CN116804186B - 一种抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂或试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽用生物技术检测领域，具体涉及一种抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂或试剂盒及其应用。本发明提供了一株抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株CIAV Mab‑VP2‑4的保藏编号为CGMCCNO:45614。利用本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体便捷高效，可操作性强，利用单克隆抗体制备的间接免疫荧光试剂盒具有较高的特异性和灵敏度，推广和使用该方法有利于进一步保证我国禽用病毒类活疫苗的纯净性和安全性，还可用于CIAV的临床检测、病毒含量测定和流行病学调查。

Description

一种抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆 抗体、试剂或试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物技术检测领域，具体涉及一种抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂或试剂盒及其应用。

背景技术

鸡传染性贫血病(Chicken Infectious Anemia，CIA)是由鸡传染性贫血病毒(Chicken Infectious Anemia Virus，CIAV)感染引起的一种免疫抑制性疾病，该疾病以雏鸡再生障碍性贫血和全身淋巴组织萎缩为主要特征。自从鸡传染性贫血病毒在日本首次分离以来，该病毒已在几乎所有拥有家禽产业的国家被分离出来。鸡是CIAV唯一的自然宿主，各品系和各年龄的鸡都易感，发病率一般为20～60％；死亡率一般为5～10％，严重则可达到60％以上。单独感染CIAV或与其他病原共同感染将引起机体的免疫抑制，继发其他疾病。鸡传染性贫血病可水平传播也可垂直传播，CIAV给世界的养禽业带来了巨大的经济损失。

CIAV是单股环状负链的DNA病毒，只有一个血清型，针对CIAV检测方法的研究很多，如病原学方法、免疫学方法、分子生物学检测方法，这些检测方法之间的灵敏性也有差异。纳入国家法规的检测方法有《中华人民共和国兽药典》(三部)二〇二〇年版中的鸡检查法。在禽源活疫苗成品检验环节，《中华人民共和国兽药典》(三部)二〇二〇年版鸡检查法，针对CIAV检验的方法主要是ELISA方法检测CIAV抗体。但上述法定方法存在缺点，进行CIAVELISA抗体检测必须通过鸡检查法获得鸡血清进行检测，存在费时成本高的问题。

而使用ELISA检测鸡传染性贫血病毒的基础是得到对鸡传染性贫血病毒具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体。因此，亟需一种高特异性和高灵敏度的抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，实现鸡传染性贫血病毒的高灵敏度检测，同时在获得单克隆抗体的基础上，建立稳定高效的检测鸡传染性贫血病毒的IFA(间接免疫荧光)方法用于禽活疫苗的质量检测和鸡传染性贫血病毒疫病的诊断。

发明内容

本发明的目的提供一种抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂或试剂盒及其应用，抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体制备的检测鸡传染性贫血病毒的间接免疫荧光试剂盒可同时识别CIAV不同毒株，具有良好的特异性，灵敏度好。

本发明提供了一株抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株CIAV Mab-VP2-4的保藏编号为CGMCC NO:45614。

本发明提供了上述技术方案所述抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌得到的单克隆抗体。

本发明提供了一种检测鸡传染性贫血病毒的试剂或试剂盒，包括上述技术方案所述的单克隆抗体。

本发明提供了一种间接免疫荧光试剂盒，所述试剂盒包括权利要求3所述的单克隆抗体、FITC标记的山羊抗小鼠抗体、样品稀释液和样品洗涤液。

优选的，所述样品稀释液包括pH值为7.2～7.4的9～11mM磷酸缓冲液。

优选的，所述样品洗涤液包括pH值为7.2～7.4的9～11mM磷酸缓冲液。

本发明提供了上述技术方案所述的抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或上述技术方案所述的单克隆抗体或上述技术方案所述的试剂或试剂盒或上述技术方案所述的间接免疫荧光试剂盒在检测禽用病毒活疫苗的安全性中的应用。

本发明提供了上述技术方案所述的抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或上述技术方案所述的单克隆抗体在制备检测鸡传染性贫血病毒的试剂或试剂盒中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂或试剂盒及其应用。本发明提供了一株抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株CIAV Mab-VP2-4的保藏编号为CGMCC NO:45614。本发明所述抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株基于鸡传染性贫血病毒VP2蛋白制备，本发明所述鸡传染性贫血病毒VP2蛋白是鸡传染性贫血病毒重要的免疫原性蛋白，在鸡传染性贫血病毒不同毒株之间相对保守，抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株所制备的单克隆抗体，可识别鸡传染性贫血病毒不同毒株，而不与鸡减蛋综合征病毒(EDSV)等病毒发生交叉反应，应用该单克隆抗体制备的试剂盒具有良好的特异性和灵敏度。该试剂盒不仅可用于禽病毒类活疫苗中鸡传染性贫血病毒的外源病毒检测，还可用于鸡传染性贫血的临床鉴定、病毒含量测定和流行病学调查。

生物保藏证明

杂交瘤细胞株CIAVMab-VP2-4，于2023年5月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.45614，保藏单位地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例2蛋白小量表达图；其中，M代表Marker；1代表未诱导对照(BL21)；2代表IPTG诱导(BL21)；

图2为实施例2蛋白大量表达图；M代表Marker；1代表超声后上清；2代表超声后沉淀；

图3实施例2蛋白质纯化图；M代表Marker；1代表纯化前蛋白质；2代表纯化后蛋白质；

图4为实施例4间接免疫荧光试剂盒检测CIAVAV1550毒株检测结果图；

图5为实施例4间接免疫荧光试剂盒检测CIAV Cux-1毒株检测结果图；

图6为实施例4间接免疫荧光试剂盒检测EDSV(127株)检测结果图；

图7为实施例4间接免疫荧光试剂盒检测ALV(RAV-1株)检测结果图；

图8为实施例4间接免疫荧光试剂盒检测ILTV(ILT/13株)检测结果图；

图9为实施例4间接免疫荧光试剂盒检测ARV(Reo1133株)检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了一株抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株CIAV Mab-VP2-4的保藏编号为45614。

在本发明中，所述抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法优选包括：将所述鸡传染性贫血病毒VP2蛋白构建重组表达质粒，得到VP2蛋白；所述VP2蛋白免疫小鼠后得到免疫后的小鼠脾细胞悬液；所述免疫后的小鼠脾细胞悬液与SP2/0细胞融合、培养和筛选后得到杂交瘤细胞株。

本发明将所述鸡传染性贫血病毒VP2蛋白的编码基因构建重组表达质粒；本发明所述构建重组表达质粒时应用的原始载体包括pET28a。本发明优选VP2蛋白添加酶切位点EcoRⅠ和Xho I的基因序列后利用限制性内切酶EcoRⅠ和Xho I进行酶切、纯化回收后得到第一酶切产物；优选利用限制性内切酶EcoRⅠ和Xho I对原始载体pET30a进行酶切，得到第二酶切产物；本发明优选将第一酶切产物和第二酶切产物用DNALigationKit连接后得到重组表达质粒。

得到重组表达质粒后，本发明优选将所述重组表达质粒转化至BL21菌株进行诱导表达，得到表达产物；将所述表达产物纯化后得到VP2蛋白。本发明对所述表达产物纯化方法没有特殊的限定，采用常规的方法即可。本发明制备得到的VP2蛋白的浓度大于0.5mg/mL，纯度大于85％，命名为CIAV-VP2。本发明鸡传染性贫血病毒VP2蛋白为免疫原，本发明所述鸡传染性贫血病毒VP2蛋白长度为648bp，高度保守，提高了检测鸡传染性贫血病毒的间接免疫荧光试剂盒检测的敏感性。

得到VP2蛋白后，所述VP2蛋白免疫小鼠后得到免疫后的小鼠脾细胞悬液。本发明所述VP2蛋白优选与弗氏完全佐剂乳化后免疫小鼠。本发明所述免疫小鼠优选包括对小鼠依次进行初次免疫、第二免疫、第三免疫、第四免疫和冲击免疫。本发明所述VP2蛋白免疫小鼠的剂量优选为每只小鼠55～65μg，更优选为60μg。在本发明中，所述初次免疫、第二免疫、第三免疫和第四免疫的时间间隔优选为14天，冲击免疫距离细胞融合的时间间隔优选为3～5天，更优选为3d。本发明所述冲击免疫优选为免疫原VP2蛋白腹腔注射免疫。

获得免疫小鼠之后，本发明从免疫小鼠体内分离脾细胞，制备脾细胞悬浮液。本发明免疫小鼠的脾细胞悬浮液和骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)进行融合，得到融合细胞。本发明所述脾细胞悬浮液和骨髓瘤细胞的细胞数的比例为(1～2)：(1～2)，更优选为1:1。本发明所述细胞融合优选利用50％PEG法。

本发明所述融合时脾细胞悬浮液与骨髓瘤细胞的细胞数比例设定可以提高细胞融合效率。

得到融合细胞后，本发明对所述融合细胞进行培养和筛选后得到杂交瘤细胞株。本发明所述融合细胞优选在HAT培养液中进行培养；所述培养后利用ELISA板筛选杂交瘤细胞株。本发明所述杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性贫血病毒的单克隆抗体。获得所述杂交瘤细胞株后，本发明优选利用间接免疫荧光检测法筛选杂交瘤细胞株单克隆抗体效价。本发明优选筛选的杂交瘤细胞株进行亚克隆培养和冻存同时满足两个条件，一是，与CIAV不同毒株全病毒具有良好反应性；二是，分泌的单克隆抗体效价高。本发明选择分泌的单克隆抗体效价高的小鼠脾细胞进行融合，提升了单克隆抗体检测的特异性和灵敏度。

本发明提供了上述技术方案所述抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌得到的单克隆抗体。本发明优选小鼠注射抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株后收集腹水，用Protein-A亲和纯化，获得CIAV单克隆抗体。

本发明提供了一种检测鸡传染性贫血病毒的试剂或试剂盒，包括上述技术方案所述的单克隆抗体。

本发明提供了一种间接免疫荧光试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的单克隆抗体、FITC标记的山羊抗小鼠抗体、样品稀释液和样品洗涤液。

在本发明中，所述样品稀释液优选包括pH值为7.2～7.4的9～11mM磷酸缓冲液；更优选为pH值为7.2的10mM磷酸缓冲液。

在本发明中，所述样品洗涤液包括pH值为7.2～7.4的9～11mM磷酸缓冲液；更优选为pH值为7.2的10mM磷酸缓冲液。

本发明提供了上述技术方案所述的抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或上述技术方案所述的单克隆抗体或上述技术方案所述的试剂或试剂盒或上述技术方案所述的间接免疫荧光试剂盒在检测禽用病毒活疫苗的安全性中的应用。在本发明中，所述禽用病毒活疫苗优选包括鸡痘活疫苗，鸡马立克氏病I型、III型二价活疫苗，鸡新城疫活疫苗，禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗，鸡传染性支气管炎活疫苗，鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗和鸡新城疫活疫苗中的一种或几种；更优选为鸡痘活疫苗，鸡马立克氏病I型、III型二价活疫苗，鸡新城疫活疫苗，禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗、鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗和鸡新城疫活疫苗。本发明所述鸡痘活疫苗优选为鸡痘活疫苗鹌鹑化弱毒株。本发明所述鸡马立克氏病I型、III型二价活疫苗优选为鸡马立克氏病I型、III型二价活疫苗814株+HVT Fc-126克隆株或鸡马立克氏病I、III型二价活疫苗CVI988+FC126株。本发明所述鸡新城疫活疫苗优选为鸡新城疫活疫苗Clone30株。本发明所述禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗优选为禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗YBF02株+鹌鹑化弱毒株；本发明所述鸡传染性支气管炎活疫苗优选为鸡传染性支气管炎活疫苗H120株；本发明所述鸡新城疫活疫苗优选为鸡新城疫活疫苗CS2株。利用本发明所述试剂盒检测禽用病毒活疫苗的安全性时，如果不出现特异性绿色荧光，则说明禽用病毒活疫苗未感染鸡传染性贫血病毒，是安全的。

本发明所述间接免疫荧光试剂盒检测鸡传染性贫血病毒的方法优选包括如下步骤：待检测样品接种、荧光染色和结果判定。在本发明中，所述待检测样品接种优选接种于MDCC-MSB1细胞(马立克氏病成淋巴细胞样细胞系)中进行吸附和培养。本发明所述吸附的时间优选为50～70min，更优选为60min。本发明培养的温度优选为37℃，所述培养的时间优选为5～7d，更优选为6d。本发明所述待检测样品接种的作用为CIAV在MSB1细胞上进行孵育和增殖。在本发明中，所述荧光染色优选包括固定、加一抗、洗涤、荧光二抗染色和洗涤。本发明所述一抗优选为鸡传染性贫血病毒的单克隆抗体。本发明所述荧光二抗优选为FITC标记的山羊抗小鼠IgG。在本发明中，所述结果判定时当接种孔视野中出现特异性绿色荧光，放大到200～400倍时，可见被感染细胞的细胞核和与细胞质均有着色时，判定该孔CIAV检测为阳性；当接种孔未出现特异性绿色荧光时，判定该孔CIAV检测为阴性。显色原理为：IFA方法中，若待检样品含有CIAV，则单抗和二抗分别结合在待检样品上，由于二抗携带FITC荧光，则在荧光显微镜下可见绿色特异性荧光。

本发明所述抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，是基于VP2蛋白作为重要的免疫原性蛋白，在鸡传染性贫血病毒不同毒株之间高度保守，可识别鸡传染性贫血病毒不同毒株，而不与鸡减蛋综合征病毒(EDSV)等病毒发生交叉反应。本发明试剂盒具有良好的特异性。

本发明提供了上述技术方案所述的抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或上述技术方案所述的单克隆抗体在制备检测鸡传染性贫血病毒的试剂或试剂盒中的应用。

本发明建立的基于单克隆抗体技术的IFA检测方法可用于检测CIAV病毒，而不对其他病毒产生交叉反应，便捷高效，可操作性强，具有较高的特异性和灵敏度。推广和使用本发明中的技术方案有利于进一步保证我国禽用病毒类活疫苗的纯净性和安全性，进而提高疫苗质量，还可用于CIAV的临床检测、病毒含量测定和流行病学调查。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1CIAVVP2蛋白序列分析

不同CIAV毒株只有一个血清型，从NCBI上下载不同CIAV毒株参考序列，通过分析发现，CIAVVP2蛋白在不同毒株中具有较高同源性。选用CIAV Hebei2株的VP2进行综合性二级分析及抗原性分析，结果发现CIAVVP2蛋白高度保守，存在极低的抗原性差异，可作为表达蛋白的备选片段。根据蛋白序列二级结构分析及抗原性等，以CIAV Hebei2株(Genbank登录号：MH186139.1的VP2序列)VP2序列为基础，选取全长VP2蛋白的核苷酸片段(648bp)经过密码子优化后进行序列合成，并在5’和3’端加入EcoRⅠ(GAATTC)和XhoI(CTCGAG)酶切位点，用于载体的克隆。加入酶切位点后的序列在北京六合华大蛋白研发中心有限公司进行合成(见SEQ ID NO:1)。

SEQ ID NO:1CIAVVP2蛋白重组表位：

GAATTCATGCACGGGAACGGCGGACAACCGGCCGCTGGGGGCAGTGAATCGGCGCTTAGCCGAGAGGGGCAACCTGGGCCCAGCGGAGCCGCGCAGGGGCAAGTAATTTCAAATGAACGCTCTCCAAGAAGATACTCCACCAGGACCATCAACGGTGTTCAGGCCACCAACAAGTTCACGGCCGTCCCCAACCCCTCACTGCAGAGAGATCCGGATTGGTATCGCTGGAATTACAATCACTCTATCGCTGTGTGGCTGCGCGAATGCTCGCGCTCCCACGCTAAGATCTGCAACTGCGGACAATTCAGAAAACACTGGTTTCAAGAATGTGCCGGACTTGAGGACCGATCAACCCAAGCCTCCCTCGAAGAAGCGATCCTGCGACCCCTCCGAGTACAGGGTAAGCGAGCTAAAAGAAAGCTTGATTACCACTACTCCCAGCCGACCCCGAACCGCAAGAAGGTGTATAAGACTGTGAGATGGCAAGACGAGCTCGCAGACCGAGAGGCCGATTTTCCGCCTTCAGAAGAGGACGCTGGCACCAGCTCAAGCGAAGTCGACGAAGATATAAATTTCGACATCGGAGGAGACAGCGGTATCGTAGACGAGCTTTTAGGAAGGCCTTTCACAACCCCCGCCCCGGTACGTATAGTGCTCGAG。

注：下划线为外加的EcoRI和XhoI酶切位点。

实施例2重组表达质粒的构建和表达纯化

1.重组表达质粒的构建

在实施例1的SEQ ID NO:1的其5’端和3’端分别引入EcoRⅠ和Xho I酶切位点，(在序列SEQ ID NO:1的两端加入酶切位点，通过序列合成的方法加入)用于重组表达质粒的制备。

用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoI分别对添加EcoRⅠ和Xho I酶切位点后的SEQ ID NO:1序列和质粒pET28a进行双酶切，将纯化回收的片段和表达载体酶切产物用DNA LigationKit连接后，得到重组表达质粒，转化至感受态细胞(BL21)。

2.CIAV-VP2重组蛋白的小量表达

挑取经PCR鉴定为阳性的转化后BL21克隆到1.5mL含卡那霉素抗性的LB液体培养基中，在温度为37℃，转速为200r/min的条件下培养；培养至LB培养液的OD₆₀₀＝0.6～0.8。LB液体培养基中卡那霉素的质量浓度为50μg/mL。培养所得菌液中加入IPTG进行诱导，IPTG在培养所得菌液中的终浓度为0.5mM。诱导温度为37℃，转速为200r/min，时间为2h。取1mL诱导所得菌液，在转速为12000r/min的条件下离心1min，弃上清，沉淀用50μL10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散(加入缓冲液的量视菌体量而定)，加入与缓冲液等体积的2×loading buffer，在温度为100℃的条件下保持5min后进行电泳检测。菌液诱导前和诱导后的电泳检测结果见图1，根据图1可知，在大小约28KD处出现重组CIAV VP2蛋白的特定目的条带，说明CIAVVP2蛋白表达成功。

3.CIAV-VP2重组蛋白的大量表达

步骤1得到的转化后BL21采用PCR进行鉴定，对鉴定为阳性的BL21进行培养。将培养所得的菌液按照体积比1:50比例转接到250mL卡那霉素抗性LB液体培养基中，在温度为37℃，转速为200r/min的条件下震荡培养至培养所得的LB液体培养基的OD₆₀₀＝0.6～0.8。LB液体培养基中卡那霉素的质量浓度为50μg/mL。在培养所得的LB液体培养基加入IPTG进行诱导。LB液体培养基中IPTG的终浓度为0.5mM。IPTG诱导温度为37℃，诱导时间为3h。诱导所得物进行离心收菌，离心转速8000r/min，离心时间6min。离心后弃上清得菌体；对所得菌体进行超声破菌，具体过程为：所得菌体用30mL10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散后进行超声波破碎，超声波破碎功率为500W，超声波破碎180次，每次5s，间隔5s后进行下一次超声波破碎。

超声波破碎所得物进行电泳检测，具体过程为：取100μL超声后的菌悬液，在转速为12000r/min的条件下离心10min，离心后保留50μL上清液和所得沉淀，所得沉淀用50μL10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散。分别取上清液和沉淀吹散后所得的溶液进行SDS-PAGE检测，结果在沉淀中检测到大量的目的蛋白(见图2中“2”)，说明该重组菌表达形式为包涵体表达(图2)。

对上述菌体沉淀中表达好的CIAV-VP2蛋白进行纯化，方法如下：20～30mL10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10min；在12000r/min的条件下离心10min，上清转入另一管中保存。对于沉淀，用20～30mL 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，静置10min；在12000r/min的条件下离心10min，弃上清，得第一沉淀；对于第一沉淀，重复上述重悬和离心的步骤一次得到第二沉淀。第二沉淀中先加入少量的10mM Tris-HCl(pH值为8.0)溶液重悬沉淀，再加5～10mL含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液溶解蛋白，12000r/min，离心10min，收集上清，取50μL样品进行SDS-PAGE电泳检测，蛋白纯化前和纯化后的检测结果见图3。以BSA(牛血清白蛋白)为标准，通过SDS-PAGE凝胶扫描分析估计纯化蛋白浓度>0.5mg/mL，纯度>85％，命名为CIAV-VP2。

实施例3单克隆抗体的制备

1.小鼠的免疫

用CIAV-VP2纯化蛋白与弗氏完全佐剂按照体积比1:1乳化后，按60μgCIAV-VP2蛋白/只小鼠的量，皮下注射4只SPFBALB/c雌性小鼠(即为初次免疫)。并于初次免疫后2周、4周、6周，分别皮下注射加强免疫，免疫量为30μg/只小鼠，初次免疫和第一次加强免疫间隔14d，第一次加强免疫和第二次加强免疫间隔14d，第二次加强免疫和第三次加强免疫间隔14d。第三次加强免疫后10日，眼眶取血，用间接ELISA测血清效价。选择血清效价高(ELISA抗体效价为1：12800)的小鼠，用免疫原50μg进行腹腔注射免疫冲击一次，免疫后3日，进行细胞融合。

2.细胞融合实验

无菌取步骤1免疫后小鼠脾脏，制备成脾细胞悬液，取等量免疫脾细胞悬液与SP2/0细胞，采用常规50％PEG法进行细胞融合。并将融合后得到的融合细胞分置于5块96孔板中，以HAT培养液(购自Sigma公司)进行选择性培养。

3.杂交瘤细胞的克隆与筛选

将步骤2所述96孔板中培养物分别经CIAV-VP2蛋白和His标签蛋白包被的ELISA板进行筛选。

(1)步骤2所述96孔板中培养物经CIAV-VP2蛋白包被的ELISA板进行筛选的筛选方法如下：

1)包被ELISA板。用pH为9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液稀释实施例2纯化好的CIAV-VP2蛋白，终浓度为2μg/mL。ELISA板中每孔添加100μL稀释后CIAV-VP2蛋白，在温度为4℃的条件下，过夜；后用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗涤3次。

2)封闭。包被ELISA板后用含有质量浓度为2％牛奶的PBS进行封闭。ELISA板每孔添加200μL含2％牛奶的PBS，37℃孵箱，孵育2h后用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗涤3次。

3)孵育一抗。封闭后，分别加入步骤2细胞融合后获得的杂交瘤细胞培养上清、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(CIAV阳性血清用PBS做1000倍稀释)作为一抗，均为100μL/孔，37℃孵箱孵育1h。

4)洗涤。孵育一抗后用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗涤步骤(3)ELISA板，共洗涤3次。

5)孵育二抗。洗涤后，ELISA板中分别加入用PBS稀释20000倍的山羊抗小鼠IgG/HRP作为二抗，100μL/孔，37℃孵箱孵育1h。

6)洗涤。用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗涤步骤(5)孵育二抗后的ELISA板，共洗涤3次。

7)显色。加入显色液(含1％A液和10％B液的柠檬酸缓冲液，A液：用DMSO将TMB配成1％质量浓度；B液：质量浓度为0.1％的H₂O₂水溶液)100μL/孔，显色时间为5min左右。

8)每孔加入50μL终止液(含2M硫酸)终止。

9)读数。在双波长(450nm，630nm)波长下测吸光值，记录保存数据。

(2)上述96孔板中培养物经His标签蛋白包被的ELISA板进行筛选的筛选方法同CIAV-VP2蛋白。

经检测，筛选到1#、3#和4#共3株ELISA阳性的杂交瘤细胞株供进一步筛选。试验结果见表1：吸光度值对目的蛋白值高同时对标签蛋白值低说明杂交瘤细胞株效价高。根据表1可知，4#杂交瘤细胞株的效价最高。

表1杂交瘤细胞株ELISA筛选结果

4.间接免疫荧光检测

将步骤3ELISA筛选获得的3株阳性杂交瘤细胞株(1#、3#和4#)的上清作为一抗，采用间接免疫荧光法筛选到一株4#与CIAV不同毒株全病毒具有良好反应性的细胞株，该细胞株命名为CIAV VP2蛋白杂交瘤细胞株CIAV Mab-VP2-4。选取免疫荧光检测为阳性的细胞株采用有限稀释法进行亚克隆，直至细胞克隆抗体阳性率达100％。将上述亚克隆后阳性率达100％的阳性细胞株扩大培养后，液氮中保存。

间接免疫荧光检测方法如下：

(1)阳性病毒板的制备：将CIAV不同毒株(表2)病毒液分别用含2％新生牛血清的1640培养液稀释成100TCID₅₀/0.1mL，将待检样品接种鸡淋巴细胞MDCC-MSB1，2～3天后将含毒细胞(每孔含100TCID₅₀病毒)铺到多聚赖氨酸处理的96孔细胞板，每个毒株接种4孔，100μL/孔。同时设MDCC-MSB1细胞对照，一段时间后用冷甲醇固定15min，进行荧光染色。

表2CIAV不同毒株和对照用毒株信息表

以上病毒株来自国家兽医微生物菌(毒)种保藏中心，CVCC，(请见中国兽医药品监察所、中国微生物菌种保藏管理委员会兽医微生物中心编著，《中国兽医菌种目录》第一版中英文合订本，1992年，中国科学技术出版社，132、135和143页)。鸡传染性贫血病毒(CIAV)AV1550株详见中国兽药信息网、菌种保藏、菌(毒)种检索。Cux-1株由本实验室保存，其为疫苗株，孔义波,张兴晓,姜世金等.《CAV核酸疫苗及免疫效果初步研究》，山东畜牧兽医学会禽病学专业委员会.山东畜牧兽医学会禽病学专业委员会第一次学术研讨会论文集,2009:163-166。禽白血病病毒(ALV)RAV-1株来自中国兽医药品监察所(毛娅卿，王嘉，吴涛，王哲，蒋桃珍，《禽白血病病毒p27蛋白在大肠杆菌中的表达和多克隆抗体的制备》，中国兽药杂志，2013年11期，61-66)。

(2)染色

1)固定。阳性病毒板制备后，弃去96孔板的细胞培养液，每孔约加250μLPBS，轻洗细胞表面1次，尽量弃尽PBS，然后每孔加入100μL冷甲醇，置室温固定10～15min，弃去甲醇，自然晾干2～5min。

2)加一抗(单克隆抗体)。96孔板固定后，用PBS(pH7.2)洗细胞面1次，分别将待检的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1#、3#和4#)上清用PBS稀释10倍，加入CIAV病毒阳性细胞板(使用前用PBS洗涤1次)中，每孔50μL，37℃避光作用1h。

3)洗涤。96孔板加一抗作用后弃去板孔中的单克隆抗体，用PBS洗涤5次，每孔每次加入洗液0.3mL，轻微振荡洗涤。

4)荧光二抗染色。尽量弃尽洗液，每孔加入用PBS作稀释后的荧光标记的山羊抗小鼠IgG 50μL，37℃避光作用1h。PBS作稀释后的荧光标记的山羊抗小鼠IgG的体积比为1:100～1:200。

5)洗涤。方法同3)。

6)观察和结果判定。在荧光倒置显微镜下用蓝色激发光(波长490nm)观察，细胞有完整的细胞形态。当接种孔视野中出现特异性绿色荧光，放大到200～400倍，可见被感染细胞的细胞核和与细胞质均有着色时，判定该CIAV检测为阳性。当接种孔未出现特异性绿色荧光时，视野发暗，证明细胞未被感染，判定该孔CIAV检测为阴性。结果表明：4#杂交瘤细胞株与CIAV不同毒株全病毒具有良好反应性。

5.杂交瘤细胞的鉴定

(1)培养特性

用含10％～15％胎牛血清的1640培养液，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，用显微镜检查杂交瘤细胞株的细胞形态，观察细胞形态应一致，细胞形态应一致，说明细胞状态良好。

(2)纯净性检验

按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会编，中华人民共和国兽药典，2020版，中国农业出版社，2020，本发明简称《中国兽药典》)附录方法进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，结果均符合规定。

(3)胞核学检查

将培养24h的杂交瘤细胞用秋水仙素法检查染色体数目，观察染色体特征是否符合杂交瘤细胞的染色特性，结果符合预期。

(4)腹水的制备取8～10周龄BALB/C小鼠，腹腔注射降植烷，每只0.5mL。7～10日后小鼠腹腔注射4#杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株10⁶～10⁷个/0.5mL/只，7～10日后，观察小鼠状态，待小鼠腹部明显膨大、行动不便时，抽取小鼠腹水，3000r/min离心10min，取上清，-40℃保存。间隔2～3日，若腹水再次产生，可再次采集，此腹水用Protein-A亲和纯化，获得鼠抗CIAV单克隆抗体。

(5)腹水效价测定

将注射4#杂交瘤细胞株的小鼠腹水从1:100开始倍比稀释至1:16000，按照实施例3中“4间接免疫荧光检测方法”测定腹水的荧光抗体效价，杂交瘤细胞株4#的腹水的荧光抗体效价为1:2000，将该杂交瘤细胞株命名为CIAVVP2蛋白杂交瘤细胞株CIAVMab-VP2-4，保藏编号为CGMCCNo.45614。

实施例4检测CIAV的间接免疫荧光试剂盒组装及应用

该试剂盒成分为杂交瘤细胞株CIAV Mab-VP2-4分泌的抗CIAV的单克隆抗体，商品化的FITC标记的山羊抗小鼠抗体(购自：Sigma公司，货号F9006)，样品稀释液及洗涤液。稀释液及洗涤液均是10mM pH 7.2的磷酸缓冲液(PBS)。

该试剂盒检测鸡传染性贫血病毒的步骤及判定标准如下：

1.样品接种

将待检样品100μL接种于长满的鸡淋巴细胞MDCC-MSB1，37℃培养2～3天后将含毒细胞铺到多聚赖氨酸处理的96孔细胞板。

2.荧光染色及结果判定

(1)固定：1h后弃去96孔细胞板的细胞培养液，每孔约加0.3mLPBS(pH7.2)轻洗细胞表面1次，尽量弃尽PBS，然后每孔加入0.2mL冷甲醇，置室温固定15min，弃去甲醇，自然晾干(5min)。

(2)加一抗：自然晾干后，用PBS(pH7.2)洗细胞面1次，然后每孔加入50μLCIAV单克隆抗体置37℃条件下作用1h。加入的CIAV单克隆抗体用PBS(pH7.2～7.4)稀释，稀释体积比为1:100。

(3)洗涤：弃去CIAV单克隆抗体，用PBS(pH7.2)洗5次，每次每孔加入洗液0.3mL，轻微振荡洗涤。

(4)荧光二抗染色。尽量弃尽洗液，每孔加入50μLFITC标记的羊抗鼠IgG，置37℃作用1h。加入的FITC标记的羊抗鼠IgG用PBS(pH7.2～7.4)稀释，稀释的体积比为1:100稀释。

(5)洗涤：方法同(3)。

(6)观察和判定：在荧光倒置显微镜下用蓝色激发光(波长490nm)观察，细胞有完整的细胞形态。当接种孔视野中出现特异性绿色荧光，放大到200～400倍时，可见被感染细胞的细胞核和与细胞质均有着色时，判定该孔CIAV检测为阳性。当接种孔未出现特异性绿色荧光时，视野发暗，证明细胞未被感染，判定该孔CIAV检测为阴性。

3.试剂盒的特异性试验

按照已建立的实施例4中“1.样品接种”和“2.荧光染色及结果判定”的操作方法，利用间接免疫荧光试剂盒检测表2中不同的CIAV、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)、禽白血病病毒(ALV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽正呼肠孤病毒(ARV)，观察感染病毒的细胞着色情况，确定该间接免疫荧光方法的特异性。

检测结果表明见图4～图9，该方法可以特异性地识别检测不同CIAV毒株(图4～图5)反应结果均显示为阳性，而与EDSV(见图6)，ALV(见图7)，ILTV(见图8)和ARV(见图9)反应均为阴性，证明建立的方法特异性良好，该间接免疫荧光试剂盒可应用于CIAV的特异性检测。

4.试剂盒的敏感性试验

将CIAV(AV550株)稀释为80TCID₅₀/100μL，以此为基础进行二倍倍比稀释至40TCID₅₀/100μL、20TCID₅₀/100μL、10TCID₅₀/100μL、5TCID₅₀/100μL、2.5TCID₅₀/100μL、1.25TCID₅₀/100μL、0.625TCID₅₀/100μL。将以上8个稀释度的样品，分别接种长满单层的MDCC-MSB1，100μL/孔，每个样品4个重复。同时设置1640组作为阴性对照。按照实施例4中“1.样品接种”和“2.荧光染色及结果判定”的检测CIAV的步骤及判定标准进行检测。

结果各剂量梯度的CIAV检测结果为，当CIAV感染剂量大于等于5TCID₅₀病毒时结果为阳性。

Cux-1株的检测方法同AV1550株，获得的检测结果一致，当CIAV感染剂量大于等于5TCID₅₀病毒时结果为阳性。

以上结果表明，该试剂盒CIAV污染的最低检出限为5TCID₅₀。

5.试剂盒的初步应用

将本试剂盒应用于禽病毒类活疫苗的外源病毒检验，本试验选取了10家国内生产企业生产的禽用活疫苗重点品种，按照本专利的试剂盒进行CIAV检测，并根据《中国兽药典》2020年版三部对选取的禽病活疫苗进行CIAV污染的血清学检验。同时设置PBS组为阴性对照，感染CIAV(Cux-1株)组为阳性对照。根据表3可知，血清学检验和应用本试剂盒检测的结果一致，所选取的禽用活疫苗均无CIAV污染，阴性对照为CIAV检测阴性，阳性对照为CIAV检测阳性。

表3采用本发明试剂盒对国内企业疫苗检测结果

综上所述，本发明中所述抗CIAV的单克隆抗体，是基于CIAVVP2蛋白作为CIAV重要的免疫原性蛋白，在CIAV不同毒株之间高度保守所制备的单克隆抗体，可同时识别CIAV不同毒株，而不与鸡减蛋综合征病毒(EDSV)等病毒发生交叉反应。本发明试剂盒具有良好的特异性。该试剂盒不仅可用于禽病毒类活疫苗中CIAV的外源病毒检测(细胞检查法)，还可用于CIAV的临床检测和流行病学调查。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.一株抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株CIAV Mab-VP2-4的保藏编号为CGMCCNO:45614。

2.权利要求1所述抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体。

3.一种检测鸡传染性贫血病毒的试剂或试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的单克隆抗体。

4.一种间接免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的单克隆抗体、FITC标记的山羊抗小鼠抗体、样品稀释液和样品洗涤液。

5.根据权利要求4所述的间接免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液包括pH值为7.2～7.4的9～11mM磷酸缓冲液。

6.根据权利要求4所述的间接免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述样品洗涤液包括pH值为7.2～7.4的9～11mM磷酸缓冲液。

7.权利要求1所述的抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体或权利要求3所述的试剂或试剂盒或权利要求4～6任一项所述的间接免疫荧光试剂盒在检测禽用病毒活疫苗的安全性中的应用。

8.权利要求1所述的抗鸡传染性贫血病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测鸡传染性贫血病毒的试剂或试剂盒中的应用。