CN104004085A - 一种结核杆菌lam寡糖缀合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用。结核杆菌LAM寡糖缀合物,结构通式如下:
Description
技术领域
本发明涉及一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用,属于肺结核疫苗研制技术领域。
背景技术
肺结核是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病,具有较高的致死率。结核病主要通过呼吸道传染,也可以通过消化道、皮肤和子宫传染。大部分感染者通常没有任何症状,只有部分机体免疫力较低或细胞介导的***反应增高的感染者才会发病,如果不及时治疗,大约有一半的感染者会死亡。近几年这一疾病的发病率逐年上升。造成这一现象的原因主要有:(1)抗生素的滥用导致病菌耐药性的不断增强;(2)与艾滋病的交叉感染;(3)不发达国家较差的基础医疗设施和环境(J.Infect.Dis.,1999,179,S461;Drugs,1997,53:40;Pharmacotherapy,1998,18:738)。因此,研制新型、有效、安全的结核病药物成为国内外学者共同关注的一个重要课题。
结核病的治疗方法主要是抗生素和免疫治疗。抗生素治疗周期较长,不但给患者的免疫***造成了非常大的伤害,而且使病菌的耐药性不断增强。免疫治疗是预防结核病的非常有效的措施,不存在细菌耐药性和削弱患者免疫力的问题。目前,预防结核病的主要疫苗是卡介苗(BCG)。但是,研究发现BCG对结核病的免疫保护力低于80%(Trends Microbiol.,2008,16:456),对于有免疫缺陷的病人,BCG接种还有可能导致结核的全身播散。因此,人们迫切需要一种新的疫苗来替代BCG。为了达到这个目的,人们对结核杆菌的细胞结构进行了深入的研究。研究发现,其细胞壁的最外层含有结构非常复杂和特殊的糖聚合物,主要包括分枝酸-***半乳糖复合物(mAG)和脂肪***甘露聚糖(LAM)(Tuberculosis,2003,83:91)。其中,LAM在结核杆菌感染人体细胞的免疫学过程中扮演了非常重要的作用,它能够促进宿主巨噬细胞中有机体的存活,同时在结核杆菌细胞中LAM是高度保守的(FEMS Microbiol.Rev.,2011,35:1126)。因此,可以根据LAM的结构特征,设计合成LAM寡糖片段,并将其作为半抗原与蛋白质缀合,来制备复合糖缀合物疫苗。
目前,相关的研究工作主要集中在LAM寡糖片段的合成方法学上,只有少数人将寡糖片段与蛋白质连接。Peter H.Seeberger等(J.Am.Chem.Soc.,2008,130:16791)高效的合成了磷脂酰肌醇(PI)和含有1-6个甘露糖苷的磷脂酰肌醇(PIM1-PIM6),在每一个PIM的还原端都有一个硫醇作为连接基团与血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin,KLH)连接,但是,这些糖蛋白的免疫活性测试结果并不理想。David R.Bundle等(Bioconjugate Chem.,2014,25:685)将LAM非还原端***分支六糖通过点击化学反应连接在一个共聚维酮上,这一聚合物是由乙酸乙烯酯和N-乙烯基-2吡咯烷酮通过共聚合反应得到的,然后脱去聚合物上的乙酰基,再通过引入氨基、叠氮以及炔基等功能基团作为坠与糖或肽连接在一起。结果表明,最终的络合物能够作为较好的非蛋白抗原,很容易在ELISA板上产生吸附作用,在分析抗体与半抗原的连接方面表现出较好的特性。
当前,结核杆菌糖缀合物疫苗的研究仍然停留在试验阶段,有许多问题函待解决。目前,以结核分枝杆菌LAM非还原端含有甘露糖片段的***寡糖为半抗原,与载体连接制备结核杆菌复合寡糖缀合物疫苗,尚未见相关文献报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用,其中的寡糖是结核杆菌细胞表面夹膜多糖的寡聚衍生物。
本发明通过如下的技术方案来实现:
一种结核杆菌LAM寡糖缀合物,结构通式如下:
其中,寡糖是如下通式(Ⅰ)-(Ⅱ)中的任意一寡糖:
式(I)和式(Ⅱ)中,a是0到10中的任意一个整数,b是0到20中的任意一个整数,m是0到10中的任意一个整数,n是0到20中的任意一个整数,c是0或1,d是0或1,e是0或1;
X选自:-CH2-、-NH-、-O-、-C(O)-、-S-或之一;
连接体是寡糖与载体直接或间接连接后得到的结构部分;
t是与载体连接的寡糖的数量,t为1~30中的任意一整数;
载体选自:牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、白喉毒素无毒突变体(CRM197)、单磷酰化的脂质A(lipid A)、1,2-二硬酯酸-3-磷脂酰乙醇胺或1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺之一。
根据本发明优选的,所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式为如下之一:
式中,j1是1到10中的任意一个整数,j2是1到10中的任意一个整数,k是33或35,t是1到30中的任意一个整数。
根据本发明优选的,所述的载体选自:牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)或白喉毒素无毒突变体(CRM197)之一。
根据本发明进一步优选的,所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下:
根据本发明进一步优选的,所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下:
根据本发明进一步优选的,所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下:
上述结核杆菌LAM寡糖缀合物在制备肺结核疫苗中的应用。
有益效果
本发明所述的结核杆菌LAM寡糖缀合物中,寡糖的化学结构是明确且单一的,而非混合物,可通过化学方法合成,它能够解决卡介苗免疫保护力低的问题,对某些免疫力低下的人群同样会产生较好的免疫效果,同时能够避免抗生素的大量使用而带来的细菌耐药性的问题。
附图说明
图1 是化合物A11的1H NMR谱图;
图2是A11-KLH寡糖缀合物的特异性抗体滴度图;
图中kappa代表针对化合物产生的免疫球蛋白中轻链为Kappa的免疫球蛋白,IgM代表针对化合物产生的免疫球蛋白中重链为μ的免疫球蛋白,IgG1是针对化合物产生的免疫球蛋白中重链为γ的免疫球蛋白的一个亚型。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的技术方案,下面结合实施例作进一步详细描述,但本发明所保护范围不限于此。
实施例1:通用的合成方法
A:糖基化反应
取糖基供体(1.2个当量)、糖基受体(1个当量)和分子筛(与供体重量相等)溶于干燥无水的二氯甲烷中,在氮气气氛下将反应液降温至-30℃,搅拌30分钟,加入N-碘代丁二酰亚胺(NIS,1.2个当量)和催化量的三氟甲磺酸银(AgOTf)。反应液缓慢升至室温,待TLC检测到原料全部反应后用三乙胺中和,过滤除去不溶的固体,滤液旋干,粗品经硅胶柱分离得目标产物(所用洗脱液为石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA),除非另有说明)。
B:去乙酰化反应
将原料溶于甲醇,搅拌条件下加入1mol/L的甲醇钠甲醇溶液调节pH值至10左右,将反应液置于室温下搅拌反应3小时,TLC检测至原料全部反应完毕,反应液用酸性树脂(amberlite IR120)中和,过滤除去酸性树脂,减压蒸馏除去溶剂,粗品经硅胶柱分离得目标产物(所用洗脱液为石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA),除非另有说明)。
C:脱二甲基叔丁基硅(TBS)保护的反应
将原料(1个当量)溶于四氢呋喃,在搅拌条件下加入四正丁基氟化铵(TBAF)的四氢呋喃溶液(1mmol/mL,1.2个当量),室温搅拌反应2小时,减压蒸馏除去溶剂,粗品经硅胶柱分离得目标产物(所用洗脱液为石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA),除非另有说明)。
D:催化氢化反应
取原料溶于冰乙酸和水的混合溶液(冰乙酸:水=10:1),在氮气保护下加入催化量的钯碳(Pd/C,10%),向反应瓶中通入氢气,置换出氮气,反应液在氢气气氛下搅拌36小时。将反应液过滤除去钯碳,减压蒸馏除去溶剂得目标产物。
E:寡糖缀合物的合成
寡糖的活化:将寡糖溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和磷酸盐缓冲溶液(PBS buffer,0.1M)的混合液(DMF:PBS=4:1),搅拌条件下向其中加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯,反应液室温搅拌4小时,减压蒸馏除去溶剂得白色粉末状固体,固体用EA洗涤,干燥,得活化的寡糖。
寡糖蛋白缀合物的合成:按照30:1的摩尔比取活化的寡糖和蛋白(寡糖:蛋白=30:1)溶于PBS缓冲溶液,反应液搅拌过夜,用透析的方法除去小分子物质,透析完毕后将蛋白水溶液冻干得寡糖-蛋白缀合物。
实施例2:3-氨基丙基α-D-甘露糖基-(1→2)-α-D-甘露糖基-(1→5)-β-D-***糖基-(1→2)-α-D-***糖-KLH缀合物的合成(A11-KLH)
(1)5-O-叔丁基二甲基硅基-D-***糖(A1)的合成
取D-***糖(5.00g,33mmol)溶于100mL吡啶,在0℃下加入叔丁基二甲基氯硅烷(6.00g,40mmol)和催化量的4-二甲基氨基吡啶,将反应液置于室温下搅拌6小时。用TLC(EA)跟踪反应,待原料全部反应完后,将溶剂蒸干得黄色粘稠液体,粗品经硅胶柱分离得无色油状液体(6.34g,产率72%)。
(2)1,2,3-三-O-乙酰基-5-O-叔丁基二甲基硅基-α,β-D-***糖(A2)的合成
取A1(5.00g,19mmol)溶于5mL乙酸酐和20mL吡啶的混合溶剂,将混合液降温至0℃,搅拌条件下加入催化量的4-二甲基氨基吡啶,反应液升至室温反应4小时,减压蒸馏除去溶剂得黄色粘稠液体,粗品经硅胶柱分离得无色油状液体(6.65g,产率90%,α:β=2:1)。
(3)对甲苯硫基2,3-二-O-乙酰基-5-O-叔丁基二甲基硅基-1-S-α-D-***糖(A3)的合成
将A2(6.00g,15mmol)和对甲苯硫酚(2.29g,18mmol)溶于50mL干燥除水的二氯甲烷中,将混合液降温至0℃,在搅拌条件下加入催化量的四氯化锡。反应液升至室温搅拌30分钟,TLC跟踪反应至原料全部消失,反应液用三乙胺中和,旋蒸除去溶剂,粗品经硅胶柱分离得无色油状液体(5.01g,产率72%)。
(4)对甲苯硫基2,3-二-O-苄基-5-O-叔丁基二甲基硅基-1-S-α-D-***糖(A4)的合成
取A3(5.00g,11mmol)按实施例1中通用合成方法B脱去乙酰基,用酸性树脂中和反应液,过滤除去固体,减压蒸馏除去溶剂得淡黄色油状液体。将此液体溶于30mL干燥除水的DMF,混合液降温至0℃,缓慢加入NaH(60%,1.76g,44mmol),加完后保持0℃反应30分钟。取BnBr(5.64g,33mmol)缓慢加入到反应液中,反应液升至室温搅拌30分钟。此时将反应液倾入150mL冰水中,再用100mL乙酸乙酯萃取,有机相用水洗涤,无水硫酸钠干燥,旋干得淡黄色油状液体,粗品经硅胶柱分离得无色油状液体(4.50g,产率74%)。
(5)3-叠氮基丙基2-O-乙酰基-3,5-二-O-苄基-α-D-***糖(A5)的合成
以对甲苯硫基2-O-乙酰基-3,5-二-O-苄基-1-S-α-D-***糖(2.30g,4.81mmol,参照文献Org.Lett.,2014,16,988的方法合成)为糖基供体,3-叠氮基-1-丙醇(583mg,5.77mmol)为受体,按照实施例1中通用合成方法A进行糖基化反应得目标产物(1.90g,产率87%)。
(6)3-叠氮基丙基3,5-二-O-苄基-α-D-***糖(A6)的合成
取A5(1.50g,3.30mmol)按实施例1中通用合成方法B脱去乙酰基得目标产物(1.24g,产率91%)。
(7)3-叠氮基丙基2,3-二-O-苄基-5-O-叔丁基二甲基硅基-β-D-***糖基-(1→2)-3,5-二-O-苄基-α-D-***糖(A7)的合成
以A4(2.30g,4.18mmol)为糖基供体,A6(2.07g,5.02mmol)为糖基受体,按照实施例1中通用合成方法A进行糖基化反应得目标产物(β:α=1.5:1,1.79g,产率51%)。
(8)3-叠氮基丙基2,3-二-O-苄基-β-D-***糖基-(1→2)-3,5-二-O-苄基-α-D-***糖(A8)的合成
取A7(1.00g,1.19mmol)按实施例1中通用合成方法C脱去TBS保护基得目标产物(794mg,产率92%)。
(9)3-叠氮基丙基2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖基-(1→2)-3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖基-(1→5)-2,3-二-O-苄基-β-D-***糖基-(1→2)-3,5-二-O-苄基-α-D-***糖(A9)的合成
以对甲苯硫基2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖基-(1→2)-3,4,6-三-O-苄基-1-S-α-D-甘露糖(200mg,0.19mmol,参照文献J.Org.Chem.,2007,72,8976的方法合成)为糖基供体,A8(141mg,0.19mmol)为糖基受体,按照实施例1中通用合成方法A进行糖基化反应得目标产物,以正己烷(n-hexane)/乙酸乙酯为洗脱液(α:β=1.8:1,168mg,产率53%)。
(10)3-叠氮基丙基3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖基-(1→2)-3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖基-(1→5)-2,3-二-O-苄基-β-D-***糖基-(1→2)-3,5-二-O-苄基-α-D-***糖(A10)的合成
取A9(70mg,43μmmol)按实施例1中通用合成方法B脱去乙酰基得目标产物,以甲苯(toluene)/乙酸乙酯为洗脱液(62mg,产率91%)。
(11)3-氨基丙基α-D-甘露糖基-(1→2)-α-D-甘露糖基-(1→5)-β-D-***糖基-(1→2)-α-D-***糖乙酸盐(A11)的合成
取A10(30mg,19μmmol)按实施例1中通用合成方法D脱去苄基得目标产物(13mg,产率96%)。1H NMR(600MHz,D2O),见说明书附图1,δ:4.98(s,1H),4.95(s,2H),4.84(s,1H),4.01-3.40(m,24H),2.95(t,2H),1.80(m,2H),1.73(s,3H).质谱:MALDI-TOF MS(m/z):计算值:C25H45NO19Na[M+Na]+,686.2,实测值:685.4。
(11)A11-KLH糖缀合物的合成
取A11(1mg),KLH(4mg)按实施例1中通用合成方法E合成A11-KLH缀合物(3.1mg)。以硫酸-苯酚法(参考医药导报,2008,27,12:1511的方法)测定寡糖缀合物的糖含量为5.7%。
实施例3:3-氨基丙基α-D-甘露糖基-(1→2)-α-D-甘露糖基-(1→5)-β-D-***糖基-(1→2)-α-D-***糖-BSA缀合物的合成(A11-BSA)
取A11(1mg),BSA(3mg)按实施例1中通用合成方法E合成A11-BSA缀合物(2.7mg)。质谱:MALDI-TOF MS(m/z):74354
实施例4:寡糖缀合物A11-KLH的免疫原性抗体滴度测定
实施例2中制备的寡糖缀合物A11-KLH在小鼠(C57/BL,7周大,每组6只)体内进行免疫试验。采用皮下注射的方式,以寡糖用量计算,2μg/只小鼠/次,分别在第1、14、21、28天进行免疫。
分别在免疫前1天和末次免疫2天后取血,制备抗血清研究其免疫原性,用相应寡糖的BSA缀合物作为固定抗原,以酶联免疫法(ELISA)检测多糖特异性抗体的滴度,结果如图2所示。
经过免疫后,小鼠血液中的抗体滴度明显增高,IgG1抗体的滴度在总抗中占有较大比例,说明化合物诱导产生的免疫响应主要是IgG1型,而IgG1型抗体属于T细胞参与的免疫响应,它能够使宿主细胞产生免疫记忆,促进抗体成熟,这一结果说明化合物A11-KLH是一种非常有前景的肺结核疫苗。
Claims (7)
1.一种结核杆菌LAM寡糖缀合物,结构通式如下:
其中,寡糖是如下通式(Ⅰ)-(Ⅱ)中的任意一寡糖:
式(I)和式(Ⅱ)中,a是0到10中的任意一个整数,b是0到20中的任意一个整数,m是0到10中的任意一个整数,n是0到20中的任意一个整数,c是0或1,d是0或1,e是0或1;
X选自:-CH2-、-NH-、-O-、-C(O)-、-S-或之一;
连接体是寡糖与载体直接或间接连接后得到的结构部分;
t是与载体连接的寡糖的数量,t为1~30中的任意一整数;
载体选自:牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、破伤风类毒素、白喉毒素无毒突变体、单磷酰化的脂质A、1,2-二硬酯酸-3-磷脂酰乙醇胺或1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺之一。
2.如权利要求1所述的结核杆菌LAM寡糖缀合物,其特征在于,所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式为如下之一:
式中,j1是1到10中的任意一个整数,j2是1到10中的任意一个整数,k是33或35,t是1到30中的任意一个整数。
3.如权利要求1所述的结核杆菌LAM寡糖缀合物,其特征在于,所述的载体选自:牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、破伤风类毒素或白喉毒素无毒突变体之一。
4.如权利要求2或3所述的结核杆菌LAM寡糖缀合物,其特征在于,所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下:
5.如权利要求2或3所述的结核杆菌LAM寡糖缀合物,其特征在于,所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下:
6.如权利要求2或3所述的结核杆菌LAM寡糖缀合物,其特征在于,所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下:
7.权利要求1所述结核杆菌LAM寡糖缀合物在制备肺结核疫苗中的应用。
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