBS将LBP-HRP稀释500倍，50μl/孔。

(7)温育：用封板膜封板后置37℃温育箱中温育30分钟。

(8)洗涤：小心揭掉封板膜，洗板机或者手动洗涤3-5次，最后尽量扣干水分。

(9)显色：用柠檬酸钠缓冲液将显色剂TMB稀释后，100μl/孔，温育箱中37℃温育，所有样品都显色10min。

(10)比色测定：显色结束后，加终止液50μl/孔(1M HCl)，迅速完成加终止液的操作后，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长为450nm，测定各孔值。

根据测定的OD值，计算血清中LBP蛋白的浓度(表3)。

表3大熊描血清检测结果

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都大熊猫繁育研究基地

<120> 大熊猫LBP多肽单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 481

<212> PRT

<213> NCBI数据库大熊猫LBP亚基氨基酸

<400> 1

Met Arg Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Ser Leu Leu Leu Arg Ala Leu

1 5 10 15

Leu Thr Ser Thr Pro His Ala Leu Gly Ala Asn Pro Gly Leu Val Ala

20 25 30

Arg Ile Thr Asp Lys Gly Leu Glu Tyr Val Ala Arg Glu Gly Ser Val

35 40 45

Ala Leu Gln Lys Glu Leu Leu Arg Ile Thr Leu Pro Asp Phe Thr Gly

50 55 60

Asp Phe Lys Ile Lys Pro Phe Gly Arg Gly His Tyr Glu Phe His Ser

65 70 75 80

Leu Ser Leu His Ser Cys Glu Leu Arg Gly Ser Ala Leu Thr Pro Leu

85 90 95

Pro Gly Gln Gly Leu Ser Leu Thr Ile Ser Asp Ser Phe Val Arg Val

100 105 110

Gln Gly Glu Trp Lys Val Arg Lys Ala Phe Val Lys Leu His Gly Ser

115 120 125

Phe Asp Val Gln Val Lys Gly Ile Thr Ile Ser Val Asn Leu Leu Leu

130 135 140

Gly Arg Glu Pro Ser Gly Arg Pro Thr Val Thr Ala Ser Gly Cys Ser

145 150 155 160

Ser His Ile Arg Asp Val Glu Val Asp Val Ser Gly Asp Leu Gly Trp

165 170 175

Leu Leu Asn Leu Phe His Asn Gln Ile Glu Ser Lys Phe Arg Arg Met

180 185 190

Leu Glu Ser Lys Ile Cys Glu Met Leu Gln Asn Ser Val Thr Ser Asp

195 200 205

Leu Arg Pro Tyr Leu Gln Thr Leu Pro Val Thr Thr Glu Ile Asp Ser

210 215 220

Phe Ala Asn Ile Asp Tyr Ser Leu Met Glu Ala Pro Arg Ala Thr Ala

225 230 235 240

Gln Met Leu Asp Val Met Phe Lys Gly Glu Ile Phe Asn Arg His His

245 250 255

Tyr Ser Pro Val Thr Phe Leu Ala Pro Val Met Asn Leu Pro Glu Gln

260 265 270

His Asp Arg Met Val Tyr Phe Ala Ile Ser Asp Tyr Val Phe Asn Thr

275 280 285

Ala Ser Leu Val Tyr His Glu Leu Gly Tyr Met Asn Phe Ser Ile Thr

290 295 300

Asp Asp Met Val Pro Pro Ser Ser Asn Ile Arg Leu Thr Thr Lys Ser

305 310 315 320

Phe Arg Pro Phe Val Pro Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Pro Asn Met Asn

325 330 335

Leu Glu Leu Gln Gly Ala Met Ala Ser Ala Pro Phe Leu Asn Phe Ser

340 345 350

Pro Gly Asn Leu Ser Ser Thr Pro Leu Ile Asp Ile Glu Ala Phe Val

355 360 365

Leu Leu Pro Ser Ser Val Arg Glu Pro Val Phe Arg Leu Gly Val Ala

370 375 380

Thr Asn Met Ser Ala Met Leu Thr Phe Asn Thr Ser Lys Ile Thr Gly

385 390 395 400

Leu Leu Lys Pro Gly Lys Ile Gln Val Glu Leu Lys Glu Ser Lys Val

405 410 415

Gly Val Phe Asn Val Ala Leu Leu Glu Gly Leu Leu Asn Tyr Tyr Ile

420 425 430

Leu Ser Thr Leu Tyr Pro Lys Val Asn Glu Lys Leu Ala Glu Gly Phe

435 440 445

Pro Leu Pro Leu Leu Lys Asp Ile Arg Leu Tyr Asp Pro Val Leu Glu

450 455 460

Ile His Lys Asp Phe Leu Phe Leu Gly Thr Asn Leu Gln Tyr Met Arg

465 470 475 480

Ala

<210> 2

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Leu Leu Gly Arg Glu Pro Ser Gly Arg Pro Thr Val Thr Ala Ser Gly

1 5 10 15

Cys Ser Ser His Ile Arg Asp Val Glu Val Asp Val Ser Gly Asp Leu

20 25 30

Gly Trp Leu Leu Asn Leu Phe His Asn Gln Ile Glu Ser Lys Phe Arg

35 40 45

Arg Met

50

Claims (3)

1.大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株LBP_panda_1或LBP_panda_2，保藏号分别为CCTCC NO：C202084和CCTCC NO：C202085。

2.权利要求1所述的大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株LBP_panda_1或LBP_panda_2用于产生抗大熊猫LBP单克隆抗体的用途。

3.抗大熊猫LBP单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述大熊猫LBP单克隆抗体杂交瘤细胞株LBP_panda_1或LBP_panda_2产生，亚型均为IgG1。

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