CN110724189A - 一种(1-5)-Gal-(1-6)-Man糖蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种(1-5)-Gal-(1-6)-Man糖蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及糖蛋白疫苗领域，具体涉及一种抗真菌感染的(1‑5)‑Gal‑(1‑6)‑Man糖蛋白及其制备方法。本发明的糖蛋白是基于真菌表面多糖抗原结构以设计并通过化学合成方法制备结构明确的寡糖抗原，随后将其与免疫原性蛋白共价偶联形成新型的半合成糖缀合物疫苗，以增强糖抗原免疫原性，使其转化为T细胞依赖性抗原，同时可以克服由天然多糖导致的疫苗制备和质量控制困难等问题。通过初步的动物实验表明该糖蛋白表现了良好的活性，小鼠经免疫后血液中的抗体滴度明显增高，IgG抗体的滴度在总抗体中占有较大的比例，说明本发明合成的糖蛋白是一种非常有前景的抗真菌糖疫苗。

Description

一种(1-5)-Gal-(1-6)-Man糖蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及糖蛋白疫苗领域，具体涉及一种抗真菌感染的(1-5)-Gal-(1-6)-Man糖蛋白及其制备方法。
背景技术
侵袭性真菌感染又称深部真菌感染，病原菌主要为念珠菌、曲霉和隐球菌。近年来住院患者的真菌感染比例有所上升，并且由于地域差别导致流行菌株不同，其中侵袭性曲霉病在严重免疫受损患者群体是较普遍的传染病，它的发病率近年来上升趋势明显，仅次于念珠菌感染。虽然新的抗真菌药物不断涌现，它的病死率依然很高(≥50%)，是引起干细胞移植和实体器官移植患者相关感染死亡的主要原因。
由于侵袭性真菌感染临床表现没有特征性，容易被原发病或其他并发症所掩盖，加上实验室诊断方法费时、敏感性差、阴性结果不能排除诊断，有些临床标本即使分离出真菌也很难确立是定植还是侵袭或污染，因此导致很多患者得不到及时、准确的诊断。另外，侵袭性真菌感染的病情比较凶险，治疗也比较困难，虽然新的抗真菌药不断增多，但真菌本身也在不断发生变异，导致耐药菌株不断增多，加上部分药物的毒副反应使得患者无法耐受，因此抗真菌治疗依然面临严峻的挑战。研发抗侵袭性真菌疫苗，对真菌感染进行早期预防是对特殊病患者真正有效的生命健康保障。然而，到目前为止还没有一种成熟有效的真菌疫苗。
发明内容
针对目前缺乏有效的真菌疫苗的问题，本发明提供一种(1-5)-Gal-(1-6)-Man-Linker-KLH糖蛋白，能够有效抗曲霉感染。
本发明的另一目的是提供一种上述糖蛋白在抗真菌感染中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种糖蛋白，其结构为：
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE002
。
所述免疫原性载体蛋白为非人源蛋白；选自KLH（匙孔血蓝蛋白），BSA（牛血清白蛋白），OVA（鸡卵白蛋白），Blue carrierTM（软体动物源性高可溶的血蓝蛋白），白喉毒素无毒变异体，破伤风毒素/类毒素，分离自非获得型流感嗜血杆菌的高分子量蛋白（HMP），脱毒后的绿脓杆菌毒素A，霍乱毒素/类毒素，百日咳毒素/类毒素，产气荚膜梭状芽胞杆菌外毒素/类毒素，乙肝表面抗原，乙肝核心抗原，轮状病毒VP7蛋白，白喉毒素突变体CRM、CRM191、CRM3201，呼吸合胞病毒F和G蛋白中的至少一种；优选为KLH、BSA。
上述糖蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）氮气保护、分子筛存在下，TMSOTf催化化合物2和化合物3在二氯甲烷中反应，终止反应后分离纯化得化合物4：
；
（2）化合物4溶解于甲醇:二氯甲烷5:1混合溶剂中在PdCl2存在下于室温中反应，过滤后滤液用碱中和，分离获得油状物；油状物溶解于二氯甲烷，加入碳酸铯和CF3C(NPh)Cl，TLC跟踪反应，室温搅拌至反应完全，体系浓缩后用硅胶柱分离得到化合物5：
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE006
；
（3）氮气保护、分子筛存在下，TMSOTf催化化合物5和化合物6于二氯甲烷中反应，终止反应后分离纯化得化合物7：
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE008
；
（4）化合物7与吡咯烷在二氯甲烷中反应，再用稀酸洗涤，获得的有机相分离纯化，得化合物8：
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE010
；
（5）氮气保护、分子筛存在下，TMSOTf催化化合物5和化合物8于二氯甲烷中反应，终止反应后分离纯化得化合物9：
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE012
；
（6）隔氧条件下，化合物9的甲醇溶液加入10%钯碳，以氢气加氢，在氮气保护下过滤，滤液中加入甲醇钠的甲醇溶液反应后再加入水反应，分离纯化后得到寡糖片段1：
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE014
；
（7）将免疫原性载体蛋白、寡糖片段和双琥珀酰亚胺戊二酸酯溶于偶联液，孵育，然后分离纯化、纯化获得糖蛋白：
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE016
。
一种上述糖蛋白在制备抗真菌感染药物中的应用。
一种包含上述糖蛋白的药物。
本发明具有以下优点：
本发明的糖蛋白是基于真菌表面多糖抗原结构以设计并通过化学合成方法制备结构明确的寡糖抗原，随后将其与免疫原性蛋白共价偶联形成新型的半合成糖蛋白缀合物疫苗，以增强糖抗原免疫原性，使其转化为T细胞依赖性抗原，同时可以克服由天然多糖导致的疫苗制备和质量控制困难等问题。通过初步的动物实验表明该糖缀合物表现了良好的活性，小鼠经免疫后血液中的抗体滴度明显增高，IgG抗体的滴度在总抗体中占有较大的比例，这一结果说明本发明合成的糖缀合物是一种非常有前景的抗真菌糖疫苗。
附图说明
图1是实施例1中获得的寡糖片段的1H NMR图；
图2是实施例1中获得的寡糖片段的13C NMR图；
图3是(1-5)-Gal-(1-6)-Man-7碳链Linker-KLH糖蛋白免疫原性抗体滴度图；
图4是(1-5)-Gal-(1-6)-Man-3碳链Linker-KLH糖蛋白的免疫原性抗体滴度图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 (1-5)-Gal-(1-6)-Man-7碳链-KLH糖蛋白的制备
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE018
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE020
（1）经干燥除水的化合物2 (213 mg, 0.40 mmol)和化合物3(440 mg, 0.5 mmol)溶解于干燥的二氯甲烷（8毫升）中，体系中加入预活化的分子筛（MS300 AW，400mg）。室温氮气保护下体系搅拌10分钟，然后降温至-80 ℃，加入TMSOTf (16 μL, 0.09 mmol)。50分钟后体系升温至-10 ˚C然后加入一滴三乙胺淬灭反应。混合物用硅胶柱纯化（甲苯/乙酸乙酯=20/1洗脱，RF=0.6）得到油状化合物4 (467 mg，95%收率)，其1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ8.06-7.18 (m, 38H, Ar), 5.99 (m, 1H, H-5II), 5.95 -5.84 (m, 1H, OCH2CHCH2),5.83 (dd, J3,4 = 5.3 Hz, J3,2 = 1.4 Hz, 1H, H-3I), 5.78 (s,1H, H-1II), 5.65(d, J2,3 = 1.3 Hz, 1H, H-2II), 5.58 (dd, J3,4 = 5.2 Hz, J3,2 = 1.3 Hz, 1H, H-3II), 5.53 (d, J2,3 = 1.4 Hz, 1H, H-2I), 5.34-5.28 (m, 1H, OCH2CHCHaHb), 5.29(s, 1H, H-1I), 5.17 (dq, J=10.4, 1.4 Hz, 1H, OCH2CHCHaHb), 4.97 (dd, J4,3 =5.2 Hz, J4,5 = 3.4 Hz, 1H, H-4II),4.76 (dd, J6a,6b = 8.4 Hz, J6a,5 = 6.3 Hz,1H, H-6aI), 4.72-4.63 (m, 3H, H-6bI, H-5I, H-6aII), 4.58–4.51 (m, 2H, H-4I,H-6bII), 4.29 (dd, J = 10.3, 7.4 Hz, 1H, Fmoc-CHaHb), 4.26-4.16 (m, 2H,OCHaHbCHCH2, Fmoc-CHaHb), 4.14-4.04 (m, 2H, Fmoc-CH OCHaHbCHCH2)。13C NMR(100MHz, CDCl3)：δ = 165.7 (PhCO), 165.2 (PhCO), 154.8 (C=O), 143.4 (Cq Fmoc),141.2 (Cq Fmoc), 133.7 (OCH2CHCH2), 133.4-133.0 (Ar), 130.0-119.9 (Ar), 117.4(OCH2CHCH2), 105.5(C-1II), 104.8 (C-1I), 82.4 (C-4I), 82.1 (C-2II), 82.0 (C-2I), 81.8 (C-4II), 77.7 (C-3II), 77.1 (C-3I), 73.4 (C-5I), 70.1 (2C, Fmoc-CH2, C-5II), 67.9 (OCH2CHCH2), 66.5 (C-6II), 64.5 (C-6I), 46.6 (Fmoc-CH). HRMS(ESI): M = C72H60O19. Calcd m/z for [M + NH4]+ 1246.4067, found 1246.4036.Calcd m/z for [M + Na]+ 1251.3621, found 1251.3586. Calcd m/z for [M + K]+1267.3360, found 1267.3332。
（2）化合物4(467 mg mg, 0.48 mmol)溶解于体积比为5:1的甲醇:二氯甲烷混合溶剂（21毫升）中，体系中加入PdCl2(63 mg, 0.44 mmol)，在室温下搅拌3小时，然后过滤通过硅藻土，滤液用一滴三乙胺中和，加压浓缩，油状物溶解于二氯甲烷（15毫升），加入碳酸铯(515 mg, 2.18 mmol)和CF3C(NPh)Cl (260 μL, 1.635 mmol)，TLC跟踪反应，室温搅拌至反应完全。体系浓缩后用硅胶柱分离（甲苯/乙酸乙酯=10:1v/v淋洗，RF=0.3）得到化合物5 (320 mg, α:β=1:0.75，62%收率)；其1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 8.08-7.12 (m, 84H),7.04 (t, J = 7.5 Hz, 0.75H, p-Ph), 6.99(t, J = 7.4 Hz, 1H, p-Ph), 6.82 (d, J= 8.0 Hz, 2.5H, o-Ph, H-1αI), 6.59 (d, J = 7.8 Hz, 2H, o-Ph), 6.35 (dd, J3,2= 7.2 Hz,J3,4 = 5.9 Hz, 1H, H-3αI), 6.05 (m, 1H, H-5αII), 5.95-5.91 (m, 1.5H,H-5βII, H-3βI), 5.89 (dd, J2,3= 7.2 Hz, J2,1 = 4.7 Hz, 1H, H-2αI), 5.79 (s,1H, H-1αII), 5.78 (s, 0.75H, H-2βI), 5.7(s,0.75H, H-1βII), 5.65 (dd, J3,4 =5.6 Hz, J3,2=1.8 Hz, 1H, H-3αII), 5.63 (d, J2,3=1.8 Hz, 1H, H-αII), 5.61 (d,J2,3=1.4 Hz, 0.75H, H-2βII), 5.58 (dd, J3,4 = 5.2 Hz, J3,2 = 1.4 Hz, 0.75H,H-3βII), 5.03 (dd, J4,3 =5.6 Hz, J4,5 = 3.2 Hz, 1H, H-4αII), 4.91 (dd, J4,3 =5.2 Hz, J4,5 = 3.7 Hz, 0.75H, H-4βII), 4.8-4.59 (m, 9.75H, 2×H-6αII, H-4βI,H-6aβI, H-5βI, H-4αI, H-5αI, 2×H-6αI), 4.52 (dd, J6b,6a = 11.8 Hz,J6b,5=7.8Hz, 1H, H-6bβI), 4.32-4.15 (m, 3.5H, Fmoc-CH2), 4.15-4.08 (m, 1.75H,Fmoc-CH)。13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ=166.0 (PhCO), 165.6 (PhCO), 165.5 (PhCO),165.2(PhCO),143.3 (Cq Ph), 133.7 (Ar), 133.2 (Ar), 129.9-124.1 (Ar), 119.9-119.3(Ar),105.5 (C-1βII), 105.3(C-1αII), 96.3 (C-1αI), 85.6 (C-4βI), 82.5 (C-2αII), 81.9 (C-2βII), 81.7 (C-4βII, C-4αI), 81.4 (C-4αII),80.5 (C-2βI), 77.7(C-3αII), 77.5 (C-3βII), 76.4 (C-2αI), 76.2 (C-3βI), 74.0 (C-3I),73.8 (C-5αI), 73.2(C-5βI), 70.1 (C-5βII, Fmoc-CH2, C-5αII), 66.6 (C-6βI, C-6αII), 64.2(C-6βII), 63.5(C-6αI), 46.6(Fmoc-CH). HRMS (ESI): M = C77H60F3NO19. Calcd m/zfor [M + Na]+ 1382.3604, found1382.3606. Calcd m/z for [M + K]+ 1398.3343,found 1398.3338。
（3）经真空干燥的化合物5(163 mg, 0.120 mmol)和化合物6(85 mg, 0.132mmol)溶解于干燥的二氯甲烷（4毫升）中，然后加入预活化的分子筛（MS300 AW，200 mg)。体系在氮气保护下室温搅拌15分钟，然后降温至-80 ˚C，加入TMSOTf (6.5 μL, 0.036mmol)。体系在-80 ˚C下搅拌50分钟后升温至-10 ˚C，然后加入一滴三乙胺淬灭反应。体系浓缩后用硅胶柱纯化（甲苯：乙酸乙酯 =5:1v/v洗脱，RF=0.25），得到油状化合物7 (188mg, 收率86%)；其1H NMR (600 MHz, CDCl3)：δ 8.07-7.14 (m, 53H, Ar), 5.97 (m, 1H,H-5III), 5.85 (dd, J3,4 = 9.9Hz, J3,2 = 3.1 Hz, 1H, H-3I), 5.85 (m, 1H, H-3II), 5.81 (t, J4,3 = J4,5 = 9.9 Hz, 1H, H-4I), 5.77 (s,1H, H-1III), 5.66 (d,J2,3=1.2 Hz, 1H, H-2III), 5.65 (dd, J2,3=3.1 Hz, J2,1 = 1.6 Hz, 1H, H-2I),5.58 (dd, J3,4 = 5.0 Hz, J3,2 = 1.2 Hz, 1H, H-3III), 5.55 (d, J2,3 = 1.5 Hz,1H, H-2II), 5.47 (s, 1H,H-1II), 5.03 (d, J1,2 = 1.6 Hz, 1H, H-1I), 4.95 (m,J4,3 = 5.0 Hz, J4,5 = 3.6 Hz, 1H, H-4III), 4.76-4.71 (m, 1H, H-6aII), 4.69-4.63 (m, 3H, H-6bII, H-6aIII, H-5II), 4.55-4.50 (m, 2H, H-4II, H-6bIII),4.31(ddd, J5,4 = 9.3 Hz, J5,6a = 7.3 Hz, J5,6b = 2.0 Hz, 1H, H-5I), 4.26 (dd, J=10.4, 7.5 Hz, 1H, Fmoc-CHaHb), 4.16 (dd, J=10.4, 7.7 Hz, 1H, Fmoc-CHaHb), 4.09(t, J=7.5 Hz, 1H, Fmoc-CH),3.99-3.93 (m, 2H, H-6aI, OCHaHbCH2CH2N), 3.91 (dd,J6a,6b = 12.4, J6b,5 = 2.0 Hz, 1H, H-6bI), 3.63 (td, J = 12.8, 6.1 Hz, 1H,OCH2CH2CHaHbN), 3.5=3.45 (m, 2H, OCHaHbCH2CH2N, OCH2CH2CHaHbN), 2.04-1.92 (m, 2H,OCH2CH2CH2N)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)：δ =166.1 (PhCO), 165.8 (PhCO), 165.7(PhCO), 165.6 (PhCO), 165.5 (PhCO), 165.4 (PhCO), 165.3(PhCO), 165.1 (PhCO),154.8 (C=O), 143.4 (Cq Fmoc), 141.1(CqFmoc),133.6-133.0 (Ar),130.0-127.1(Ar), 125.2-119.9 (Ar), 106.4 (C-1II), 105.7 (C-1III), 97.6 (C-1I), 82.4 (C-4II), 82.0(C-2III), 81.9 (2C, C-2II, C-4III), 77.7 (C-3III), 77.1 (C-3II),73.0 (C-5II), 71.4 (C-5I), 70.4 (C-2I),70.2 (C-5III), 70.1 (Fmoc-CH2), 69.9(C-3I), 67.2 (C-4I), 66.6 (C-6III), 66.2 (OCH2CH2CH2N),66.1 (C-6I), 65.00 (C-6II), 46.6 (Fmoc-CH), 37.6 (OCH2CH2CH2N), 28.5 (OCH2CH2CH2N). HRMS (ESI): M =C101H84F3NO28. Calcd m/z for [M + NH4]+ 1833.5470, found 1833.5451. Calcd m/zfor [M + Na]+ 1838.5024, found 1838.4993。
（4）化合物7(127 mg, 0.070 mmol)溶解于干燥的二氯甲烷（2毫升），加入吡咯烷(200 μL)，室温下搅拌30分钟，然后体系用稀盐酸洗，分出有机相浓缩，混合物用硅胶柱纯化（甲苯/乙酸乙酯=7/1v/v洗脱，RF=0.25），得到油状化合物8(77 mg, 69%)，其1H NMR(400MHz, CDCl3)：δ 8.08-7.14 (m, 45H, Ar), 5.87-5.78 (m, 3H, H-3I, H-3II, H-4I), 5.74 (s, 1H, H-1III), 5.71 (d, J2,3 = 1.7 Hz, 1H, H-2III), 5.67-5.64 (m,2H, H-3III, H-2I), 5.53 (d, J2,3 = 1.6 Hz, 1H, H-2II), 5.46 (s, 1H, H-1II),5.04 (d, J1,2 = 1.3 Hz, 1H, H-1I), 4.74 (dd, J4,3 = 4.8 Hz, J4,5 = 3.2Hz, 1H,H-4III), 4.72-4.64 (m, 2H, H-6aII, H-6bII), 4.62-4.58 (m, 1H, H-5II), 4.54(dd, J4,3 = 5.5Hz, J4,5 = 3.1 Hz, 1H, H-4II), 4.52-4.44 (m, 2H, H-6aIII, H-6bIII), 4.39-4.32 (m, 1H, H-5III),4.31 (ddd, J5,4 = 9.3 Hz, J5,6a = 6.7 Hz,J5,6b = 2.4 Hz, 1H, H-5I), 4.00-3.93 (m, 2H, OCHaHbCH2CH2N, H-6aI), 3.90 (dd,J6a,6b = 12.3, J6b,5 = 2.4 Hz, 1H, H-6bI), 3.69-3.60 (m, 1H, OCH2CH2CHaHbN),3.58-3.45 (m, 2H, OCHaHbCH2CH2N, OCH2CH2CHaHbN), 2.75 (d, JH5OH= 7.5 Hz, 1H),2.07-1.91 (m, 2H, OCH2CH2CH2N)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)：δ=166.4(PhCO), 166.1(PhCO), 165.8 (PhCO), 165.7 (PhCO), 165.5 (PhCO), 165.4 (PhCO), 165.1(PhCO),133.6-132.9 (Ph), 129.8-128.2 (Ph), 106.4 (C-1II), 105.8 (C-1III), 97.6 (C-1I), 83.7(C-4III), 82.2 (C-4II), 81.9 (C-2II), 81.6 (C-2III), 78.0 (C-3III),76.9 (C-3II), 73.1 (C-5II), 71.3(C-5I), 70.4 (C-2I), 69.9 (C-3I), 69.5 (C-5III), 67.2 (C-4I), 66.2 (OCH2CH2CH2N), 66.15 (C-6III),66.1 (C-6I), 64.9 (C-6II), 37.6 (OCH2CH2CH2N), 28.5 (OCH2CH2CH2N)。HRMS (ESI): M =C86H74F3NO26. Calcdm/z for [M + NH4]+ 1611.4789, found 1611.4768. Calcd m/z for [M +Na]+1616.4343, found 1616.4322. Calcd m/z for [M + K]+ 1632.4083, found1632.4056。
（5）经真空干燥的化合物5(80 mg, 0.058 mmol)和化合物8(77 mg, 0.048) 溶解于二氯甲烷(4 mL)，加入预活化的分子筛（MS300AW，200 mg)。体系在氮气保护下室温搅拌15分钟，然后降温至-80 ˚C，加入TMSOTf (6.5 μL, 0.036 mmol)。体系在-80 ˚C下搅拌50分钟后升温至-10 ˚C，然后加入一滴三乙胺淬灭反应。体系浓缩后用硅胶柱纯化（甲苯：乙酸乙酯 =5:1v/v洗脱，RF=0.20），得到油状化合物9 (120 mg, 90%)；其1H NMR(600 MHz,CDCl3)：δ 8.09-7.10 (m, 83H, Ar), 5.99-5.96 (m, 1H, H-5V), 5.90-5.86 (m, 4H,H-3I, H-3II, H-3III, H-3IV), 5.83 (t, J4,3 =J4,5 = 10.0 Hz, 1H, H-4I), 5.80(s, 1H, H-1), 5.77 (s, 1H, H-1), 5.75 (s, 1H, H-1), 5.73 (d, J2,1 =1.2 Hz,1H, H-2), 5.71 (d, J2,3 = 1.9 Hz, 1H, H-2), 5.69 – 5.67 (m, 2H, H-2I, H-2V),5.59 (dd, J3,4= 5.2 Hz, J3,2 = 1.4 Hz, 1H, H-3V), 5.55 (d, J2,1 = 1.2 Hz, 1H,H-2II), 5.50 (s, 1H, H-1II), 5.06 (d,J1,2 = 1.5 Hz, 1H, H-1I), 4.92 (dd, J4,3= 5.1 Hz, J4,5 = 3.5 Hz, 1H, H-4V), 4.88 (dd, J4,3 = 4.7 Hz,J4,5 = 3.2 Hz,1H, H-4), 4.86 (dd, J4,3 = 5.3 Hz, J4,5 = 2.6 Hz, 1H, H-4), 4.80-4.66 (m, 9H,4×H-6, H-5II, 2×H-6II, 2×H-5), 4.65 (dd, J6a,6b = 12.0 Hz, J4,5 = 4.1 Hz,1H, H-6aV), 4.554.50 (m,2H, H-4II, H-6bV), 4.35 (m, 1H, H-5I), 4.24 (dd, J =10.1, 7.4 Hz, 1H, Fmoc-CHaHb), 4.15 (dd, J= 10.1, 7.7 Hz, 1H, Fmoc-CHaHb),4.10 (t, J=7.5 Hz, 1H, Fmoc-CH), 4.02-3.97 (m, 2H, H-6aI, OCHaHbCH2CH2N), 3.92(dd, J6b,6a = 12.4 Hz, J6b,5 = 2.0 Hz, 1H, H-6bI), 3.70-3.64 (m, 1H,OCH2CH2CHaHbN), 3.59-3.50 (m, 2H, OCHaHbCH2CH2N, OCH2CH2CHaHbN), 2.07-1.96 (m,2H, OCH2CH2CH2N)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)：δ = 166.2 (PhCO), 166.0 (PhCO), 165.6(PhCO), 165.2 (PhCO), 154.7 (C=O), 143.3 (Cq Fmoc), 141.2 (Cq Fmoc), 133.6-132.8 (Ar),130.0-127.1 (Ar), 125.3 (Ar), 125.2 (Ar), 119.9 (Ar), 106.3 (C-1II), 105.7 (C-1), 105.5 (C-1), 105.2 (C-1), 97.6 (C-1I), 83.5 (C-4), 83.1(C-4), 82.8 (C-4II), 82.0 (C-2), 81.9 (C-2V), 81.8 (3C,C-2, C-2II, C-4V),77.6 (C-3V), 77.0 (3C, C-3II, C-3, C-3), 73.2 (C-5), 73.0 (C-5II), 72.9 (C-5),71.5 (C-5I), 70.4 (C-2I), 70.2 (C-5V), 70.0 (Fmoc-CH2), 69.9 (C-5I), 67.2(C-4I), 66.7 (C-6V),66.2 (OCH2CH2CH2N), 65.9 (C-6I), 65.5 (C-6), 64.8 (2C, C-6II, C-6), 46.5 (Fmoc-CH), 37.6(OCH2CH2CH2N), 28.5 (OCH2CH2CH2N)。HRMS (ESI): M= C125H128F3NO44. Calcd m/z for[M + NH4]+ 2781.8100, found 2781.8066。
（6）化合物9 (97 mg, 0.035 mg)的甲醇溶液加入Pd/C（10%负载量，20mg），高纯氮气和氢气置换3次，体系在10atm压力氢气条件下室温搅拌过夜，在氮气保护下过滤硅藻土。滤液中加入甲醇钠0.1M甲醇溶液（1毫升），室温下搅拌过夜，然后加入0.1毫升纯化水，体系升温至60 ℃搅拌过夜。体系浓缩后直接用Bio Gel P2纯化，纯净水淋洗，HPLC跟踪收集淋洗液。浓缩淋洗液至2毫升，冻干得到白色粉状寡糖片段1 (11 mg, 89%)。1H NMR (600MHz, D2O): 5.22 (d, J12 = 2.0 Hz, 1H, H-1V), 5.19 (m, 2H, H-1III, H-1IV),5.03 (d, J12 = 1.5 Hz, 1H, H-1II), 4.85 (d, J12 = 1.8 Hz, 1H, H-1I), 4.17–4.14 (m, 5H, H-4III, H-4IV, H-2III, H-2IV, H-2V), 4.13–4.08 (m, 5H, H-3II, H-3III, H-3IV, H-2II, H-4II), 4.08–4.06 (m, 2H, H-3V, H-4V), 4.02 (m, 1H, H-6aI), 3.98–3.92 (m, 4H, H-5II, H-5III, H-5IV, H-2I), 3.87–3.83 (m, 2H, OCH2,H-5V), 3.82–3.78 (m, 7H, H-6aIII, H-6bIII, H-6aIV, H-6bIV, H-6aII, H-6bII, H-3I), 3.74–3.69 (m, 4H, H-6bI, H-6aV, H-5I, H-4I), 3.67 (dd, 2J6a6b = 11.7 Hz,J56b = 7.3 Hz, 1H, H-6bV), 3.61(ddd, 2Jab = 10.2 Hz, J = 6.8 Hz, J = 5.4 Hz,1H, OCH2CHCH2), 3.17–3.09 (m, 2H, OCH2CH2CH2N), 2.02–1.96 (m, 2H, OCH2CH2CH2N)。13C NMR (150 MHz, D2O): δ 108.7 (C-1II), 108.0 (C-1V) 107.9, 107.9 (C-1III,C-1IV), 100.8 (C-1I), 83.6 (C-4V), 82.8 (C-4II), 82.5 (2C, C-4III, C-4IV),82.3, 82.3, 82.2 (C-2III, C-2IV, C-2V), 82.0 (C-2II), 77.7 (C-3II), 77.5 (2C,C-3III, C-3IV), 77.3 (C-3V), 77.0 (C-5II), 76.6, 76.5(C-5III, C-5IV), 72.7(C-5I), 71.5 (C-3I), 71.5 (C-5V), 70.9 (C-2I), 67.8 (C-6I), 67.6 (C-4I), 66.0(OCH2), 63.8 (C-6V), 62.1 (2C, C-6III, C-6IV), 61.9 (C-6II), 38.5(OCH2CH2CH2N), 27.6 (OCH2CH2CH2N)。HRMS (ESI): Calcd m/z for [M + H]+ C33H59NO26886.3398, found 886.3396. Calcd m/z for [M + Na]+ C33H59NO26 908.3218, found908.3209。
（7）将步骤（6）所得寡糖片段1（8毫克）溶解于DMF（1毫升）和0.1M磷酸盐缓冲液（PBS，0.25毫升），搅拌下向混合液中加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯（5毫克），反应液室温搅拌过夜，高真空度减压蒸馏除去溶剂，得到白色固体，用乙酸乙酯搅洗固体，过滤干燥，得到活化的寡糖片段。按照25:1的摩尔比取活化的寡糖片段和KLH蛋白溶解于0.1M磷酸盐缓冲液（PBS，1毫升），反应液搅拌过夜，用透析法纯化糖蛋白，水溶液冻干，得到白色粉末状糖蛋白(1-5)-Gal-(1-6)-Man-7碳Linker -KLH糖蛋白。
对比例1 (1-5)-Gal-(1-6)-Man-3碳Linker -KLH糖蛋白的制备
按照实施例1的方法和原料比例制备寡糖片段和糖蛋白，不同在于，化合物6的结构式替换为：
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE022
。
实施例2 (1-5)-Gal-(1-6)-Man-7碳Linker -BSA糖蛋白的制备
将寡糖片段1（8毫克）溶解于DMF（1毫升）和0.1M磷酸盐缓冲液（PBS，0.25毫升），搅拌下向混合液中加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯（5毫克），反应液室温搅拌过夜，高真空度减压蒸馏除去溶剂，得到白色固体，用乙酸乙酯搅洗固体，过滤干燥，得到活化的寡糖片段。按照25:1的摩尔比取活化的寡糖片段和BSA溶解于0.1M磷酸盐缓冲液（PBS，1毫升），反应液搅拌过夜，用透析法纯化糖蛋白，水溶液冻干，得到白色粉末状(1-5)-Gal-(1-6)-Man-7碳Linker-BSA糖蛋白。
对比例2 (1-5)-Gal-(1-6)-Man-3碳Linker -BSA糖蛋白的制备
按照实施例2一样的方法和原料比例制备得到(1-5)-Gal-(1-6)-Man-3碳Linker -BSA糖蛋白。
实施例3 (1-5)-Gal-(1-6)-Man-Linker -KLH糖蛋白糖含量的测定
分别取1毫克实施例1获得的(1-5)-Galla-(1-6)-Man-7碳-KLH和对比例1获得的(1-5)-Gla-(1-6)-Man-3碳-KLH，用通用硫酸-苯酚法（苯酚-硫酸比色法测定多糖含量，食品与药品，2004 (6): 7）测定糖蛋白的含糖量分别为5.2%和4.5%，对比表明7碳链(1-5)-Gal-(1-6)-Man-Linker-KLH糖蛋白载糖量高于3碳链(1-5)-Gal-(1-6)-Man-Linker-KLH糖蛋白。更高的糖含量会有更强的免疫原性，其抗菌效果更好。
实施例4 不同糖蛋白免疫原性
将实施例1和对比例1制备的(1-5)-Gal-(1-6)-Man-7碳Linker-KLH和(1-5)-Gal-(1-6)-Man-3碳Linker-KLH在小鼠（C57/BL，七周大，每组10只）体内进行免疫实验。对实验小鼠进行皮下注射方式免疫，每只小鼠每次2μg寡糖注射量，分别在第1、14、21和28天进行注射免疫。分别在免疫前1天和最后一次免疫后第2天取血制备抗体血清，分别以相应寡糖的BSA糖蛋白(1-5)-Gal-(1-6)-Man-7碳Linker-BSA和(1-5)-Gal-(1-6)-Man-3碳Linker -BSA作为固定抗原，以酶联免疫法ELISA检测特异性抗体滴度，结果见图3、图4。由图3和图4可知，经过(1-5)-Gal-(1-6)-Man-Linker-KLH糖蛋白免疫后，小鼠血液中的抗体滴度明显增高，IgG抗体的滴度在总抗中占有较大比例，说明化合物诱导产生的免疫响应主要是IgG型。IgG型抗体属于T细胞参与的免疫响应，该响应能够使宿主细胞产生免疫记忆，促进抗体产生起到抗真菌感染的作用。图3和图4数据对比表明(1-5)-Gal-(1-6)-Man-7C-KLH比3碳链类似物(1-5)-Gal-(1-6)-Man-3C-KLH有更好的抗体免疫活性。该动物免疫实验说明(1-5)-Gal-(1-6)-Man-7C-KLH糖蛋白是一种可以被继续开发为抗真菌感染的疫苗。

Claims (6)

1.一种糖蛋白，其结构为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2. 根据权利要求1所述的糖蛋白，其特征在于，所述免疫原性载体蛋白为非人源蛋白；选自KLH，BSA，OVA，Blue carrierTM，白喉毒素无毒变异体，破伤风毒素/类毒素，分离自非获得型流感嗜血杆菌的高分子量蛋白，脱毒后的绿脓杆菌毒素A，霍乱毒素/类毒素，百日咳毒素/类毒素，产气荚膜梭状芽胞杆菌外毒素/类毒素，乙肝表面抗原，乙肝核心抗原，轮状病毒VP7蛋白，白喉毒素突变体CRM、CRM191、CRM3201，呼吸合胞病毒F和G蛋白中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的糖蛋白，其特征在于，所述免疫原性载体蛋白为KLH或BSA。
4.一种如权利要求1-3任一所述的糖蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）氮气保护、分子筛存在下，TMSOTf催化化合物2和化合物3在二氯甲烷中反应，终止反应后分离纯化得化合物4：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
；
（2）化合物4溶解于甲醇:二氯甲烷5:1混合溶剂中在PdCl2存在下于室温中反应，过滤后滤液用碱中和，分离获得油状物；油状物溶解于二氯甲烷，加入碳酸铯和CF3C(NPh)Cl，TLC跟踪反应，室温搅拌至反应完全，体系浓缩后用硅胶柱分离得到化合物5：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
；
（3）氮气保护、分子筛存在下，TMSOTf催化化合物5和化合物6于二氯甲烷中反应，终止反应后分离纯化得化合物7：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
；
（4）化合物7与吡咯烷在二氯甲烷中反应，再用稀酸洗涤，获得的有机相分离纯化，得化合物8：
；
（5）氮气保护、分子筛存在下，TMSOTf催化化合物5和化合物8于二氯甲烷中反应，终止反应后分离纯化得化合物9：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
；
（6）隔氧条件下，化合物9的甲醇溶液加入10%钯碳，以氢气加氢，在氮气保护下过滤，滤液中加入甲醇钠的甲醇溶液反应后再加入水反应，分离纯化后得到寡糖片段：
Figure DEST_PATH_IMAGE014
；
（7）将免疫原性载体蛋白、寡糖片段和双琥珀酰亚胺戊二酸酯溶于偶联液，孵育，然后分离纯化、纯化获得糖蛋白：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
。
5.一种如权利要求1-3任一所述的糖蛋白在制备抗真菌感染药物中的应用。
6.一种包含如权利要求1-3任一所述的糖蛋白的药物。
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