CN108486066A

CN108486066A - 一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗流产衣原体的单抗

Info

Publication number: CN108486066A
Application number: CN201810162660.8A
Authority: CN
Inventors: 何诚; 郭永霞
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2038-02-27
Also published as: CN108486066B

Abstract

本发明属于免疫学领域，具体公开了一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗流产衣原体的单抗。本发明以纯化获得的原核表达流产衣原体主要外膜重组蛋白(MOMP)作为抗原免疫小鼠，通过间接ELISA方法筛选阳性克隆，获得了分泌针对流产衣原体主要外膜重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞CA1‑MM 01。该杂交瘤细胞经连续传代培养和冻存后的稳定性，以及单克隆抗体的亚型、及效价等方面，对所获得的单克隆抗体进行了鉴定，结果表明所获得的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强而且稳定，单克隆抗体效价高。所获得的流产衣原体单克隆抗体荧光素标记后直接荧光法检测样本，实验结果表明所获得的单克隆抗体均对流产衣原体具有很高的特异性和很强的结合能力。

Description

一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗流产衣原体的单抗

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体地说，涉及一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗流产衣原体的单抗。

背景技术

流产衣原体(Chlamydia abortus，C.abortus)是一种介于细菌和病毒之间的专性细胞内寄生的革兰氏阴性微生物，其能引起各种动物和人的感染，是一种重要的人畜共患病的病原体。流产衣原体是小的反刍动物(绵羊和山羊)感染性流产最常见的病原体，亦能引起牛、猪等牲畜流产，孕妇感染后可发生流产或者其它疾病。流产衣原体病给集约化养殖业造成威胁，对许多国家和地区的畜牧业生产造成巨大的经济损失的同时对公共卫生产生影响。

衣原体的检测与诊断技术现阶段主要基于分子生物学检测方法和免疫学检测方法。分子生物学诊断方法是根据扩增靶序列建立的检测抗原的多聚酶链式反应(PCR)技术，靶序列的选择是依据MOMP基因，rRNA基因等保守性基因而建立，如扬州大学王成明已经建立的检测衣原体的PCR、多重PCR、荧光定量PCR等方法，然而该技术虽然灵敏，但是由于干扰因素较多，所用设备昂贵以及技术水平要求较高而很难在基层大规模检测中推广应用。

免疫学检测法是利用抗原抗体特异性结合反应来检测抗原或抗体的方法，常见的衣原体抗原试剂盒有：建立在LPS基础上的直接免疫荧光抗体检测技术(Imagen Chlamydaikit，ThermoFisher公司)以及放大ELISA试剂盒(IDEIA PCE Chlamydia K603211-2，Oxoid)。抗体检测试剂盒，如以沙眼衣原体交叉反应抗原制备的单克隆抗体与荧光素标记来检测沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体抗体(Savyon Diagnostics Ltd，以色列)。以MOMP做包被抗原的ELISA抗体检测试剂盒(IDVET，法国)，以流产衣原体多型外膜蛋白80-90kDa为包被抗原检测家畜流产衣原体抗体试剂盒(IDEXX，美国)。目前市场上流通的抗原和抗体检测试剂盒质量参差不齐从而导致检测结果不准确甚至因为检测结果不准引起误诊病情，延误病情进而很可能造成巨大经济损失。单克隆抗体具有纯度高、重复性好、与抗原结合特异性强等特点，将单抗应用于ELISA和荧光检测方法中，可大大提高试验特异性和准确性。本发明所述的特异性和稳定性很高的流产衣原体单克隆抗体为制备高质量检测流产衣原体试剂或试剂盒奠定基础，弥补现有同类检测试剂或试剂盒的特异性和灵敏度不高等不足。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗流产衣原体的单抗。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明以纯化获得的原核表达流产衣原体主要外膜重组蛋白(MOMP)作为抗原免疫小鼠，通过间接ELISA方法筛选阳性克隆，获得了分泌针对流产衣原体主要外膜重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞CA1-MM 01。

本发明提供一种杂交瘤细胞株CA1-MM 01，分类命名为流产衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：

100101)，保藏日期为2017年11月22日，保藏编号为CGMCC No.14882。

本发明提供的杂交瘤细胞株CA1-MM 01可用于制备高效价抗流产衣原体主要外膜蛋白的单克隆抗体CA1-MM 01H。

所述单克隆抗体CA1-MM 01H具有灵敏度高、特异性好的特点，且具有良好的荧光特性。

利用本发明所述杂交瘤细胞株CA1-MM 01分泌的抗流产衣原体主要外膜蛋白的单克隆抗体CA1-MM 01H，可对流产衣原体MOMP蛋白产生特异反应性。不仅如此，所述单克隆抗体良好的荧光特性，使得所述单克隆抗体CA1-MM 01H适宜作为荧光抗体，从而建立了一种直接荧光检测流产衣原体的方法。

因此，由本发明所述杂交瘤细胞株CA1-MM 01分泌的抗流产衣原体主要外膜蛋白的单克隆抗体CA1-MM 01H也属于本发明的保护范围。

第二方面，在利用杂交瘤细胞株CA1-MM 01获得所述单克隆抗体CA1-MM 01H的过程中，通过体外培养杂交瘤细胞的条件探索，发现应用特定配比的培养基可以逐渐降低杂交瘤细胞的贴壁依赖性，达到悬浮培养的驯化效果，最终达到杂交瘤细胞的悬浮培养从而大量生产的目的，提高单克隆抗体的表达量，提高了单克隆抗体分离纯化的效果。

因此，本发明还提供了一种由所述杂交瘤细胞株CA1-MM 01制备单克隆抗体CA1-MM 01H的方法，具体如下：

将杂交瘤细胞复苏后以2.5×10⁵cells/mL的密度培养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基的T75瓶中，37℃，5％CO₂的培养箱培养，培养48小时(此时细胞密度约为90％)，用胰蛋白酶消化传代，以2.5×10⁵cells/mL的密度培养于含8％胎牛血清的RPMI1640培养基的T75瓶中，37℃，5％CO₂的培养箱培养，培养48小时；第三次传代时胎牛血清浓度递减到6％，其他条件同上进行培养；第四次传代培养时用胰蛋白酶消化收取处于对数生长期的杂交瘤细胞，1000r，10min离心后，以2.5×10⁵cells/mL密度培养于125mL摇瓶中，其培养基为含4mmol/L Gln，4％胎牛血清的RPM1640:SFM4CHO:OptiCHO(3.5:3.5:3)的混合培养基，放置于5％CO₂、37℃、125r/min转速中摇床培养；每隔48h换液传代(大约连续传代3-4次)细胞状态达到稳定后，再次降低胎牛血清浓度至2％，培养基为含4mmol/L Gln和2％胎牛血清的RPM1640:SFM4CHO:OptiCHO(4:4:2)的混合培养基，其他培养环境同上，连续培养2代，杂交瘤细胞最终达到悬浮生长状态，单克隆抗体的分泌表达量达到最高，约150mg/L。

其中，所述方法中涉及到的培养基及各试剂均为市售可得商品。

第三方面，本发明提供了所述单克隆抗体CA1-MM 01H在制备流产衣原体检测试剂或试剂盒方面的应用。

作为优选，所述试剂或试剂盒为流产衣原体直接荧光检测试剂或试剂盒。

进一步地，基于上述制备所得的流产衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体(CA1-MM01H)的良好的特异性和荧光特性，以抗体CA1-MM01H作为荧光抗体，从而建立直接荧光检测流产衣原体的方法。

所述直接荧光检测流产衣原体的方法，是以荧光素标记的上述流产衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体(CA1-MM01H)直接与组织细胞中相应抗原结合，在荧光显微镜下检测特异荧光来检测流产衣原体。

具体步骤包括：

(1)制备病料切片：采取疑似流产病料，如取脾脏、子宫粘膜、***粘膜组织、喉头粘液等组织切取适量。如果是组织，需要在4℃条件下研磨后，庆大霉素室温处理30min，1，000r/min，离心10min，弃沉淀，用上清感染已长至单层的McCoy细胞(24孔细胞板中预先放置盖玻片)，感染24～48h，取出感染的盖玻片，用预冷的甲醇或无水乙醇固定10～20min；或者将上述组织做0.1～0.3mm厚度的切片，贴片于冷甲醇浸泡过的玻片上；或者将采集到的可疑呼吸道或***拭子抹片，放置于冷丙酮中固定，取出晾干，-20℃保存备用；

(2)直接免疫荧光诊断方法的建立：首先配置荧光单克隆抗体液——取出荧光标记流产衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体，用灭菌PBS以1:500比例稀释单克隆抗体，同时用灭菌PBS以8:1比例稀释伊文思蓝，然后将已经稀释好的单抗和伊文思蓝以7:1的比例进行配比混匀得到最终的荧光抗液体，放置4℃备用；取出制备好的玻片，先滴加PBS浸润10min，然后滴加约25μL的荧光标记流产衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体，装入一湿盒中，37℃孵育30min，取出用PBS洗涤3次，每次5min，洗涤结束后，避光自然干燥5～10min，用体积分数50％甘油封片，荧光显微镜观察。同时以衣原体感染阳性玻片为阳性对照，以未感染的玻片为阴性对照。

进一步地，由单克隆抗体CA1-MM 01H制备的流产衣原体检测试剂或试剂盒，或含有单克隆抗体CA1-MM 01H的检测试剂或试剂盒均属于本发明的保护范围。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明以纯化获得的原核表达流产衣原体主要外膜重组蛋白(MOMP)作为抗原免疫小鼠，通过间接ELISA方法筛选阳性克隆，获得了分泌针对流产衣原体主要外膜重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞CA1-MM 01。从杂交瘤细胞经连续传代培养和冻存后的生物学特性，以及单克隆抗体的类型、亚类及效价等方面，对所获得的单克隆抗体生物学特性进行了***鉴定，结果表明所获得的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强而且稳定，单克隆抗体效价高。直接荧光检测实验结果表明所获得的单克隆抗体均能针对流产衣原体r-MOMP蛋白进行检测，具有很强的特异性和荧光特性，适宜作为荧光抗体建立直接荧光检测方法。为建立人畜共患病的病原体——衣原体的免疫学检测方法奠定基础。

附图说明

图1为流产衣原体重组蛋白r-MOMP的SDS-PAGE电泳；其中，1：BL21(DE3)+pET-28a空质粒；2：BL21(DE3)+pET-28a+MOMP重组质粒；M：蛋白质分子量标准品。

图2为猪流产衣原体阳性血清进行Western-blot检测，结果显示该重组蛋白能够与衣原体特异性抗体结合，而对照阴性胎牛血清未出现特异性条带；1：BL21(DE3)空菌；2：BL21(DE3)+pET-28a；3：BL21(DE3)+pET-28a+MOMP重组质粒表达产物；M:蛋白质分子量标准品

图3为CA1-MM01H单克隆抗体的Western-blot检测结果；其中，A：猪流产衣原体阳性血清；B：杂交瘤细胞株CA1-MM 01分泌上清。

图4为CA1-MM01杂交瘤细胞的染色体图。

图5为荧光标记的单克隆抗体(CA1-MM01H)用直接免疫荧光法检测流产病料图；A：商品化试剂盒检测(IMAGENTM CHLAMYDIA，Oxoid Ltd，英国)检测细胞衣原体感染图；B：本发明所述单克隆抗体(CA1-MM01H)建立的直接免疫荧光检测法检测细胞衣原体感染图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1流产衣原体r-MOMP蛋白单克隆抗体的制备方法

1、材料和试剂配制：

流产衣原体：猪流产衣原体CP12菌株购自中国兽医药品监察所菌种保藏室；

细菌DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒：购自北京全式金生物有限公司；大肠杆菌DH5α：由本室保存；

pMD18-T Vector：购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；

大肠杆菌BL21(DE3)：本实验室保存；

pet-28a原核表达载体：购自Novagen公司；

异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)：购自Merk公司；

低分子量蛋白Marker：购自北京三泰生物技术有限公司；

尿素(分析纯)，考马斯亮蓝R-250，SDS，DAB，BPB和丽春红S：均购自北京科昊泽生物技术公司。

HAT选择培养基、HT选择培养基、胎牛血清、DMEM高糖培养基、RPMI1640培养基，SFM4CHO，OptiCHO：均购自Gibco公司；

辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鼠IgG、荧光素(FITC)标记兔抗鼠IgG抗体：均购自Abcm公司；

实验动物：纯系BALB/c小鼠，雌性，购自北京大学医学部实验动物部；

SepHadex Gln：购自Sigma公司；

2、流产衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备

(1)流产衣原体重组蛋白r-MOMP的制备

流产衣原体OmpA基因的制备和克隆：

将猪流产衣原体CP12菌株冻干粉用1毫升灭菌生理盐水稀释，接种于6日龄的SPF鸡胚，进行毒株的繁殖。收集3-6d天死亡的鸡胚的卵黄囊膜，加1mL的PBS研磨成悬液；3000rpm离心10min，弃沉淀保留上清，上清即为衣原体菌液，按细菌DNA提取试剂盒步骤提取衣原体基因组。参照GenBank:CR848038登录的流产衣原体S26/3菌株的OmpA基因序列，设计OmpA基因引物(如下P1，P2)并合成:

P1(F):5’—ATG AAA AAA CTC TTG AAA TCG G—3’(SEQ ID No.3)，

P2(R):5’—TTA GAA TCT GAA TTG AGC ATT CAT—3’(SEQ ID No.4)。

引物均由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

以上述提取的衣原体基因组为模板，扩增目的片段——OmpA基因。将扩增的OmpA基因与pMD18-T载体连接，重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态，LB/Amp平板筛选的阳性克隆菌放于37℃培养箱中培养12-16h。通过质粒的PCR和重组质粒的双酶切法鉴定为疑似阳性的重组菌送上海博亚生物技术公司做进一步测序验证。序列如SEQ ID No.1所示，编码SEQID No.2所示的蛋白。

OmpA基因的原核表达构建与鉴定:

以pMD18-T-OmpA重组质粒为模板，用引物P3，P4进行扩增，再与pET-28a原核表达载体连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，鉴定阳性菌落后送博亚生物技术公司测序。

P3(F):5’-GGG GTA CCG GAA TTC CTG GTC CCG CGT TTG CCT GTA GGG AAC CCAGC-3’(SEQ ID No.5)，

P4(R):5’-TT CCG CGG CCG CTA TGG CCG ACG TCG ACG CGT TTA GAA TCT GAATTG AGC-3’(SEQ ID No.6)。

(2)重组MOMP蛋白(r-MOMP)的诱导表达：

鉴定为阳性的含有重组质粒的BL21(DE3)菌于LB培养基中培养至对数生长中期(即菌液浓度达到OD600＝0.4-0.6)，加入IPTG(终浓度为1.0mmol/L)，37℃，3h后取出。应用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白。SDS-PAGE显示顺利的表达出与理论大小相符的重组蛋白(见图1)，目的蛋白大小与理论值相当[MW＝40.0(目的蛋白)+3.83kDa(载体pET-28a)＝43.8KDa]。用流产衣原体猪标准阳性血清对重组蛋白进行Western-blot检测，结果显示该重组蛋白在变性的条件下能够与衣原体特异性抗体结合，而对照的阴性胎牛血清未出现特异性条带(见图2)。

(3)重组蛋白(r-MOMP)的大量表达与纯化：

重组菌接于液体LB培养基后扩大表达，6000r离心收集菌体，PBS重悬后超声波裂解菌体，10000r，40min离心收集包涵体。本实验利用不同浓度的尿素溶液溶解和洗涤细菌包涵体：包涵体用去离子水重悬(1g:1mL比例)，首先用5M尿素溶液洗脱掉其它各杂蛋白而保留包涵体成分；再用10M尿素溶液充分溶解包涵体，之后对包涵体进行透析复性，将重组蛋白溶解液装入透析袋中，密封好，放入装有1L 8M尿素溶液的烧杯中，于4℃下透析10h，其后更换相同浓度的尿素溶解2次再透析；后进行梯度浓度尿素溶液的透析，依次为6M，4M，2M，1M，最后用0.1M Tris-HCl(pH8.5)透析10h；结束后SDS-PAGE检测透析后状况，最终得到纯化蛋白，测定浓度，分装，冷冻抽干，制成冻干粉，-80℃保存备用。

3、流产衣原体单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备

动物免疫：

取纯化浓缩的r-MOMP重组蛋白冷冻抽干粉，用适量的PBS溶液稀释，免疫6周龄Balb/c小鼠，共6次。第一次免疫方案为：r-MOMP重组蛋白与弗氏完全佐剂1:1体积比进行乳化，剂量为200μg/只，腹部多点皮下注射。第2次免疫：间隔两周后进行，第三次免疫间隔一周后进行，第2、3次均用弗氏不完全佐剂，体积比1:1，剂量为100μg/只，腹部多点皮下注射。第4次和第5次免疫每间隔一周进行，用抗原液免疫，剂量为100μg/只，腹腔注射。第5次免疫后一周，小鼠尾部小量采血，检测抗体效价，选择效价高数量级在10⁷以上的小鼠，在融合前三天做加强免疫，用抗原液腹腔注射，剂量为100μg/只。

细胞融合：

提前复苏准备好SP2/0骨髓瘤细胞。无菌取最后一次加强免疫后的小鼠的脾脏，轻轻研磨制备脾细胞悬液，配置成含有1×10⁸个脾细胞和2×10⁷个骨髓瘤细胞的混合悬液，并加入融合剂PEG4000进行融合。用HAT选择培养基将融合细胞悬浮均匀后加入96孔细胞板中，每孔100μL，置于5％CO₂培养箱内培养。

杂交瘤细胞的筛选和亚克隆：

待融合后的细胞克隆生长到覆盖细胞板孔底部1/4～1/3后，对克隆生长的培养上清用建立好的间接ELISA方法进行检测。将强阳性细胞孔根据有限稀释法进行亚克隆，阴性孔3天后再检测一次，若仍为阴性则弃之。经过4次的筛选和克隆化培养，得到3株能稳定分泌流产衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体且效价高的杂交瘤细胞。

4、流产衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体(CA1-MM01H)的体外大量制备

通过体外培养杂交瘤细胞的条件探索，我们应用特定配比的培养基可以逐渐降低杂交瘤细胞的贴壁依赖性，达到悬浮培养的驯化效果，最终达到杂交瘤细胞的悬浮培养从而大量生产的目的，提高单克隆抗体的表达量，提高了单克隆抗体分离纯化的效果，操作如下：

将杂交瘤细胞复苏后以2.5×10⁵cells/mL的密度培养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基的T75瓶中，37℃，5％CO₂的培养箱培养，培养48小时(此时细胞密度约为90％)，用胰蛋白酶消化传代，以2.5×10⁵cells/mL的密度培养于含8％胎牛血清的RPMI1640培养基的T75瓶中，37℃，5％CO₂的培养箱培养，培养48小时。第三次传代时胎牛血清浓度递减到6％，其他条件同上进行培养。第四次传代培养时用胰蛋白酶消化收取处于对数生长期的杂交瘤细胞，1000r，10min离心后，以2.5×10⁵cells/mL密度培养于125mL摇瓶中，其培养基使用特定配比为——含4mmol/L Gln，4％胎牛血清的RPM1640:SFM4CHO:OptiCHO(3.5:3.5:3)的混合培养基，放置于5％CO2、37℃、125r/min转速中摇床培养。每隔48h换液传代(大约连续传代3-4次)细胞状态达到稳定后，再次降低胎牛血清浓度至2％，培养基特定配比为4mmol/L Gln，2％胎牛血清的RPM1640:SFM4CHO:OptiCHO(4:4:2)，其他培养环境同上，连续培养2代，杂交瘤细胞最终达到悬浮生长状态，单克隆抗体的分泌表达量达到最高，约150mg/L。

5、流产衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体(CA1-MM01H)的鉴定和纯化

(1)单克隆抗体(CA1-MM01H)的鉴定：

单克隆抗体亚型鉴定：采用Sigma公司小鼠单克隆抗体分型试剂盒，应用琼脂扩散试验测定表明，获得的3个杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体都是IgG1型：CA1A-1MM01H，CA1A-2MM02H，CA1A-3MM03H型。

杂交瘤细胞培养上清效价测定：应用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清液的效价。结果表明C.abortus r-MOMP蛋白单克隆抗体CA1A-1MM01H(IgG1型)抗体效价最高，将分泌该抗体的杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

杂交瘤细胞培养上清Western-blot检测：将猪流产衣原体CP12菌株冻干粉用1毫升灭菌生理盐水稀释，接种于6日龄的SPF鸡胚，进行毒株的繁殖。收集3-6d天死亡的鸡胚的卵黄囊膜，加1mL的PBS研磨成悬液；3000rpm离心10min，取上清定量作为免疫印迹试验抗原，一抗为流产衣原体猪标准阳性血清和待检单克隆抗体CA1MM01H分别用封闭液(5％脱脂奶粉，TBST配制)1：1000稀释，二抗为用抗体稀释液(PBS，pH7.2溶液)1：1000稀释的HRP标记的兔抗猪IgG和HRP标记的羊抗小鼠IgG。

编号	A	B
			抗原	CP12菌液	CP12菌液
上样量	1μg	1μg
			一抗	猪流产衣原体阳性血清	CA1-MM01H悬浮培养上清
一抗稀释比例	1：1000	1:1000

结果显示，在免疫印迹试验中，DAB显色后，PVDF转印膜上有一41KDa左右的条带，与流产衣原体主要外膜蛋白(MOMP)的理论大小相符，表明制备的单克隆抗体具有特异性和免疫原性(图3)。

杂交瘤细胞染色体鉴定——秋水仙素法。细胞培养24h，加秋水仙素使终浓度为0.2mg/L，继续培养4h，消化并收集细胞，2000r/min，10min离心，收细胞沉淀，沉淀中加入37℃预热的0.075mol/L KCl10mL，吹吸均匀后置于37℃水浴140min，使细胞肿胀。2000r/min，10min离心弃上清后，细胞沉淀用甲醇:冰醋酸＝3:1的混合液10mL固定30min，以2000r/min，离心10min，反复3次后弃上清后取细胞沉淀涂片，自然干燥后用Giemsa染色，油镜检查。杂交瘤细胞CA1-MM01染色体100～108条(图4)。可以看出染色体数目为104条，表明传代培养的细胞未发生变异。

(2)单克隆抗体(CA1-MM01H)的纯化

收取流产衣原体单克隆抗体杂交瘤细胞株的悬浮培养上清，加PBS 40mL，然后缓慢加入4℃饱和硫酸铵溶液80mL(在磁力搅拌器或者玻璃棒搅拌下逐滴滴加)，使成50％的饱和液，置于4℃沉淀过夜。

①4℃，8000r/min，离心15min。

②弃去上清液后，所得沉淀加PBS 40mL溶解，再加饱和硫酸铵20mL(滴加方法同①)，使成为33.3％的饱和溶液，4℃沉淀过夜(此步骤重复三次)。

③4℃，8000r/min，离心15min，弃去上清，留沉淀，加少量3-5mL pH7.2 0.01mol/L

④PBS溶解(根据沉淀量上下浮动)，再用1-2mL PBS冲洗离心管，将二者混合放在透析袋里中，浸在pH 8.0 0.005mol/L PBS中4℃透析过夜脱盐，期间每隔4-6h更换一次PBS。

⑤取出透析袋中的液体，4℃，6000r/min，离心10min，弃沉淀，留上清(转速可通过观察适当调整)。

⑥测定蛋白浓度。

⑦将提纯的抗体贮于-20℃备用。

实施例2单克隆抗体(CA1-MM01H)直接免疫荧光检测方法的建立

1、试剂配制：

碳酸盐溶液的配制：0.5mol/L，pH9.5的碳酸盐溶液，碳酸氢钠3.7g，碳酸钠(无水)0.6g，蒸馏水100mL；PBS洗脱液的配制：pH7.2，0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·2H₂O)27g，氯化钠(NaCl)8.5g，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)0.39g，加蒸馏至1000mL。异硫氰荧光素(FITC)：购自Sigma公司，SepHadex G200葡聚糖凝胶：购自北京索莱宝公司。

2、荧光标记单克隆抗体法

根据测得的蛋白含量，称取蛋白含量的1/20质量的FITC(F7250，西格玛公司)溶于配制好的0.5mol/L，pH9.5的碳酸盐溶液，溶解时轻轻搅拌，避免产生气泡，将蛋白和FITC混合在烧杯里放在磁力搅拌器，4℃冰箱避光慢速搅拌过夜，收取标记好的蛋白。

3、葡聚糖凝胶除杂

试剂配制PBS洗脱液的配制：pH7.2，0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·2H₂O)27g，氯化钠(NaCl)8.5g，磷酸二氢钠(Na₂HPO₄·2H₂O)0.39g，加蒸馏至1000mL。根据蛋白和荧光素分子大小不同，洗脱速率不同，除去没与蛋白结合的荧光素，达到分离的效果。

3.1装柱：SepHadex G200葡聚糖凝胶，以每克添加至少20mL蒸馏水溶胀，称取18g加入500mL的蒸馏水浸泡24h，待葡聚糖沉降之后，倒去上层杂质，加入配制好的PBS，用移液枪吹打混匀，沿着柱壁缓慢加入到事先清洗好的普通层析柱里，避免产生气泡，期间不断向柱内加入PBS保证葡聚糖凝胶完全浸泡在PBS缓冲液中，大概以两倍柱体积PBS洗脱平衡后可以进行加样纯化。

3.2加样：加样前，首先把柱内凝胶上面多余的PBS放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐(或留一极薄液层)为止。然后以移液管或长枪头尽可能离液面近的地方逐滴加样，不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2-3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。

3.3过柱：以荧光标记好的蛋白逐滴加入到层析柱里面，标记上的蛋白会以较浅的荧光色率先通过层析柱留下来，没标记上的蛋白的荧光素会挂在凝胶柱上缓慢的流下来，收集率先留下来的为标记上的蛋白。

3.4收集：样品完全进入洗脱柱之后开始收集，并且每4mL收集一次，并按时间顺序编号，收集好的放进紫外灯下观看有无荧光，如果有一管开始产生荧光，便说明标记FITC的蛋白已开始洗脱下来，也可以配合肉眼观察如上图标记上的蛋白层会有淡黄色，并且较快被洗脱下来，重点收集这一层(可提前和延迟多收集一些防止流失)。

4.直接荧光检测法检测样本：

4.1组织样本处理：取疑似流产衣原体病料，取适量新鲜子宫粘膜、***粘膜，做成涂片，冷丙酮固定10分钟后，避光保存待检查。

4.2细胞样本处理：病料组织4℃条件下研磨后，200UI/mL庆大霉素室温处理30min，1000r/min，离心10min，弃沉淀，用上清感染已长至单层的McCoy细胞(24孔细胞板中预先放置盖玻片)，感染48h，取出盖玻片，用预冷的丙酮或甲醇固定10min，取出晾干，-20℃保存备用；

4.3以收集好的FITC标记的单抗与PBS按1:10、1:100、1:500、1:1000等倍数稀释，用灭菌PBS以8:1比例稀释伊文思蓝，然后将已经稀释好的单抗和伊文思蓝以7:1的比例进行配比混匀得到最终的荧光抗体液，放置4℃备用；取出制备好的玻片，先滴加PBS浸润10min，然后滴加约25μL的荧光标记流产衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体，装入一湿盒中，37℃孵育30min，取出用PBS洗涤3次，每次5min，洗涤结束后，避光自然干燥5～10min，用体积50％甘油封片，放于荧光显微镜下待检。同时以衣原体感染阳性玻片作为阳性对照，以未感染的玻片为阴性对照。并将直接免疫荧光诊断结果与衣原体属特异性脂多糖(LPS)包被的试剂盒检测结果做符合率比较。

利用荧光标记的单克隆抗体(CA1-MM01H)对所收集的50份样品进行检测，在荧光显微镜下流产衣原体在细胞浆中分布有圆型或椭圆形、均匀的荧光黄绿色、形状规则的发光颗粒。与衣原体属特异性脂多糖(LPS)包被的商品试剂盒检测(IMAGENTM CHLAMYDIA，Oxoid Ltd，英国)结果比较见表1和图5。

表1 C.abortus主要外膜重组蛋白单克隆抗体(CA1-MM01H)直接荧光法诊断与LPS包被的免疫荧光法检测结果比较

病料	MOMP	LPS	符合率
				阳性	49	50	98％
阴性	1	0	100％

综上所述，C.abortus CA1A-1MM01H单克隆抗体可用于快速诊断流产衣原体病。

实施例3杂交瘤细胞分泌抗体(CA1-MM01H)的稳定性和特异性检测

1、杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测

1)将杂交瘤细胞进行传代培养，逐一收集其细胞培养上清，每5代用间接ELISA方法检测其抗体效价，观察其抗体效价是否稳定；

2)杂交瘤细胞在液氮中冻存6个月以后进行复苏并连续传代培养，同样每传5代用间接ELISA方法检测其细胞培养液上清的抗体效价。

2、杂交瘤细胞分泌抗体特异性检测

分别以PEDV、PPV、PRV、CSFV、PRRS、PCV病原溶液和猪流产衣原体CP12菌液为抗原，用同样条件包被酶标板，一抗为阳性杂交瘤细胞培养上清、含血清和无血清细胞培养液；二抗为HRP标记兔抗鼠IgG，在酶标仪上读取OD450mn值，每个样品作3次重复求平均值，采用间接ELISA方法检测单克隆抗体的特异性。

3、结果

3.1杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测试验

1)将杂交瘤细胞CA1-MM 01连续传代20代，每5代用间接ELISA方法检测结果显示杂交瘤细胞在20代时依旧能够稳定分泌流产衣原体单克隆抗体结果见表2。

表2 杂交瘤细胞CA1-MM 01稳定性检测结果

传代次数	1	5	10	15	20
						抗体效价OD₄₅₀值(1:10240)	0.388	0.374	0.367	0.365	0.352

2)杂交瘤细胞的保存期试验

冻存在液氮里保存6个月的杂交瘤细胞，复苏培养传代至20代每5代取细胞培养液上清检测其抗体效价，测定结果显示冻存6个月后复苏的杂交瘤细胞株仍具有很好的分泌性，而且抗体水平稳定，效价并没有明显降低结果见表3。

表3 冻存后杂交瘤细胞CA1-MM 01稳定性检测结果

传代次数	1	5	10	15	20
						抗体效价OD₄₅₀值(1:10240)	0.369	0.356	0.342	0.331	0.320

3.2杂交瘤细胞分泌抗体特异性检测试验

分别以PEDV、PPV、PRV、CSFV、PRRS、PCV病原溶液和猪流产衣原体CP12菌液为抗原，用同样浓度(5μg/mL)同样条件包被酶标板后将杂交瘤细胞CA1-MM01株分泌上清1：1000比例稀释进行间接ELISA检测，结果标明获得的杂交瘤细胞CA1-MM01H株分泌单抗只对猪流产衣原体CP12株具有很强的特异性而对猪其他常见病原没有交叉反应检测结果见表4。

表4 杂交瘤细胞CA1-MM01株单抗间接ELISA特异性检测(OD₄₅₀)值

4、结论

杂交瘤细胞株CA1-MM01株稳定性试验和特异性试验表明杂交瘤细胞冻存保存并连续传代20代时，仍旧能够稳定分泌目标抗体并分泌的抗体效价仍然保持在稳定的水平上没有明显降低现象。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗流产衣原体的单抗

<141> 2018-02-24

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> 衣原体(chlamydia)

<400> 1

atgaaaaaac tcttgaaatc ggcattattg tttgccgcta cgggttccgc tctctcctta 60

caagccttgc ctgtagggaa cccagctgaa ccaagtttat taatcgatgg cactatgtgg 120

gaaggtgctt caggtgatcc ttgcgatcct tgctctactt ggtgtgatgc tatcagcatc 180

cgcgcaggat actacggaga ttatgttttc gatcgtgtat taaaagttga tgtgaataaa 240

actatcaccg gcatgggtgc agttcctaca ggaaccgcag cagctaatta caaaactcct 300

acggatagac ccaacatcgc ttacggcaaa cacttacaag acgccgaatg gttcaccaat 360

gcagctttcc tcgcattgaa tatctgggat cgctttgata ttttctgcac attaggcgct 420

tctaatgggt acttcaaagc tagttctgcg gcattcaacc tcgttggttt gattggtgtt 480

aaaggatcct ccatagcagc tgatcagctt cccaatgtag gcatcactca aggaatcgtt 540

gaattttata cagatacaac attctcttgg agtgtaggtg cacgcggagc tttatgggag 600

tgtggttgtg cgactttagg agcagagttc caatacgctc agtctaatcc taaaattgaa 660

atgttgaatg tagtctccag cccagcacaa tttgtggttc acaagcctag aggatacaag 720

ggaacagcat ttcctttacc tctaacagct ggtactgatc aggcaactga cactaagtcg 780

gctacaatta aataccacga atggcaagtt ggtttagcgc tctcttatcg attgaacatg 840

cttgttcctt acattagcgt aaactggtca cgagcaactt ttgatgctga cgctatccgc 900

atcgctcaac ctaaattagc tgctgctgtg ttaaacttga ccacatggaa cccaaccctt 960

ttaggagaag ctacagcttt agatactagc aacaaattcg ctgacttctt gcaaattgct 1020

tcgattcaga tcaacaaaat gaagtctaga aaagcttgtg gtgtagctgt tggtgcaacg 1080

ttaatcgacg ctgacaaatg gtcaatcact ggtgaagcac gcttaatcaa tgaaagagcc 1140

gctcacatga atgctcaatt cagattctaa 1170

<210> 2

<211> 389

<212> PRT

<213> 衣原体(chlamydia)

<400> 2

Met Lys Lys Leu Leu Lys Ser Ala Leu Leu Phe Ala Ala Thr Gly Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ser Leu Gln Ala Leu Pro Val Gly Asn Pro Ala Glu Pro Ser

20 25 30

Leu Leu Ile Asp Gly Thr Met Trp Glu Gly Ala Ser Gly Asp Pro Cys

35 40 45

Asp Pro Cys Ser Thr Trp Cys Asp Ala Ile Ser Ile Arg Ala Gly Tyr

50 55 60

Tyr Gly Asp Tyr Val Phe Asp Arg Val Leu Lys Val Asp Val Asn Lys

65 70 75 80

Thr Ile Thr Gly Met Gly Ala Val Pro Thr Gly Thr Ala Ala Ala Asn

85 90 95

Tyr Lys Thr Pro Thr Asp Arg Pro Asn Ile Ala Tyr Gly Lys His Leu

100 105 110

Gln Asp Ala Glu Trp Phe Thr Asn Ala Ala Phe Leu Ala Leu Asn Ile

115 120 125

Trp Asp Arg Phe Asp Ile Phe Cys Thr Leu Gly Ala Ser Asn Gly Tyr

130 135 140

Phe Lys Ala Ser Ser Ala Ala Phe Asn Leu Val Gly Leu Ile Gly Val

145 150 155 160

Lys Gly Ser Ser Ile Ala Ala Asp Gln Leu Pro Asn Val Gly Ile Thr

165 170 175

Gln Gly Ile Val Glu Phe Tyr Thr Asp Thr Thr Phe Ser Trp Ser Val

180 185 190

Gly Ala Arg Gly Ala Leu Trp Glu Cys Gly Cys Ala Thr Leu Gly Ala

195 200 205

Glu Phe Gln Tyr Ala Gln Ser Asn Pro Lys Ile Glu Met Leu Asn Val

210 215 220

Val Ser Ser Pro Ala Gln Phe Val Val His Lys Pro Arg Gly Tyr Lys

225 230 235 240

Gly Thr Ala Phe Pro Leu Pro Leu Thr Ala Gly Thr Asp Gln Ala Thr

245 250 255

Asp Thr Lys Ser Ala Thr Ile Lys Tyr His Glu Trp Gln Val Gly Leu

260 265 270

Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met Leu Val Pro Tyr Ile Gly Val Asn

275 280 285

Trp Ser Arg Ala Thr Phe Asp Ala Asp Ala Ile Arg Ile Ala Gln Pro

290 295 300

Lys Leu Ala Ala Ala Val Leu Asn Leu Thr Thr Trp Asn Pro Thr Leu

305 310 315 320

Leu Gly Glu Ala Thr Ala Leu Asp Thr Ser Asn Lys Phe Ala Asp Phe

325 330 335

Leu Gln Ile Val Ser Ile Gln Ile Asn Lys Met Lys Ser Arg Lys Ala

340 345 350

Cys Gly Val Ala Val Gly Ala Thr Leu Ile Asp Ala Asp Lys Trp Ser

355 360 365

Ile Thr Gly Glu Ala Arg Leu Ile Asn Glu Arg Ala Ala His Met Asn

370 375 380

Ala Gln Phe Arg Phe

385

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaaaaac tcttgaaatc gg 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 4

ttagaatctg aattgagcat tcat 24

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggtaccgg aattcctggt cccgcgtttg cctgtaggga acccagc 47

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 6

ttccgcggcc gctatggccg acgtcgacgc gtttagaatc tgaattgagc 50

Claims

1.一种杂交瘤细胞株CA1-MM 01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年11月22日，保藏编号为CGMCC No.14882。

2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株CA1-MM 01分泌的单克隆抗体CA1-MM 01H。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，其与流产衣原体MOMP蛋白产生特异性免疫反应，所述MOMP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.一种悬浮培养权利要求1所述杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的杂交瘤细胞株CA1-MM 01在含血清的培养基中传代培养，并在每次传代将血清的浓度递减。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，依次使用含10％血清、含8％血清、含6％血清、含4mmol/L Gln和4％血清、含4mmol/L Gln和2％血清的培养基进行传代培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，依次使用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基、含8％胎牛血清的RPMI1640培养基、含6％胎牛血清的RPMI1640培养基、含4mmol/L Gln和4％胎牛血清的RPM1640:SFM4CHO:OptiCHO的混合培养基、含4mmol/L Gln和2％胎牛血清的RPM1640:SFM4CHO:OptiCHO的混合培养基进行传代培养。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述的杂交瘤细胞株CA1-MM01以2.5×10⁵cells/mL的密度培养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃，5％CO₂的培养箱培养，培养48小时，用胰蛋白酶消化传代，以2.5×10⁵cells/mL的密度培养于含8％胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃，5％CO₂的培养箱培养，培养48小时；第三次传代时胎牛血清浓度递减到6％，其他条件同上进行培养；第四次传代培养时用胰蛋白酶消化收取处于对数生长期的杂交瘤细胞，1000r，10min离心后，以2.5×10⁵cells/mL密度培养于125mL摇瓶中，其培养基为含4mmol/L Gln，4％胎牛血清的RPM1640:SFM4CHO:OptiCHO的混合培养基，放置于5％CO₂、37℃、125r/min转速中摇床培养；每隔48h换液传代细胞状态达到稳定后，再次降低胎牛血清浓度至2％，培养基为含4mmol/L Gln和2％胎牛血清的RPM1640:SFM4CHO:OptiCHO的混合培养基，其他培养环境同上，连续培养2代，杂交瘤细胞最终达到悬浮生长状态。

8.权利要求2或3所述的单克隆抗体CA1-MM 01H在制备流产衣原体检测试剂或试剂盒方面的应用。

9.由权利要求2或3所述的单克隆抗体CA1-MM 01H制备的流产衣原体检测试剂或试剂盒。

10.含有权利要求2或3所述的单克隆抗体CA1-MM 01H的检测试剂或试剂盒。