CN101014698A - 作为多种疫苗候选物的保守性内核脂多糖表位 - Google Patents

Abstract

本发明公开了在一定范围的致病性病原菌分离株的脂多糖(LPS)上表达的保守性内核寡糖表位，所述分离株包括胸膜肺炎放线杆菌(Ap)、溶血性曼氏杆菌(Mh)和多杀性巴氏杆菌(Pm)。构建了只以末端暴露结构的形式表达保守性内核OS表位的突变菌株，这使得能够识别、制备和分离这三种生物共有的内核LPS。进一步提供了相关的疫苗、针对该保守性LPS内核产生的抗体以及糖结合物，所述糖结合物包括与免疫原性载体连接的LPS内核。

Description

作为多种疫苗候选物的保守性内核脂多糖表位

技术领域

本发明涉及兽类细菌性病原体脂多糖(LPS)，其包括所述LPS的内核寡糖部分的一个或多个表位。本发明鉴别出在兽类细菌性病原体的一些致病分离株的LPS上表达的保守性表位，所述致病分离株包括但不限于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，Ap)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica，Mh)和多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)。

背景技术

细菌性病原体是商业农场运作中经济损失的很大原因，也是极大范围的动物群体(包括人类)的健康问题的很大原因。与兽类疾病有关的三种最常见的细菌性病原体为溶血性曼氏杆菌(溶血性巴氏杆菌，Mh)、胸膜肺炎放线杆菌(Ap)和多杀性巴氏杆菌(Pm)。Mh主要是牛和羊的病原体，Ap是猪病原体，Pm是多个物种包括家禽、家畜和猪的病原体，同时也是狗和猫咬伤人类导致感染的致病因子。总之，它们可引发疾病，导致动物饲养业的极大经济损失。

当前的措施包括使用菌苗或者简单修饰的活菌株作为疫苗。由于效果不够好，并且不良作用出现几率较高，这些方法并不完全令人满意。

目前没有哪一种疫苗可以提供针对这三个菌种——Mh、Ap和Pm导致的感染的跨菌种保护。针对这些致病菌的疫苗极有用处。对付由Mh引起的疾病的疫苗方法仍然主要是基于菌苗和活减毒株。最近的活疫苗中引入了分泌或者提取的Mh抗原，如神经氨酸酶、白细胞毒素、唾液糖蛋白酶、外膜以及未识别的蛋白。白细胞毒素在常规上一直是主要的亚单位疫苗候选物，但使用表达非毒性白细胞毒素的突变株进行免疫接种在小牛激发模型(calf challenge model)中仍然部分有毒，并且白细胞毒素与荚膜多糖联合使用时不能产生防护性免疫应答。相比而言，LPS已显示出可稳定白细胞溶解活性，所以基于LPS和去毒白细胞毒素的联合疫苗可带来希望[Li，J.，and K.D.Clinkenbeard.1999.Infect.Immun.67：2920-2927]。

目前对付由Ap引起的疾病的疫苗方法是基于活减毒株，它们中含有高度不稳定的Apx毒素，该毒素可诱导防护所需的中和抗体。这些Apx毒素形成了针对Ap的主要亚单位疫苗的基础，但似乎只能诱导部分临床防护。有人提出将粘附素(包括LPS的核心OS)作为改善的疫苗候选物[VanOverbeke I.，et al.2003.J.Vet.Med.B.Infect.Dis.Vet.PublicHealth.50：289-293]。目前预防猪Pm病的疫苗由类毒素和体细胞抗原如荚膜和外膜蛋白组成。巴斯德(Pasteur)首先表明Pm可引起鸡的禽霍乱，目前对该病的防护手段是利用Pm减毒株。然而一般来说，由于该免疫应答仍然是血清型限制的，不能提供对其他血清型的交叉保护，所以这种手段受到极大限制。然而已经表明Pm的LPS在感染的免疫中起部分作用。

已经积累了相当的证据表明来自这些生物中每一种的LPS都可能是亚单位疫苗设计的良好候选物。已经显示LPS是Mh表面上可见的和主要的抗原决定簇，由A1 LPS诱导的mAb有助于吞噬作用而无助于补体介导的体外杀伤[Wilson，C.F.，et al.1992.Vet.Microbiol.31：161-168]。

对于Pm，核糖体-LPS疫苗保护鸡类免受由同源Pm菌株引起的禽霍乱感染[Phillips，M.，and R.B.Rimler.1984.Am.J.Vet.Res.45：1785-1789]。另外，使用LPS-蛋白复合物对小鼠进行免疫接种，当使用同源菌株攻击小鼠时该免疫接种可提供100％的保护，然而当分开使用时，该复合物的单一组分无法提供保护。来自Pm的LPS诱导的MAb在小鼠模型中只能提供部分保护，尽管它们具有调理吞噬作用，但在补体存在下不具有杀菌作用。然而在另一项实验中，针对PmLPS的mAb可完全保护小鼠免受同源攻击，并且具有杀菌作用[Wijewardana，T.G.，et al.1990.J.Med.Microbiol.33：217-222]。一种模拟来自A型的LPS的抗独特型疫苗在小鼠模型中当其受到同源生物攻击时可起到保护作用。

在Ap中，LPS，更具体地说是LPS的核区与该细菌的粘附能力有关。BSA与Ap血清型1 LPS连接的联合疫苗可在同源攻击而不能在异源攻击后保护小鼠，来自血清型5和1的光滑型和粗糙型Ap LPS的联合疫苗表明Ap细胞壁的糖部分在猪免疫应答中起重要作用[Fenwick，B.，and B.I.Osburn.1986.Infect.Immun.54：583-586]。

在此背景下，所感兴趣的兽医上的生物包括表面暴露的糖部分，并可考虑作为疫苗候选物。这些糖部分包括LPS和荚膜多糖。荚膜多糖是几种糖类残基的重复单元，并与细菌表面直接连接，而LPS由以下三个区构成：脂质A区，它通过脂肪酸残基将LPS分子与细菌表面相连；相对保守的核寡糖区，它将脂质A区与第三区即可变多糖抗原(O-抗原)相连。荚膜和O-抗原多糖的菌株间异质性通常可将它们从经济可行的疫苗候选物中排除，因为它们只对同源菌株有效。分子遗传学、分子结构分析以及免疫化学的最新进展提供了强有力的工具，使得我们能够识别可作为候选物疫苗抗原的糖结构。

脂多糖(LPS)是Mh、Ap和Pm中重要的并很有特点的表面暴露抗原。(如上所讨论，本文使用的术语“脂多糖”和“LPS”涵盖短链脂多糖和脂寡糖(LOS))。Pm菌株表达多组异质性低分子量LPS，这些LPS在多个寡糖表位上显示广泛的抗原多样性，而Mh和Ap菌株既产生低分子量LPS，也产生带有O-抗原聚合物的常规LPS。申请人在此描述的Mh、Ap和Pm的LPS糖结构当以合适的形式(例如作为蛋白缀合物)呈递给宿主免疫***时，可提供一种保护性抗原的来源。在申请人的研究中，LPS被证实可用作疫苗候选物，这是因为意外地识别出这样一种表面表达的糖抗原，它们具有的寡糖表位在遗传上和生理上稳定，在此范围的菌株中保守，在三个菌种Mh、Ap或Pm中可进入宿主的清除机制。

Mh、Ap和Pm的LPS分子的糖区为宿主免疫***进行识别提供了靶标。确定其结构对于理解Mh、Ap和Pm的LPS的生物学及其在细菌毒力中的作用是很关键的。Mh、Ap和Pm的LPS包括分子的异质性混合物，所述分子由可变的寡糖部分、膜锚定的脂质A部分以及在某些Mh和Ap菌株的情况下还有聚合的O-抗原构成。基于本文所描述的实验，开发了Mh、Ap和Pm的LPS的结构模型，该结构模型由保守的四-庚糖基-二-葡糖基内核部分组成，该部分通过磷酸化酮脱氧辛酸残基(Kdo)附着于脂质A部分，并且发现它在目前所研究过的每一菌株中均存在并且是保守的。

从结构分析中明显看出，这三个菌种中绝对保守的最大结构如以下结构I所示。

                         结构I

其中Kdo是3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸，Hep是庚糖，Glc是葡萄糖，P是磷酸酯，脂质A(Lipid A)是去毒的。

为了将抗原用作疫苗开发，必须满足四条重要的标准。即候选抗原的免疫原性表位一定要：

i)遗传上稳定；

ii)在这些菌种的所有临床上相关的菌株中均保守；

iii)可进入(体外及体内)宿主免疫机制；以及

iv)能够在体内诱导保护性抗体。

本发明已经鉴别出显示满足大部分这些标准的保守性LPS糖表位。

i)遗传稳定性：在三个菌种的基因组菌株(两个Pm株，一个Mh株，两个Ap株)中，已鉴别出涉及保守性内核寡糖生物合成的基因。这些菌种显示的不同的外核变异所涉及的基因已被发现是变化地存在的，这些数据已经使用每一菌种的基因组菌株和其他菌株的结构数据确证。然而结构和遗传分析(见表A)均表明内核结构在结构上是保守的，这是由于总是存在已知负责内核生物合成的基因。

表A.兽类病原体的保守性内核LPS的糖基转移酶

兽类病原体基因组菌株中的保守性内核糖基转移酶

基因	Pm-3480	Pm70	Ap_1	Ap_5	Mh
						kdtA	Contig49e-155*	PM1305e-155	Contig25e-129	ap93i1204e-128	Contig164e-126
opsX	contig49e-145	PM1320e-152	Contig24e-111	ap93i0300e-108	Contig165e-116
						rfaF	Contig68e-165	PM1844e-165	Contig25e-153	ap93i0451e-154	Contig81e-155
orfH	Contig28e-132	PM1294e-132	Contig24e-83	ap93i0686e-120	Contig109e-132
						lgtF	Contig49e-110	PM1306e-110	Contig24e-110	ap93i0684e-114	Contig109e-116
lbgB	Contig59e-inf	PM1144e-inf	Contig29e-98	ap93i1369e-98	Contig147e-89

*使用来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)菌株WK-20(Rd)的内核LPS糖基转移酶对兽类病原体基因组进行Blast运算后获得的e值，其中除了lbgB使用的是来自Pm70基因组的PM1144。

基因组数据获自：Baylor College of Medicine，Houston(Mh)；Department of Microbiology and Immunology，Laboratory for Genomicsand Bioinformatics，Oklahoma University Health SciencesCenter(Pm-3480 and Ap1)；Institute for Biological Sciences，National Research Council，Ottawa，Canada(Ap5)；ComputationalBiology Centre，University of Minnesota(Pm70).

ii)结构保守性：到目前为止申请人所研究的每个菌株中，此四-庚糖基-二-葡糖基部分总是包含于下列结构元件(结构II)中：

                          结构II

其中：-R是H或者磷酸乙醇胺(PEtn)，P是磷酸酯，R’和R″是H或者寡糖链延伸，优选不包括β-D-Galp-(1-7)-D-α-D-Hepp-(1-6)，R是Ap中可变的O-抗原，Kdo是3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸，脂质A(Lipid A)是去毒的。

表B：兽类病原体溶血性曼氏杆菌(Mh)、胸膜肺炎放线杆菌(Ap)和多杀性巴氏杆菌(Pm)的LPS的核寡糖中保守区和可变区的结构。

菌种	菌株/血清型	R’	R”	R
					Mh	A1	H	β-D-Galp-(1-7)-D-α-D-HepVp-(1-	H
	A8	H	D-α-D-HepVp-(1-	H
						SH1217	H	β-D-Galp(1-7)-D-α-D-HepVp-(1-	H
					Ap	1	(1S)-GalaNAc-(1-4，6)-α-D-Gal-(1-3)-β-D-Gal-(1-	H	H
	2	β-D-Glc-(1-	D-α-D-HepV-(1-	H
						5a	H	D-α-D-HepV-(1-	H
	5b	H	D-α-D-HepV-(1-	H
Pm	Pm70	β-D-Glc-(1-	α-D-GalpNAc-(1-3)-β-D-GalpNAc-(1-3)-α-D-Gal-(1-4)-β-D-Gal-(1-4)-β-D-Glc(1-	PEtn
						VP161	PCho-3-β-D-Gal-(1-	PCho-3-β-D-Gal(1-	H
	X73	(PEtn-6)-PCho-3-β-D-Gal-(1-	(PEtn-6)-PCho-3-β-D-Gal-(1-	H

对于Pm来说，庚糖残基Hep^IV是L-α-D构型。同样在Pm中，Hep^I的6位的α-葡萄糖残基在少数糖型中缺失，同时伴随有Kdo残基的结构不同，

此时Kdo的4位上不是P-R，而是第二个Kdo残基。

第一个庚糖残基(Hep^I)是唯一一个在所有三个菌种Ap、Mh和Pm中显示从该残基发生核寡糖延伸的庚糖残基。外核延伸从Hep^IV残基进一步伸长。在所有菌种中均未观察到从Hep^II或Hep^III的核寡糖延伸。在Ap血清型5中发现了从Hep^III残基发生的O-抗原延伸[St.Michael，F.et.al.2004，Carbohydr.Res.，339：1973-1984]，未显示出Mh中O-抗原附着于核心OS的位置。Pm中未观察到抗原聚合物重复单元。已经显示四个基因涉及Ap血清型1中的O-抗原的生物合成，包括rfbP和rfbU，它们的突变会产生没有O-抗原的Ap菌株[Labrie，J.et al.2002，J.Endotox.Res.，8：27-38]。所有三个菌种的内核均可被磷酸乙醇胺残基进一步取代，可以在Pm菌株Pm70的Hep^II残基的3位，也可以在所有菌种AP、Mh和Pm中的Kdo-P残基。在Pm中，少数种类LPS糖型显示出具有两个Kdo残基而不是Kdo-P或者Kdo-P-PEtn部分，第二个Kdo残基的存在同时伴有内核α-Glc残基的缺失。在所研究的三个菌种的内部和它们之间都观察到外核变异。在Ap血清型1中，使用NMR对外核延伸进行完全地结构表征，显示寡糖延伸(1S)-GalaNAc-(1-4，6)-α-Gal-(1-3)-p-Gal的末端含有少见的开链N-乙酰半乳糖胺。该结构还可从血清型9和11的质谱中推知。在Ap血清型2中，发现Hep^IV残基在4位被β-Glc残基二取代，在6位被D，D-α-Hep^V残基二取代。在Ap血清型5中，只有D，D-α-Hep^V残基取代Hep^IV。在Mh中观察到与在Ap血清型5中所发现的相似的外核延伸，其中第二个D，D-α-Hep^V残基本身在7位被β-Gal残基取代。在Pm中，对两个血清型1菌株VP 161和X73的研究揭示了异常的外核延伸，其中Hep^IV残基在4和6位被β-Gal残基对称取代，它们本身又在3位被磷酸胆碱部分单取代，或者除了磷酸胆碱残基，在β-Gal残基的6位还具有磷酸乙醇胺残基(X73)。对基因组测序菌株Pm70的另一项研究再一次表明Hep^IV残基在4和6位被二取代。在4位被β-葡萄糖残基取代，在6位被不常见的戊多糖

α-GalNAc-(1-3)-β-GalNAc-(1-3)-α-Gal-(1-4)-β-Gal-(1-4)-β-Glc取代。

iii)可达性：既然该内核结构在这三个菌种中总是表达，所以弄清以下问题非常重要，即是否该内核结构表位总是可接近的并且在构象上是保守的，而不管外核、O-抗原和其他细胞表面结构如何变异。为实现此目的，该保守性结构需要被加工成末端结构，并将糖基转移酶靶向该末端，以暴露该结构。利用Pm菌株Pm70的完全基因组序列以及对该菌株LPS结构的完全的了解(见实施例3)，可帮助实验中识别负责Pm70 LPS结构的生物合成的糖基转移酶。也包括第二个Pm菌株(P-3480)、两个Ap菌株(血清型1和5)和一个Mh菌株(血清型A1)这些其他基因组序列，并利用生物信息学方法识别发生诱变的靶基因。选择Mh菌株A1进行诱变研究，这是由于在该生物中存在的O-抗原的量与Ap相比较低，因而不会干扰随后的免疫研究。如下所示，在a)Mh菌株A1和b)Ap血清型1中均鉴别出候选糖基转移酶。

杜克雷嗜血杆菌(H.ducreyi)lbgA半乳糖转移酶基因的同源物[Tull ius，M.V.et al 2002，Infect.Immun.70：2853-2861]已通过mini-Tn10转座子发生诱变在Ap中识别，它位于涉及核寡糖生物合成的两个基因之间[Galarneau，C.et al 2000，Pathogenesis，1：253-264]。Ap中相邻的基因lbgB显示出与来自杜克雷嗜血杆菌的D-甘油-D-甘露-庚糖转移酶的相当大的同源性。使用Ap的lbgB基因序列对Mh基因组序列(Baylor College，Houston)进行Blast分析，揭示出在Mh基因组序列中有两个相邻的D-甘油-D-甘露-庚糖转移酶的同源物。所识别的最佳lbgB同源物据推测为负责在第一个L-甘油-D-甘露-庚糖残基(Hep^I)的延伸上添加第一个D-甘油-D-甘露-庚糖残基(Hep^IV)的D-甘油-D-甘露-庚糖转移酶，因此我们推测，第二个同源物(我们称为losB)是负责添加第二个D-甘油-D-甘露-庚糖残基(Hep^V)的D-甘油-D-甘露-庚糖转移酶。

利用标准的分子生物学技术使该基因发生突变，突变株产生的LPS经过结构鉴定显示，已经获得了所靶向的保守性内核结构(见实施例7)。诱导针对此内核LPS结构的mAb和pAb，以检验在这些兽类病原体的一定范围的菌株中此结构的保守性和可达性的程度。所获得的多克隆血清可与这三个菌种Mh、Ap和Pm中每一种的LPS和全细胞发生交叉反应。从一个融合物获得了四种mAb(G3、G8、E8和D8)，它们特异性针对Mh全细胞上所呈现的内核构象。从另一个融合物中获得了三种mAb(3-4、3-5和3-16)，它们能够与Ap、Pm和Mh的所有研究过的菌株的LPS发生交叉反应，因而建立了这三种重要的兽类病原体之间共有的保守***叉反应性LPS表位的可能性。由这些mAb中的四种(G3、G8、3-5和3-16)产生腹水，使用全细胞ELISA进行检测，显示由这些mAb识别的LPS表位在全细胞上是可接近的，从而证明该保守性内核表位在细胞表面上是可接近的。而且，mAb G3和G8在有助于被动保护，表明在体内可接近此内核结构。

iv)功能性抗体：含有可与所研究的菌种的LPS交叉反应的抗体的多克隆血清，以及mAb G8和G3能够帮助补体介导的Mh细胞的溶解。在完善的Mh感染的小鼠模型中进行被动保护研究，显示提供特异性针对Mh中此保守性内核LPS结构的mAb(G3和G8)能够预防疾病。最后，制备了将该保守性糖结构与载体蛋白HSA连接的联合疫苗，使用该联合疫苗进行免疫接种后收集小鼠血清，发现该血清可与所研究的这三个菌种的LPS和全细胞发生交叉反应。

发明内容

本发明提供适于提供免疫力的疫苗、疫苗组分及其应用，所述免疫力涉及来自兽类细菌性病原体脂多糖(LPS)的B细胞活化分子，所述分子包括该脂多糖的内核寡糖部分的一个或多个表位。本文公开的内容识别和表征了兽类细菌性病原体的一定范围的致病分离株的LPS上表达的表位，所述致病分离株包括但不必限于胸膜肺炎放线杆菌(Ap)、溶血性曼氏杆菌(Mh)和多杀性巴氏杆菌(Pm)。本文识别了适用于制备疫苗的确定的亚单位抗原。作为疫苗候选物的抗原优选以其自然状态呈现于细菌表面，以使针对该疫苗抗原的免疫应答随后可靶向活生物体。

我们已经发现并制备出所有三种生物体共有的内核LPS。已显示LPS在对这些兽类病原体的每一种都具有免疫力作用，如果LPS抗原在构象上保守，那么免疫应答可能会识别同源和异源菌株甚至菌种。

结构分析数据表明，所有这些兽类病原体都有一个共同的保守性内核OS结构。因此决定探索基于LPS的疫苗的可能性。

该过程的第一步是构建以末端暴露结构的形式只表达保守性内核OS表位的突变株。该研究已经从Mh菌株A1产生α-1，6-D-甘油-D-甘露-庚糖转移酶基因的突变体，以便以末端暴露部分的形式呈现保守性内核表位。

诱导针对此内核LPS结构的mAb和pAb，以检验在这些兽类病原体的一定范围的菌株中此结构的保守性和可达性的程度。获得了三种mAb，它们能够与Ap、Pm和Mh的所有研究过的菌株的LPS发生交叉反应，因而建立了这三种重要的兽类病原体之间共有的保守***叉反应性LPS表位的可能性。

全细胞ELISA分析显示，这些LPS表位可由mAb在全细胞上识别，从而证明该内核表位在细胞表面上是可接近的。识别内核寡糖的mAb能够帮助补体介导的Mh细胞的杀菌性溶解。在完善的Mh感染的小鼠模型中进行被动保护研究，显示提供特异性针对此保守性内核LPS结构的mAb能够预防疾病。最后，制备了将该保守性糖结构与载体蛋白HSA连接的联合疫苗，使用该联合疫苗进行免疫接种后收集小鼠血清，发现该血清可与所研究的这三个菌种发生交叉反应。

一方面，本发明提供一种脂多糖部分，包括不含可变的外核寡糖链延伸的保守性二-葡糖基-四-庚糖基内核。

另一方面，本发明提供一种脂多糖部分，包括具有下列结构II的保守性二-葡糖基-四-庚糖基内核部分。

                       结构II

其中：-R是H或者磷酸乙醇胺(PEtn)，P是磷酸酯，R’和R″是H或者寡糖链延伸，优选不包括β-D-Galp-(1-7)-D-α-D-Hepp-(1-6)，R是Ap中可变的O-抗原，Kdo是3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸，脂质A(Lipid A)是去毒的。

另一方面，本发明提供一种为动物宿主提供针对由Mh、Ap或Pm引起的疾病的保护的免疫原性组合物，包括上述的脂多糖部分中的一种。

另一方面，本发明提供LPS生物合成途径中至少一种基因在制备Mh、Ap或Pm的脂多糖中的应用，用以获得包含上述脂多糖部分中的一种的突变株。

另一方面，本发明提供至少一种免疫原性表位在诱导针对Mh、Ap或Pm的功能***叉反应抗体中的应用，其中所述表位包括上述脂多糖部分中的一种。

另一方面，本发明提供一种功能性抗体，该抗体针对Mh、Ap或Pm可发生交叉反应，并且该抗体是由上述的脂多糖部分中的一种诱导的。

另一方面，本发明提供一种制备针对Mh、Ap或Pm的功能***叉反应抗体的方法，该方法包括：(a)产生针对上述的脂多糖部分中的一种的抗体，(b)将抗体针对多种Mh、Ap和Pm菌株进行测试，(c)选择可交叉反应的抗体。

另一方面，本发明提供一种针对由Mh、Ap或Pm感染导致的疾病对宿主进行免疫接种的方法，该方法包括将免疫有效量的上述免疫原性组合物给予宿主。

以下保守性内核LPS结构已经在Mh、Ap和Pm中识别。该结构可用作对所有菌株有效的疫苗候选物。所有三个菌种都具有此相同的结构单位这一意外发现，使得能够基于该保守性结构制备多菌种疫苗。

其中：-R是H或者磷酸乙醇胺(PEtn)，P是磷酸，R’和R″是H或者寡糖链延伸，优选不包括β-D-Galp-(1-7)-D-α-D-Hepp-(1-6)，R是Ap中可变的O-抗原，Kdo是3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸，脂质A(Lipid A)是去毒的。

为了表征各菌种中这些保守性结构而进行的结构分析在实施例1(Mh)、实施例2(Ap)和实施例3～5(Pm)中详细叙述。实施例1描述了溶血性巴氏杆菌的血清型A1 LPS的结构分析。实施例2描述了来自几种Ap血清型的LPS的结构分析，由此首先识别出Mh和Ap的内核分子在结构上的亲缘关系。实施例3描述了来自Pm的基因组菌株的LPS的结构分析，由此首先识别了所有三个菌种的内核分子的结构保守性。实施例4描述了Pm菌株VP161的LPS的结构分析。实施例5描述了Pm菌株X73的核寡糖的结构分析。实施例6描述了Pm的orfH基因、Hep III到Hep II庚糖转移酶的识别。实施例7描述了显示出兽类病原体特异性的保守的LPS结构的、溶血性曼氏杆菌的D-甘油-D-甘露-庚糖转移酶突变型的产生，以及针对此LPS结构的抗体的开发及其交叉反应性。实施例8描述了利用该保守性内核LPS分子作为糖部分的糖联合疫苗的产生和研究。实施例9描述了使用内核特异性单克隆抗体和多克隆血清获得的杀菌实验数据。实施例10描述了使用内核特异性单克隆抗体获得的被动保护实验数据。总的来说，这些实施例表明，这些内核脂多糖表位可作为疫苗候选物，用以预防由LPS分子中包含该内核结构的菌种引起的疾病。

由荚膜多糖构成的疫苗可有效预防由同源的有荚膜细菌引起的人类疾病。由于缺少T细胞依赖性应答，这些糖抗原在人体中的免疫原性通常较差。然而，通过将特异性多糖抗原与适当的蛋白载体联合，糖抗原的免疫原性相对于多糖本身可有极大提高。基于b型流感嗜血杆菌(Hib)和c型脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)的糖联合疫苗(例如：ProHiBit，MenC)已经证实可成功控制侵入性Hib和脑膜炎球菌病。

通常的做法是将保守性内核LPS分子以适当的方式与适当的载体分子联合，以便在对宿主进行免疫接种后诱发期望的免疫应答。

免疫原性载体蛋白优选地选自破伤风毒素/类毒素、白喉毒素/类毒素(CRM197)、去毒的绿脓杆菌(P.aeruginosa)毒素A、霍乱毒素/类毒素、百日咳毒素/类毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)外毒素/类毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、轮状病毒VP 7蛋白、呼吸道合胞体病毒F和G蛋白或者其他适当的载体。

佐剂优选地选自弗氏佐剂、明矾和Ribi，或者其他任何制药上可接受的佐剂。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种诱导或增强动物、鱼类或鸟类针对细菌性病原体的免疫力的方法，包括给予保守性内核LPS分子。在一些情况下，所述细菌性病原体为曼氏杆菌(Mannheimia)、放线杆菌(Actinobacillus)或者巴氏杆菌(Pasteurella)。在一些实例中，所述细菌性病原体为感兴趣的兽医中的生物体。给药可通过任何适当的途径进行，包括注射、施用于粘膜、经皮施用、口服(优选适当地包衣)等等。在一些实例中，内核LPS分子与适当的载体分子连接或结合。在一些实例中，还使用适当的佐剂。在一些实例中，内核LPS与抗菌药或其他免疫激发物共同给药。在一些实例中，保守性内核LPS分子是结构I的内核LPS。在一些实例中，保守性内核LPS分子是结构II的内核LPS，但没有本文所定义的一个或两个R和R¹。在一些实例中，保守性内核LPS为至少下述一种：

                                  Q          P

                                  6          4

a)Hep-(1-6)-β-Glc-(1-4)-L，D-α-Hep-1-5-α-Kdo

                                  3

                                  X

                                  Q

                                  6

b)Hep-(1-6)-β-Glc-(1-4)-L，D-α-Hep

                                  3

                                  X

                     Q         P

                     6         4

c)Glc-(1-4)-L，D-α-Hep-1-5-α-Kdo

                     3

                     X

                     Q

                     6

d)Glc-(1-4)-L，D-α-Hep

                     3

                     X

d)Hep-(1-6)-β-Glc-(1，4)-L，D-α-Hep

                                   3

                                   X

                                              P

                                              4

f)Hep-(1-6)-β-Glc-(1，4)-L，D-α-Hep-1-5-α-Kdo

                                   3

                                   X

其中：

Q是：

X是：

P是磷酸酯。

在一些实例中，保守性内核LPS是上述的一个或多个分子a-f或者所公开的通常结构(具有或者没有R和R¹)之一的变异体，其中一个或多个末端糖是以异构体或者经过修饰以维持其特定的异构体的形式出现。

在本发明的一个实施方案中，提供了上述的抗原性LPS来源的寡糖，该寡糖没有与其他寡糖连接的共价键。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种制备疫苗的方法，包括将保守性内核LPS分子或者其部分和/或变异体与免疫原性载体蛋白相连。在一些实例中，可将佐剂与LPS分子-载体蛋白一起提供。

附图说明

图1显示来自溶血性曼氏杆菌血清型A1 LPS的核心寡糖组分在D₂O(300 K，pH 3)中600MHz的质子NMR光谱。HOD共振在4.756ppm。端基异构体区4.4ppm以上的共振与Kdo亚甲基共振一起标注。标注为A1的确定的结构以及残基的命名也为公知。由于主链寡糖的部分截短而导致的异质性在连接位点以虚箭头标出。在文字中，由于异质性而导致的f的较小组分标示以f’。Hep_I、Hep_II和Hep_III是D-D-庚糖。其他残基具有D-构型。

图2显示A1的2D NMR实验，显示端基异构体区的HMQC光谱(a)，以及端基异构体区和环区的COSY(b)和NOESY(c)光谱。箭头指示观察到的位于k5附近的b2共振的位置。

图3显示从A1的异核¹H-¹³C 2D NMR光谱中选出的图。(a)在环区的HMQC光谱中，在可能的地方标出了一些归属。(b)在HMQC-TOSCY光谱中，标出了C7-H7s-C6-H6、C4-H4-C5-H5 TOCSY的相关性以及b2的相关性。(c)在HMBC光谱中，显示了端基异构体质子共振的H1-C1-01-Cx糖苷间相关性以及残基内相关性。

图4显示了识别A1中非庚糖残基的1D选择实验。(a)1D TOCSY(a1，180ms)；(b)1D TOCSY(h1，180ms)；(c)1D TOCSY(i1 k4，180ms)；(d)1D NOESY-TOCSY(i1 k4，400ms；k6 180ms)；(e)1D NOESY-TOCSY(del，400ms；g3 k7，180ms)；(f)1D TOCSY(c1，180ms)；(g)1D TOCSY j1，180ms)；(h)1D TOCSY-NOESY(j1，180ms；j4，400ms)。由于异质性导致的f和h的微量组分分别表示为f’和h’。可用时，第一选择步骤的共振以下划线标出，第二选择步骤的共振以双下划线标出。所选的端基异构体区的共振在光谱左侧标出。

图5显示检测A1中偶极相互作用的1D选择实验。(a)-(f)分别为b1、c1、de1、f1、g1和i1/k4的200ms混合时间的端基异构体区共振的1D NOESY光谱，(g)为j1的1D ROESY(f1，500ms)。所选的端基异构体区共振在光谱的左侧标出。

图6显示庚糖单糖的质子光谱。D₂O、300K条件下在600MHz的提高分辨率的D-L-庚糖光谱(a)，及其α(b)和β形式(c)的增强光谱。D₂O、300K条件下在600MHz的提高分辨率的D-D-庚糖光谱(d)，及其α(e)和β形式(f)的自旋模拟光谱。端基异构体和H5-β共振未知。注意到H-3、H-4共振的强耦合和H-5共振的虚拟耦合在(b)中可正确地重现。

图7显示识别A1中庚糖残基的1D选择实验。(a)1D TOCSY-TOCSY(b1，75ms；b2，75ms)以检测b3、b4和b5；(b)1D TOCSY-NOESY(b2，150ms；b5，400ms)以检测b5-b6和b5-b3 NOE。还要注意由于b(1-3)d键引起的强b5-d2 NOE；(c)1d TOCSY-TOCSY(de1，75ms；e2，75ms)以检测e3、e4和e5；(d)1D TOCSY-TOCSY(de1，75ms；d2，75ms)以检测d3、d4和d5；(e)1d TOCSY-TOCSY(g1，90ms；g2，150ms)以检测g3到g5；(f)1DTOCSY-NOESY(g2，150ms；g5，400ms)显示根据g(1-6)I键的g5-g6和g5-g3 NOE以及g5-i6 NOE；(g)1D NOESY-TOCSY(f1，400ms；g6，180ms)以检测根据f(1-6)g键的来自f1-g6糖苷间NOE的g7共振；(h)1DTOCSY-TOCSY(f1，90ms；f2，150ms)以检测直到H-6的f和f’共振。注意f5和f’5的清晰的多重峰图谱；(i)1D TOCSY(f6，40ms)以检测只是由于较短的自旋锁定时间而导致的f7共振。可用时，第一选择步骤的共振以下划线标出，第二选择步骤的共振以双下划线标出。所选的端基异构体区共振在光谱左侧标出。

图8显示对A1的内核庚糖进行MMC计算所得的最小能量的构象异构体的分子模型。氧绘成较大的球，并且去掉了羟基质子。有关的质子被标出。注意观察到了e-b分支和g-i分支相紧邻，以及残基e的外环链和残基b的端基异构体质子相紧邻与远程NOE相一致。同时注意到L-D-庚糖(残基d、b、e)和D-D-庚糖(残基g)之间外环链方向的不同。

图9显示通过对A1的内核庚糖进行MMC计算得出的质子间距离与宏观运动(macro move)的变化，其中(a)-(g)分别对应b1-e5、b1-e7、e1-i4、e1-g2、g1-b2、g1-b3。质子间距离出现在2-4范围内与所观察到的远程b-e、e-i和e-g NOE相一致。

图10显示使用脂质A构建的溶血性曼氏杆菌LPS的分子模型，其中所述脂质A具有能报道流感嗜血杆菌LPS的脂肪酰取代型式。脂质A部分和Kdo标成灰色，庚糖标成红色或紫色，葡萄糖标成绿色，半乳糖标成蓝色。PO₄基因是黄色。已经去掉了羟基质子。

图11.Ap血清型5a核心OS的阴离子电喷射质谱图。

图12.Ap血清型a)5a；b)5b；c)2；d)1的核心OS的1H-NMR光谱的端基异构体区。该光谱在pH 7.0的D2O中25℃下记录。

图13.Ap血清型5残基a)Hep I；b)Hep II；c)Hep III；d)HepIV；e)Hep V；f)Glc II；g)Glc I；h)Gal I的核心OS的选择性1D-TOCSYNMR光谱的环区。字母代表的各残基如实施例2的表2中所示。该光谱在pH 7.0的D2O中25℃下记录，庚糖残基的混合时间是150ms，己糖残基的混合时间是90ms。

图14.Ap血清型5a残基a)Hep III；b)Hep II；c)Glc I；d)GlcII；e)Hep IV；f)Hep V的核心OS的选择性1D-NOESY NMR光谱的环区。字母代表的各残基如实施例2的表2中所示。该光谱在pH 7.0的D₂O中25℃下记录，混合时间是400ms。

图15.确定Ap血清型5a的核心OS的O-链Gal I残基的位置。a)GalI的端基异构体¹H-共振的1D-NOESY NMR光谱；b)NOESY步骤中Gal I残基的端基异构体¹H-共振和TOCSY步骤中Hep III残基的H-7¹H-共振的1D-NOESY-TOCSY光谱；c)TOCSY步骤中Hep III残基的端基异构体¹H-共振和NOESY步骤中Hep III残基的H-4/H-5¹H-共振的1D-TOCSY-NOESY光谱。d)¹³C-¹H-HMBC NMR光谱的区域，显示Gal I和Glc I的端基异构体¹H-共振的HMBC。e)¹³C-¹H-HSQC NMR光谱的区域，显示Hep III的H-7¹H-共振、Hep V的H-2¹H-共振和Hep II的H-3¹H-共振的¹³C交叠峰。该光谱在pH 7.0的D₂O中25℃下记录。

图16.Ap血清型1的核心OS的阳离子毛细管电泳-电喷射质谱图。产物离子谱来自m/z930²⁺。

图17.识别Ap血清型1的核心OS的开链N-乙酰半乳糖胺残基。a)Ap血清型1的核心OS的2D-¹³C-¹H-HSQC NMR光谱的环区。b)Ap血清型1的核心OS的¹H-NMR光谱的环区。c)GalNAc残基的H-1¹H-共振的1-D NOESY光谱。d)GalNAc残基的H-4¹H-共振的1-D NOESY光谱。e)GalNAc残基的H-2¹H-共振的1-D NOESY光谱。f)HexNAc残基的H-4¹H-共振的1-D NOESY光谱。该光谱在pH 7.0的D₂O中25℃下记录。识别的共振如标注所示(i，GalNAc；j，Gal II)。

图18.Ap血清型1、2、5a和5b的核心寡糖的一个实施方案的结构示意图。对于血清型1；R是α-GaloNAc-(1-4，6)-β-Gal II-(1-3)-β-GalI，R’是H，其中o代表开链构型。对于血清型2；R是β-Glc III，R’是D-α-D-Hep V。对于血清型5a和5b；R是H，R’是D-α-D-Hep V。

图19.多杀性巴氏杆菌菌株Pm70核心OS的阴离子电喷射质谱图。

图20.多杀性巴氏杆菌菌株Pm70核心OSm/z 1246.5²⁺的MS/MS的阳离子毛细管电泳-电喷射质谱图。

图21.多杀性巴氏杆菌菌株Pm70核心OSm/z 316⁺的先驱离子扫描的阳离子毛细管电泳-电喷射质谱图。

图22.多杀性巴氏杆菌菌株Pm70的完全脱酰LPS的¹H-NMR光谱的端基异构体区。该光谱在pH 7.0的D₂O中25℃下记录。残基如实施例3表2所示标注。

图23.多杀性巴氏杆菌菌株Pm70核心OS的TOCSY光谱的端基异构体区的一部分。该光谱在D₂O中25℃下记录。

图24.多杀性巴氏杆菌菌株Pm70核心OS的NOESY光谱的端基异构体区的一部分。该光谱在D₂O中25℃下记录。

图25.多杀性巴氏杆菌菌株Pm70核心OS的¹H-¹³C-HMBC NMR光谱的端基异构体区。嵌入物(inset)是显示N-乙酰-氨基糖的诊断信号的光谱区。该光谱在pH 7.0的D₂O中25℃下记录。

图26.多杀性巴氏杆菌菌株Pm70核心寡糖的结构，显示推测的糖基转移酶。

图27.Pm菌株VP161的LPS-OH的阴离子毛细管电泳-电喷射质谱图。a)m/z 992^3-的产物离子光谱，b)m/z 999^3-的产物离子光谱，c)m/z 1040^3-的产物离子光谱。

图28.Pm菌株VP161的核心OS的阳离子毛细管电泳-电喷射质谱图。a)m/z 903²⁺的产物离子光谱，b)m/z 984²⁺的产物离子光谱，c)利用高口压(oriffice voltage)的m/z 4242⁺的产物离子光谱。

图29.Pm菌株VP161核心OS的2D-NOESY NMR光谱区域。字母代表的各残基如实施例4的表2中所示。该光谱在pH 7.0的D₂O中25℃下记录，混合时间为400ms。

图30.Pm菌株VP161核心OS的2D-¹³C-¹H-HMBC NMR光谱区域，显示端基异构体¹H-共振(小写字母)和环¹³C-共振(大写字母)的相关性。该光谱在pH 7.0的D₂O中25℃下记录。

图31.Pm菌株VP161核心OS的2D-³¹P-¹H-HSQC-TOCSY NMR光谱区域，显示标以g-1到g-4和h-1到h-4的半乳糖残基和胆碱共振的³¹P-共振(X-轴)和¹H-共振(Y-轴)的相关性。该光谱在pH 7.0的D₂O中25℃下记录。

图32.Pm菌株VP161的完全脱酰LPS的¹H-NMR光谱。a)含一个Kdo残基的糖型；b)含两个Kdo残基的糖型。该光谱在pH 7.0的D₂O中25℃下记录。字母代表的各残基如实施例4表2所示。*Gal I(g)和Gal II(h)的H-4质子共振的低区移位是由于KOH处理过程中PCho残基的水解和迁移造成的。

图33.Pm菌株X73核心OS的阳离子毛细管电泳-电喷射质谱图。a)m/z 1108²⁺的产物离子光谱，b)利用高口压的m/z 451.5⁺的产物离子光谱。

图34.Pm菌株X73核心OS的2D-³¹p-¹H-HMQC-TOCSY NMR光谱区域，显示PEtn和半乳糖残基之间³¹P-¹H耦合当混合时间优化为10 Hz时³¹P-共振(X-轴)和¹H-共振之间的相关性。该光谱在pH 7.0的D₂O中25℃下记录。

图35.Pm菌株X73核心OS的2D-¹³C-¹H-HSQC-TOCSY NMR光谱区域，显示¹³C-共振(Y-轴)和¹H-共振之间的相关性，表明半乳糖残基的C-5、C-6、H-5和H-6共振的相关性。该光谱在pH 7.0的D₂O中25℃下记录。

图36.通过对全细胞裂解物进行SDS-PAGE和银染色，分析多杀性巴氏杆菌的LPS。(A)多杀性巴氏杆菌LPS图样的比较：野生型VP161(泳道1)；庚糖基转移酶突变体AL251(泳道2)；对照菌株AL438(含有载体质粒pAL99的AL251)(泳道3)以及互补的突变株AL298(泳道4)。

(B)多杀性巴氏杆菌LPS图样的比较：糖基转移酶突变体AL251(泳道1)；野生型VP161(泳道2)以及从AL251接种的三只不同的鸡中分离的多杀性巴氏杆菌野生型回复体(泳道3、4和5)。

图37.多杀性巴氏杆菌核心OS的阴离子毛细管电泳-电喷射质谱图。(A)亲株VP161核心OS的双电荷区域；(B)突变株AL251核心OS的单电荷区域。

图38.来自(A)多杀性巴氏杆菌亲株VP161和(B)多杀性巴氏杆菌突变株AL251的LPS核心OS的¹H-NMR光谱区域。该光谱在25℃下记录，并以内丙酮在2.225ppm下作为参考基准。

图39.多杀性巴氏杆菌VP 161核心OS的NOESY光谱区域。NOE连接性如图所示。嵌入物；VP 161内核OS结构。该光谱在25℃下记录，并以内丙酮在2.225ppm下作为参考基准。

图40.来自(A)亲株VP161和(B)突变株AL251的多杀性巴氏杆菌内核LPS的推测的结构，其中R是Glc上的寡糖链延伸。

图41.a)溶血性曼氏杆菌菌株A1，b)胸膜肺炎放线杆菌血清型1的核心寡糖的结构示意图。表示出外核修饰的第一阶段中起作用的糖基转移酶。

图42.a)溶血性曼氏杆菌突变株losB的O-脱酰LPS，和b)使用含losB基因的pNF 2176AAlosB反向互补的溶血性曼氏杆菌突变株losB的O-脱酰LPS的阴离子毛细管电泳-电喷射电离质谱图。

图43.野生型溶血性曼氏杆菌菌株A1和突变株losB的完全脱酰LPS的2D-TOCSY NMR光谱区域。各残基的表示如图所示，并将losB突变株缺少的外核残基圈出。该光谱在pH 7.0的D2O中25℃下记录，混合时间为400ms。

图44.小鼠#1-5的D42多克隆血清的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh losB(▲)和wt(■)的纯化的LPS。小鼠标号如图所示。所有血清稀释液如图所示。

图45.九种内核LPS mAb的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株MhlosB和wt，App血清型1和5a以及Pm菌株VP161和X73的LPS，以及Mh和Pm菌株的LPS-OH。mAb标号和稀释液如图所示。

图46.小鼠#1、小鼠#2+3、小鼠#4和小鼠#5的D42多克隆血清的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh losB和wt、App血清型1和5a以及Pm菌株VP 161和X73的LPS。小鼠标号如图所示。所有血清以1∶50的稀释度使用。

图47.小鼠#5的D152多克隆血清的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh losB和wt、App血清型1和5a以及Pm菌株VP 161和X73的LPS。稀释度如图所示。

图48.两种代表性内核LPS mAb的废上清液(spent supernatant)的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh losB和wt、Ap血清型1和5a以及Pm菌株VP 161和X73的LPS。MAb标号和稀释度如图所示。

图49.使用Mh losBKOH处理的LPS的阴离子毛细管电泳-电喷射质谱图。

图50.MhlosB-HAS结合物的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。在12.5％SDS-PAGE凝胶上进行电泳，并用稀释度为1∶10⁶的糖特异性mAb G8进行印迹和筛选。

图51.对a)HSA；b)HSA-MhlosB糖结合物的CE-ES-MS分析。

图52.已接种小鼠#V1-V5和对照小鼠C6、C8和C9的D23多克隆血清的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh losB的LPS，该实验用来筛选IgG应答(▲)和IgM应答(■)。小鼠标号如图所示。所有血清的稀释度如图所示。

图53.已接种小鼠#V1-V5和对照小鼠C6、C8和C9的D45多克隆血清的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh losB的LPS，该实验用来筛选IgG应答(▲)和IgM应答(■)。小鼠标号如图所示。所有血清的稀释度如图所示。

图54.多克隆血清V2(1∶25 diln)的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh losB和wt、Ap血清型1和5a以及Pm菌株VP161和X73的LPS。

图55.多克隆血清V2(1∶25 diln)的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh losB和wt、Ap血清型1和5a以及Pm菌株VP161和X73的全细胞。

图56.多克隆血清Mh#1(1∶100 diln)的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh losB和wt、Ap血清型1和5a以及Pm菌株VP161和X73的全细胞。

图57.多克隆血清Mh#1(1∶100 diln)的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh losB和wt、Ap血清型1和5a以及Pm菌株VP161和X73的LPS。

图58.来自a)mAb G3和b)mAb G8的腹水的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh losB和wt的LPS。

图59.来自a)mAb G3和b)mAb G8的腹水的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh losB和wt；Ap血清型1和5a；Pm菌株VP161、X73和Pm70的全细胞。

图60.来自a)mAb 3-5和b)mAb 3-16的腹水的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh wt和Pm菌株VP161的LPS。

图61.来自a)mAb 3-5和b)mAb 3-16的腹水的ELISA(OD₄₀₅)实验的结果，该实验针对菌株Mh wt和losB；Ap血清型1和Pm菌株VP161和X73以及脑膜炎双球菌菌株L2 galE的全细胞。

图62.使用来自mAb G3和相应的补体缺陷对照的免疫血清稀释液进行的血清杀菌试验；其中存活百分率＝[试验的平均#CFU T30/只有Mh的平均#CFU T30]×100％。

图63.使用来自mAb G8和相应的补体缺陷对照的免疫血清稀释液进行的血清杀菌试验；其中存活百分率＝[试验的平均#CFU T30/只有Mh的平均#CFU T30]×100％。

图64.使用来自Mh losB全细胞免疫的小鼠(Mh#1 D140)和相应的补体缺陷对照的多克隆血清稀释液进行的血清杀菌试验；其中存活百分率＝[试验的平均#CFU T30/只有Mh的平均#CFU T30]×100％。

图65.对a)mAb G3和b)mAbG8腹水进行蛋白A柱纯化，对上柱前后的腹水针对Mh wt菌株的LPS进行ELISA(OD₄₀₅)检测。

图66.接种后3天(dpi 3)杀死的B组小鼠的肺，显示在中等大小的支气管管腔中存在中等数量的嗜中性粒细胞。

图67.接种后3天杀死的C组小鼠的肺，显示可分辨出支气管肺炎，并在某些区域存在少量的淋巴样细胞。

具体实施方式

实施例1

本实施例形成了Can.J.Chem.80，1715(2002)中出版物的基础。研究溶血性曼氏杆菌血清型A1。对溶血性曼氏杆菌血清型A1的LPS的分析表明了Hex₃Hep₅Kdo为主要的核心寡糖组分。这是通过以下方法测定的：对LPS样品进行弱酸水解(1％HOAc，100℃，3h)，对获得的寡糖组分进行1D 1H NMR和FAB-MS分析。对核心寡糖的糖醇乙酸酯和2-丁基苷衍生物进行GLC-MS分析表明，在核心寡糖的主要成分中含有D-葡萄糖、D-半乳糖、L-D-庚糖和DD-庚糖，其摩尔比为2∶1∶3∶2。从甲基化分析中发现D-Gal残基为末端非还原性部分，并且在具有Hex₂Hep₅Kdo组成的核心寡糖组分的少数成分中缺失。通过比色分析确定了Kdo存在于LPS中。

溶血性曼氏杆菌LPS先使用无水肼再使用强碱处理，可生成水溶性脱酰LPS寡糖。脱酰LPS样品代表包含核心和脂质A寡糖部分的天然材料的完整的主链寡糖。这通过电喷射电离ESI-MS证实，该实验给出与Hex₃Hep₅Kdo₁HexN₂(H₂PO₃)₃对应的分子离子作为主要的寡糖组分(见实验部分)。

在质子光谱(图1)以及HMQC和COSY光谱(图2)中，观察到10个端基异构体¹H NMR共振和亚甲基质子共振。对端基异构体共振，按其¹H NMR化学位移的降序标以a-j，Kdo的亚甲基质子标以k3_eq和k3_ax。b1和de1和j1端基异构体峰的积分比其他端基异构体共振峰的积分少40％，证实了在该样品中的异质性。在h1附近4.91ppm处出现了低磁场双峰(downfielddoublet)，说明在h1也有一些异质性。

进行了标准的同核和异核2D-NMR分析。从图2的COSY光谱中可确定H-2共振的位置。认识到对于残基b、d、e、f和g来说，J_1，2很小，具有甘露-庚糖的特点，2D-TOCSY不可能用于从H-1经H-2转移磁化。从图3的HMQC光谱中看出，庚糖残基的H-2与其他共振重叠，使得2D-TOCSY难以对这些残基进行分析。2D-NOESY光谱还显示NOE数异常高，特别是对于b1、de1共振。在端基异构体区也有几个共振相互重叠。因此，由于光谱的复杂性和该样品的异质性，使用1D选择方法来提取光谱参数，该光谱参数无法使用标准的2D方法获取，从而能够对结构和构象分析进行解析。HMQCTOCSY和HMBC实验对于进行完全识别，特别是庚糖单元的完全识别也非常重要。使用该方法，就可能对较大的主链寡糖(A1)的¹H和¹³C NMR化学位移进行完全识别(实施例1，表1)。

从以前的研究中已经知道了Kdo-GlcN_II-GlcN_I序列和部分识别，并与此处所做的识别相一致。对残基a和h进行1D-TOCSY使得能够识别共振，测量质子耦合常数(图4a，4b)。磷酸酯基的位置通过以前做的³¹P HMQC实验验证。然后从HMQC、HMQC-TOCSY和HMBC光谱中识别¹³C NMR化学位移。该信息使得可将残基a和h确定为脂质A部分的α-D-GlcN和β-D-GlcN吡喃糖基单元。多数质子、³¹P和¹³C NMR化学位移与先前在相似的结构元件中报道的类似。在h1的1D-TOCSY中，3.62ppm处的h’5峰是由于Kdo-(2-6)-β-D-GlcN_II糖苷键的水解导致的。在溶液中几个月后，该键完全水解，分别在3.82和3.92ppm处出现h’6和h’6。还发现3.91ppm处清晰的端基异构体信号是由该二糖的h’1导致的。

对于Kdo，H-4和H-5共振从选择激发H-3_eq或H-3_ax的1D-TOCSY实验中识别。由于在C-4处有一个磷酸酯基，H-4共振向低磁场区位移，这通过³¹P HMQC验证。较小的J_5，6＜1Hz阻止了TOCSY经H-5转移(图4c)。然而，在图2c的k4和k6之间观察到强NOE，这与Kdo的X射线结构一致。使用1D NOESY-TOCSY(k4，k6)完成识别(图4d)。如后所示，对于HepI-(1-5)-Kdo键，还观察到d1-k7 NOE，这是Kdo在C-5处被取代的特点。使用该NOE，从1D-NOESY-TOCSY(de1，k7)中检测到的Kdo共振(图4e)具有与前面实验中所发现的相同的化学位移和相似的多重峰图样，因而证实了Kdo ¹H NMR识别。然后从HMQC光谱中得到Kdo的¹³C NMR识别，并从HMQC-TOCSY光谱中验证。

残基i确定为6-取代的β-D-葡萄糖，记为Glc_I。残基i的端基异构体共振与Kdo的H-4共振重叠。在这两个重叠共振的1D-TOCSY中可以区分出残基i的共振，因为Kdo的J_5，6耦合常数很小(图4c)。可以检测高达H-6的所有共振，并且可以测量这些多重峰的耦合常数。由于其β-D构型，i1-i3和i1-i5 NOE也在NOESY光谱中被观察到(图2和图5f)。然后从HMQC光谱中获得了Glc_I的¹³C NMR识别，并使用HMQC-TOCSY光谱验证。通过与末端葡萄糖的化学位移相比，对于C-6共振观察到3.7ppm的苷化低磁场区位移，表明它在该位置被取代。对于C-5也观察到-2.2ppm的明显位移。关于C-5-C-6键的旋转异构体分布可从图5f中i1-i5 NOE中所观察到的H-5多重峰确定。很明显，J_5，6和J_5，6’.都有＜2Hz的较小的值，因为H-5多重峰似乎是由10Hz的较大的J_4，5耦合主导的双峰。这表明H-6和H-6.’都与H-5邻位交叉，06-C6-C5-05＝-60°的旋转异构体优选在溶液中。

残基c确定为末端α-D-葡萄糖，记为Glc_II。从c1的1D-TOCSY(图4f)中，可检测到高达H-5的共振，基于测量的质子耦合常数，表明残基c为α-葡萄糖。从HMQC光谱以及与末端葡萄糖模型化合物的化学位移相比，可完成所有的¹H和¹³C NMR识别。

从j1的1D-TOCSY中分辨出末端半乳糖，残基j，记为Gal，并且观察到高达H-4的共振(图4j)。为了通过较小的J_4，5耦合常数并且分辨出H-5，进行了1D-TOCSY-NOESY(j1，j4)(图4h)。从HMQC光谱以及与末端半乳糖模型化合物的化学位移相比，可完成所有的¹H和¹³C NMR识别。

为了归属庚糖残基，合成了模型化合物以获得准确的¹H和¹³C NMR化学位移和J_H，H值。这些对于通过化学位移比较而归属末端庚糖单元来说非常重要。而且，一旦苷化，取代碳的¹³C NMR共振会有显著的低磁场苷化位移。D-D-庚糖和D-L-庚糖的质子光谱示于图6。在溶液中，每种化合物都存在α和β形式。使用1D-TOCSY实验识别它们的¹H NMR光谱。为获得准确的耦合常数和化学位移，进行了质子光谱的自旋模拟。模拟的光谱示于图6。模拟的光谱精确再现了所观察到的光谱，特别是D-α-L-庚糖中H-3-H-的强耦合(图6b)。使用HMQC识别¹³C NMR化学位移。庚糖单糖的NMR数据在实施例1，表2中给出。L-D-庚糖的化学位移与D-L-庚糖相同，因为它们互为对映异构体。

在TOCSY实验中，从A1中残基b、d、e、f和g的较窄的端基异构体共振中可将它们识别为庚糖，这是由于J_1，2耦合较小，并且缺乏磁化从H-1向H-2的转移。A1中所有的庚糖具有α-D构型，因为唯一的来自H-1的残基内NOE是到H-2的(图2)。使用1D-TOCSY-TOCSY(H-1，H-2)来识别所有的庚糖残基。由于1.8Hz的较小的J_1，2值，因而阻碍了磁化从H-1转移至H-2并进一步转移的第一个TOCSY步骤。然而，由于3Hz的较大的j_2，3值，在H-2上的第二步可将磁化进一步转移至更高的自旋上。然而，对于L-D-庚糖，磁化转移停留在H-5，这是由于1.6Hz的较小的J_5，6值。对于D-D-庚糖，磁化转移阻碍较小，这是由于3.2Hz的较大的J_5，6值。然而，松弛效应也可阻碍磁化转移，不能使用缺少H-5上的转移作为L-D-庚糖识别的证据。

残基b确定为2-取代的L-α-D-庚糖，记为Hep_II。1D-TOCSY-TOCSY(b1，b2)辨别出3.64ppm和3.9ppm处的共振(图7a)。3.64ppm处的多重峰图样是H-5共振的指示，而在3.9ppm处的多重峰图样与单糖中观察到的强耦合的H-3和H-4共振相似(图6b)。为了辨别H-6，进行了1D-TOCSYNOESY(b2，b5)(图7b)。在b2的第一个TOCSY步骤中，a6共振也被照射，但第二步只选择b5共振。b2的NOE在b3和b6上，以及在d2上的残基间NOE中也被观察到。一旦b6位置确定后，使用C-7-H-7s-C-6-H-6的HMQC-TOCSY来识别H-7和H-7.’共振(图3b)。然后从HMQC光谱中获得其他共振的识别，并从HMQC-TOCSY和HMBC光谱验证(图3)。将化学位移与L-α-D-庚糖的化学位移相比，表明C-2有9ppm的低磁场位移，C-3有-0.8ppm的高磁场位移，表明在C-2处有取代。C-4到C-7的化学位移在单糖化学位移的0.6ppm之内。

残基e确定为末端L-α-D-庚糖，记为Hep_III。虽然d1和e1共振重叠，但是由于它们的H-2共振不重叠，所以没有关系。1D-TOCSY-TOCSY(de1，e2)辨别出e3、e4和e5自旋(图7c)。在图5a中的b1 NOE中，还观察到e5共振。1D选择实验的高数字分辨率使得能够由观察到它们的多重峰图样而将不同实验中的共振准确匹配。图5a中还观察到b1-e7和b1-e7.’NOE。如后文所示，这些NOE是由b1质子与e5以及e7和e7’质子紧邻所导致。在C-7-H-7s-C-6-H-6的HMQC-TOCSY中可确定H-6共振的位置。¹H和¹³C NMR识别可使用HMQC和HMQCTOCSY完成。残基e的¹H和¹³C NMR化学位移与L-α-D-庚糖相似。

残基d确定为3，4，6-三取代的L-α-D-庚糖，记为HepI。

1D-TOCSY-TOCSY(de1，d2)在4.17ppm处辨别出窄多重峰，在4.01ppm处辨别出较宽的多重峰(图7d)。4.01ppm和4.17ppm处的多重峰(d2)在b1的1D-NOESY中也被观察到(图5a)。4.17ppm处的共振在i1的1D-NOESY中也被观察到(图5f)。在HMQC光谱中，在(δc，δh)(74.9，4.17)，(72.5，4.17)处辨别出两个窄交叉峰，在(75.3，4.01)处辨别出一个宽交叉峰。HMQC-TOCSY相关性在这些交叉峰之间也可观察到。将¹³C NMR化学位移与实施例1，表2中的α-D-庚糖吡喃糖的化学位移相比，可明显看出(74.9，4.17)和(75.3，4.01)处的交叉峰经历了¹³C NMR低磁场苷化位移。由于这三个交叉峰来自d3、d4或d5，只有d5交叉峰不会经历大的苷化位移，因为庚糖上的取代不会发生在C-5处。因此，(72.5，4.17)处的交叉峰被识别为(C-5，H-5)。基于HMBC(d3，d1)和(d3，b1)的相关性，(75.3，4.01)处的交叉峰被识别为(C-3，H-3)。因此(74.9，4.01)处的交叉峰被识别为(d4，d1)，与所观察到的HMBC(d4，i1)相关性和(i1，d4)NOE相一致(图3和图5f)。从i1的1D-NOESY可识别d6共振，这是因为只有残基d是L-D-庚糖时，对于GlcI-(1-4)-HepI键，也可以预期观察到对H-6的强NOE。d6共振在c1的1D-NOESY中也可观察到(图5b)。从HMQCTOCSY(C-7，H-6)交叉峰(图3)和1DNOESY-TOCSY(i1，d6)(未显示)，确定H-7和H-7.’共振的位置。将化学位移与L-α-D-庚糖的化学位移相比，表明C-3、C-4和C-6分别有3.9、7.9和11.6ppm的低磁场苷化位移。

如下所示，由于分支庚糖的异质性(图1)，应该存在4，6-二取代的L-α-D-庚糖(d’)。从端基异构体区的HMQC和COSY光谱中，由于与其他共振重叠，不能观察到H-1或H-2的单独的信号。据推测，d’1的质子化学位移与d1的相同，d’2的化学位移与e2的相似。

残基g确定为6-取代的D-α-D-庚糖，记为Hep_IV。1D-TOCSY-TOCSY(g1，g2)识别出g3、g4和g5自旋(图7e)。3.94处的多重峰图样是H-5共振的标志。为了辨别H-6，获得了1D-TOCSY-NOESY(g2，g5)(图7f)。来自g2的NOE在g3和g6上，以及在i6上推测的残基间NOE上被观察到。一旦确定g6的位置，就可使用C-7-H-7s-C-6-H-6的HMQC-TOCSY(图3b)和1D-NOESY-TOCSY(f1，g6)(图7g)来识别H-7和H-7.’共振。然后，对其他共振的识别可从HMQC光谱获得，并使用HMQC-TOCSY光谱验证(图3)。在1D-NOESY(f1)中，观察到g6和g5共振(图5d)。从分子模型研究中可得，只有当残基g是D-D-庚糖时NOE f1-g5 NOE才有可能(见下文)。将化学位移与D-α-D-庚糖的化学位移相比，表明C-6具有4.3ppm的低磁场位移。

残基f确定为7-取代的D-α-D-庚糖，记为HepV。1D-TOCSY-TOCSY(f1，f2)识别出高达f6的自旋，表明残基f为D-D-庚糖。f5多重峰图样相当清晰。从f6开始的1D-TOCSY中辨别出f7和f7’共振。然后，从HMQC光谱中获得了¹³C NMR识别，并使用HMQCTOCSY光谱验证。将化学位移与α-D-D-庚糖的化学位移相比，表明C-7具有8.8ppm的低磁场位移。只检测到末端D-α-D-庚糖(记为f’)，这是由于在该键位置的异质性所导致的。如在1D-TOCSY-TOCSY(f1，f2)中所示，可检测到f’5和f’6共振，以及HMQC和HMQC-TOCSY光谱中的交叉峰，该交叉峰对应于末端D-α-D-庚糖的交叉峰，后者又与实施例1，表2中的D-α-D-庚糖的交叉峰相似。

从图5所示的端基异构体共振的1D-NOESY光谱以及端基异构体质子共振的HMBC光谱(图3c)，可建立核心寡糖的序列。残基间NOE也在图7b和7f所示的1D-TOCSY-NOESY实验中观察到。结果列于实施例1，表3中，结构显示于图1中。从端基异构体共振的整合和新共振随时间的出现，可确定存在异质性的键位置。k(2-6)h和b(1-3)d键在pH为3的溶液中经历数月可水解，而j(1-7)f键是稳定的。

观察到异常多的远程NOE，跨越多达五个连续的残基。对于α-D糖，预期H-1-H-2残基内NOE。对于β-D-糖，预期H-1-H-3和H-1-H-5残基内NOE。对于(1-x)键，预期H-1-C-1-O-1-C-x-H-x糖苷间NOE。还可出现在H-x±1和H-x±2上的两个键接的糖之间的残基间端基异构体NOE。其他不靠近糖苷键的残基间NOE被认为是远程NOE，如实施例1，表3所列。

为了解释大量的远程NOE，使用Metropolis Monte Carlo(MMC)方法进行构象分析，以改变糖苷键角度，对分子的多重构象进行取样。使用该方法，对于在还原性末端具有Kdo的内核寡糖来说，发现所有观察到的远程NOE可解释为e-b分支与g-i分支的紧邻。这些远程NOE可能是由于Hep_I上三个分支点带来的内核残基的限制导致的。

通过计算获得的最小能量构象异构体示于图8。从这些坐标测得的各种质子间距离在实施例1，表3中给出。如所观察到的那样，多数NOE的存在可解释为较短的质子间距离。g1-b2和g1-b3的远程NOE与图8所绘分子模型中获得的距离不一致。尽管有(3，4，6)-Hep_I取代模式的限制，但是糖苷键也有柔性，这一点必须考虑。如图9所示，对于g1-b2和g1-b3距离，选取了与观察到的NOE相一致的具有短质子间距离的多种构象。相同的情况可应用于所有其他远程和残基间NOE。g1-b2和g1-b3和e1-i4的远程NOE跨越四个残基，具有约三个糖苷(φ，ψ)角总共6df的移动性。e1-g2和e1-g3之间跨越五个残基(e-b-d-i-g)的远程NOE变化程度更大，这是由于具有8df的糖苷角，还没有考虑g(1-6)i键中的C-5-C-6键可能的柔性。b1-e5、b1-e7和b1-e7.’取决于e(1-2)b糖苷键的移动性和残基e的C-6-C-7的旋转。在所有情况下，具有短质子间距离的多重构象的出现与所观察到的残基间和远程NOE是一致的。

本研究中已经证实，溶血性曼氏杆菌A1 LPS分子的脂质A区含有双-4，4’-磷酸化β-1，6连接的D-葡糖胺二糖部分。与该二糖相连的脂肪酰基的性质和取代型式未见报道。完全酰化的LPS分子组成了细菌膜外层的多数小叶，在保持膜完整性方面起重要作用。该分子的单糖部分通常向外延伸，离开细菌膜所确定的平面。LPS寡糖部分在毒力方面起重要作用，并参与诱导宿主免疫应答。为了获得该LPS分子的核心寡糖和膜锚定的脂质A区的相对大小和方向的直观印象，使用在相关生物即流感嗜血杆菌中发现的脂质A脂肪酸取代型式构建了分子模型。该模型示于图10中。据报道，流感嗜血杆菌脂质A具有六个脂肪酰基，其中还原性葡糖胺残基的酰胺基(C-2)和C-3羟基被3-羟基十四烷酸酰化，而非还原性残基的C-2.’酰胺和C-3.’羟基被3-十四酰氧十四烷酸酰化。如图10所示，由于内核提供了相当刚性的结构，单糖部分从确定细菌膜平面的脂质A部分伸出。末端残基特别是末端Gal残基可观察到更大的移动性。在图2的NOESY光谱中，没有观察到与该残基的移动性增加相一致的端基异构体共振NOE。

已发现几种LPS的核心结构为高度分支的，这可以导致该内核的清晰的构象。在先前的研究中，发现卡他莫拉菌(Moraxella catharrhalis)的LPS采用了异常的构象，其中可观察到非常罕见的反构象异构体(anticonformer)。对于该LPS分子中高度分支的3，4，6-三取代的D-葡萄糖残基，检测到β-D-Glcp-(1-4)-DGlcp与分支的葡萄糖单元键接的双面角(C-1’-O-1’-C-4-H-4)接近180°。

本研究结果提供了溶血性曼氏杆菌血清型A1的LPS核心寡糖区结构的详细图示。我们在前面已经说明，溶血性曼氏杆菌LPS的寡糖区在小鼠、绵羊和牛中均有免疫原性，并且12种溶血性曼氏杆菌血清型中的8种(即血清型A1、A5、A6、A7、A8、A12、A14和A16)具有相同的核心寡糖决定簇。血清型A1和A8的核心寡糖显示几乎相同的¹H NMR光谱，证明存在共有的基本结构。从本研究结果可明显看出，由溶血性曼氏杆菌血清型A8产生的O-链缺陷型LPS在核心寡糖中缺少末端Gal单元，该残基可能为O-链附着提供位点。对溶血性曼氏杆菌血清型之间LPS结构差异的理解可提供针对溶血性曼氏杆菌牛巴氏杆菌病(pasturellosis)的疫苗的基础。血清型A1是导致该病的主要微生物，占全球牲畜总死亡数的30％。在疫苗制剂中使用毒力弱的血清型或其抗原可提供有效的疾病治疗手段。

实施例1的实验

从溶血性曼氏杆菌制备LPS

从Veterinary Infectious Diseases Organization(VIDO)，Saskatoon，SK，Canada获得溶血性巴氏杆菌(溶血性曼氏杆菌)血清型A1(NRCC 4212)。从发酵罐培养的细菌培养物中通过热酚溶液法(Severn etal.Carbohydr.Res. 240，277(1993))提取和纯化LPS。

LPS脱酰产生主链寡糖

如先前在Severn et al.J.Bacteriol. 178，1731(1996)中所述，通过修改Holst et al的脱酰方法，制备主链寡糖。在环境温度下使用无水肼处理(20mL，37℃，30min)样品(400mg)，从LSP的脂质A除去酯结合的脂肪酸。向冷却的反应混合物(0℃)中加入丙酮(三倍体积)破坏多余的肼。离心(5000rpm，10min)分离沉淀的O-脱酰LPS产物，用丙酮洗涤，并冻干水分。在KOH水溶液(4M，10mL)中加热O-脱酰样品(200mg)，100℃持续20h，除去N-酰基。将反应混合物冷却(0℃)，使用4MHCl中和，离心(12000×g，30min)除去沉淀的脂肪酸。上清液在具有500分子量截留膜的Amicon浓缩室(concentration cell)(Amicon；YC05)中过滤，并使用去离子水洗涤，直到洗脱液中不含氯离子(使用AgNO₃溶液测量)。将透析材料冻干，得到脱酰LPS(约80mg)。在DEAE A-25上通过阴离子交换色谱纯化寡糖。主链寡糖组分(约50mg)在阳离子ESI-MS中显示为m/z 1124.8的双电荷离子，并作为与Hex₃Hep₅Kdo HexN₂(H₂PO₃)₃(M，2246.9)组合物相对应的主要离子。双电荷离子的MS-MS在m/z500(HexN₂(H₂PO₃)₂)和801(KdoHexN₂(H₂PO₃)₂)处产生特征性片段，它们分别对应于脱酰脂质A和Kdo-P取代单元。

D-甘油-L-甘露-庚糖

在碱性乙醇(alkaline methanol)中使用硝基甲烷缩合D-半乳糖，制备庚糖。将从去离子产物(mp 158℃，产率21％)的水溶液中获得的结晶1-脱氧-1-硝基-D-甘油-L-甘露-庚醇转化为其钠盐。该溶液使用稀硫酸(35℃)处理后，再使用Rexyn 101(H⁺)和Amberlite A4(OH^-)离子交换树脂去离子化，然后冻干生成糖浆形式的庚糖(产率80％)。通过纤维素柱色谱分级产物，以丁-1-醇-水(1∶10 v/v)作为洗脱剂。含庚糖的组分减压浓缩干燥。具有[α]_D-14°(c 0.2，水)的D-甘油-L-甘露-庚糖通过纸色谱法纯化，其在GLC上的还原(NaBH₄)和乙酰化产物具有单峰，保留时间与真正的庚-O-酰基-D-甘油-L-甘露-庚醇相对应，由此确定其纯度。

D-甘油-D-甘露-庚糖

从D-阿卓糖制备庚糖，使用硝基甲烷缩合，生成1-脱氧-1-硝基-D-甘油-D甘露-庚醇(mp 109℃，[α]_D-7.0°(c 1.1，EtOH)，产率27％)，其钠盐水溶液缓慢滴加至保持在0℃并不断搅拌的20％(v/v)硫酸中，转化为D-甘油-D-甘露-庚糖。反应混合物使用饱和Ba(OH)₂中和，过滤，经过Rexyn 101(H⁺)和Duolite A4(OH^-)树脂除去残留的离子物质，浓缩成糖浆(产率92％)。纸色谱显示，庚糖产物中混有阿卓糖和未变化的1-脱氧-1-硝基-D-甘油-D-甘露-庚醇(约2到3％)。该产物通过纤维素柱层析纯化，使用丁-1-醇-水(1∶10 v/v)作为流动相。D-甘油-D-甘露甘露糖具有[α]D+22°(c 2，MeOH)。在GLC上还原(NaBH₄)和乙酰化的样品产生单峰，对于于真正的庚-O-酰基-D-甘油-D-甘露-D庚醇，表明了合成庚糖的身份和纯度。

电喷射质谱

在装有电喷射离子源的VG Quattro三级四极质谱计(Micromass，Manchester，U.K.)上分析样品。主链寡糖溶于含0.5％乙酸的乙腈-水(约1∶2 v/v)中。注入体积为10μL，流速设置为4mL min^-1。电喷射的触点电压(tip voltage)通常为2.7kV，质谱计从m/z 50到2500进行扫描，扫描时间为10s。对于MS-MS实验，使用第一级四极选择先驱离子，在只有RF的四极室中使用氩碰撞活化的碎片离子通过扫描第三级四极进行质谱分析。碰撞能量通常为60ev(参考实验框架)。

核磁共振

使用标准软件，在Bruker AMX 600、AMX 500或者Varian Inova 600光谱仪上生成NMR光谱。所有的测量均在300K和pH 3下进行，包括10mg样品，溶于0.6mL D₂O中。测量在pH 3下进行是为了提高质子光谱的分辨率，如先前的做法(Cox，1996)。

丙酮在2.225ppm用作¹H光谱、在31.07ppm用作¹³C光谱的内标或外标。标准的同核和异核相关的2D技术被用于核心寡糖的常规识别：COSY、TOCSY、NOESY、三级量子同核相关实验、HMQC、HMQC-TOCSY以及HMBC和³¹P HMQC。使用标准的Varian软件进行庚糖单糖的自旋模拟。从用于进行自旋模拟的参数而不是从光谱的峰值列表中获得准确的化学位移和耦合常数。

进行选择性1D-TOCSY、1D-NOESY、1D-TOCSY-TOCSY、1D-TOCSY-NOESY和1D-NOESY-TOCSY实验来进行完全的残基识别以及确定f残基间1H-1H核Overhauser增强。用于描述1D选择序列的应用的术语是1D EXP(自旋，混合时间)和1D EXP1-EPX2(自旋1，混合时间；自旋2，混合时间)，其中EXP、EXP1和EXP2代表TOCSY或NOESY。另外，在图中，所选共振用下划线标出。标有双下划线的共振表示该共振被选为第二选择步骤。如图1所示，所有的残基标以字母，自旋标以原子数，所以a1是指残基a的H-1共振。

在AMX光谱仪上，通过半高斯脉冲实现选择激发。用于TOCSY的混合时间取决于自旋***。通常30到180ms范围的混合时间(自旋锁定时间)可用于识别该自旋***。1D-NOESY的混合时间取决于糖苷键的分子和内部运动的相关时间。NOESY混合时间在150到400ms范围内。为检测末端Gal残基的残基间NOE，以500ms的混合时间进行1D-ROESY实验。对于双重选择实验，选择脉冲要尽可能短，以避免由于松弛效应而导致的信号强度损失。每部分一次优化一个。1D-TOCSY可进行几分钟左右。1D-NOESY花费几分钟到几小时，这取决于NOE的大小。某些双重选择实验要花费高达12h。1D-TOCSYTOCSY和1D-TOCSY-NOESY最有效。由于样品随时间而降解，有些实验还在Inova 600光谱仪上进行以利用脉冲场梯度。

分子模型

使用先前所述的Metropolis Monte Carlo方法(Peters et al.Carbohydr.Res. 238，49(1993))进行构象分析。使用PFOS电势。使用来自量子化学程序***换(Quantum Chemistry Program Exchange，QCPE)的MM3获得单糖的最小化坐标。使用每种二糖的最小能量构象作为起始构象。从还原端的Kdo开始，对各种寡糖进行计算，一直到完整的结构。对于内核辛糖，使用5×10⁴的宏运动(macro move)，糖苷键的步长为5，温度为1×10³K，导致接收比为0.36。使用最小能量构象异构体生成内核辛糖的分子模型。从每一种宏运动所保存的坐标中提取距离。使用脂质A结构和Kdo键的最小能量构象异构体生成带有脂质A的完整LPS。使用E.Keeler，University of Freiburg，Germany的Schaka197来完成分子图。

表1.溶血性曼氏杆菌(溶血性巴氏杆菌)血清型A1 LPS的核心寡糖组分的NMR化学位移(ppm)

残基	δCδH	C-1 H-1	C-2 H-2	C-3H-3H-3	C-4H-4	C-5H-5	C-6H-6H-6	C-7H-7H-7	C-8H-8H-8
										HepID		100.35.17	71.14.13	75.34.01	74.94.17	72.54.17	81.24.11	63.54.023.89
HepIIB		100.75.57	80.54.26	70.63.89	67.63.90	72.23.64	69.64.05	64.13.703.60
										HepIIIE		102.55.16	71.54.01	71.53.87	67.03.83	72.43.78	70.24.04	64.53.833.68
HepIVG		99.84.95	70.54.08	71.73.81	67.93.78	71.83.94	77.04.14	61.23.913.80
										HepVF		99.05.04	70.83.93	71.53.85	68.13.82	73.73.99	71.74.22	71.64.163.85
HepVf		99.05.04	70.83.93	71.53.85	68.33.77	73.73.97	72.84.05	62.93.793.73
										GlcI1		104.04.64	74.23.51	77.73.45	70.23.64	74.63.54	65.54.063.69
GlcIIC		102.45.22	72.93.58	73.93.83	69.33.58	72.43.95	60.33.963.76
										GalJ		104.34.46	71.73.56	73.53.67	69.53.93	76.03.71	61.83.803.76
GlcNIA		92.65.75	54.83.45	70.23.93	70.53.51	73.44.13	69.74.283.89
										GlcNIIH		99.74.88	56.33.17	72.23.90	75.03.94	74.63.78	63.43.813.64
KdoK			99.7	34.52.372.13	70.84.61	72.74.32	73.23.87	69.93.78	64.23.943.73

说明：在25℃、pH 3和D20中，在600MHz(1H)从HMQC和HMBC数据测量，其中外部丙酮的CH3信号对于1H NMR设置为2.225ppm，对于13C NMR设置为31.07ppm。δC平均误差为±0.2ppm，δH平均误差为±0.02ppm。由于异质性而导致的f的较小组分标为f’。CH2自旋***(H，H’)按化学位移的降序排列。对于Kdo，H-3和H-3’归属为H-3eq和H-3ax。

表2.D-L-庚糖和D-D庚糖单糖的NMR数据

庚糖	δCδHJH，H	C-1H-1J1，2	C-2H-2J2，3	C-3H-3J3，4	C-4H-4J4，5	C-5H-5J5，6	C-6H-6J6，7	C-7H-7J6，7	H-7J7，7
										D-α-L-		95.00a5.1661.8	71.453.9143.1	71.363.83810.0	67.053.8459.7	71.813.7491.6	69.634.0247.3	63.843.6895.5	3.652-11.7
D-β-L-		94.74b4.8661.0	72.023.9273.2	74.093.64910.0	66.693.7889.8	75.433.3291.8	69.533.987.5	63.573.7135.8	3.695-11.7
										D-α-D-		94.86a5.1511.8	71.323.9053.4	71.383.8129.4	68.353.75610.1	73.423.8653.2	72.724.0183.3	62.753.7977.6	3.708-12.0
D-β-D-		94.79b4.8511.1	71.843.9213.3	74.113.6229.5	68.163.6829.9	77.223.4233.3	72.6234.0253.4	62.583.7887.4	3.725-12.0

说明：在25℃的D₂O中，在600MHz(1H)从1H自旋模拟和13C光谱(150MHz)测量，其中丙酮的CH3信号对于1H NMR设置为2.225ppm，对于13C NMR设置为31.07ppm。δC和δH的单位是ppm，δC平均误差为±0.005ppm，δH平均误差为±0.003ppm。JH，H值单位是Hz，平均误差为±0.2Hz。H-7和H-7’按化学位移的降序排列。

^aJ_C1，H1＝171±1Hz

^bJ_C1，H1＝160±1Hz，从未去耦合的¹³C NMR光谱测量。

表3.A1的HMBC和NOE数据，以及与图8所示的核心庚糖的最小能量构象异构体的距离

键	HMBCH-1-C-x	残基内NOE	r()	残基间NOE	r()	远程NOE	r()
								b(1-3)d	b1-d3	b1-b2b5-b3b5-b6	2.62.52.4	b1-d3b1-d4b5-d2k3ax-d5	2.63.72.33.2	b1-e5b1-e7b1-e7b1-i2	3.32.92.62.2
c(1-6)d	c1-d6	c1-c2	2.4	c1-d6	2.0	c1-i1	2.4
								d(1-5)k		d1-d2	2.6	d1-k5d1-k7	2.22.9
e(1-2)b	e1-b2	e1-e2	2.6	e1-b2e1-b1	2.12.8	e1-g2e1-g3e1-i4	4.22.32.0
								f(1-6)ga	f1-g6	f1-f2	2.6	f1-g6f1-g5	2.52.6
g(1-6)i	g1-i6	g1-g2g5-g3g5-g6	2.62.62.5	g1-i6g1-i6g5-i6	2.62.63.0	g1-b2g1-b3	4.24.9
								i(1-4)d	i1-d4	i1-i3i1-i5	2.62.4	i1-d4i1-d6	2.82.1	i1-c1	2.4
j(1-7)fa	j1-f7	j1-j2j1-j3j1-j5	3.12.72.4	j1-f7j1-f7	2.72.5

a对于Gal-(1-7)-HepV-(1-6)-Hep IV序列(j-f-g)中的j和f残基，给出从MMC计算得到的平均距离。

实施例2

本实施例形成了Carbohydr.Res. 339：1973(2004)中出版物的基础。研究胸膜肺炎放线杆菌血清型5a、b、2和1。

对柱分级的LPS进行糖分析表明，葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、N-乙酰-葡糖胺(GlcNAc)、D-甘油-D-甘露-庚糖(DD-Hep)和L-甘油-D-甘露-庚糖(LD-Hep)各自的比例大约为2∶1.5∶1∶2∶3。如在材料和方法中所述，将酸水解产物进行凝胶过滤色谱分离来纯化核心OS，获得富含核心OS和相对不含O-抗原的组分，并进行糖分析，该分析显示；Glc、Gal、DD-Hep和LD-Hep各自比例为2∶1∶2∶3。由于血清型5b的荚膜多糖含有N-乙酰-D-葡糖胺和酮糖残基，我们怀疑LPS有一些荚膜(CPS)掺杂，之所以分级的核心OS样品中没有CPS，是因为CPS中的酮糖键(ketosidic bond)对为获得核心OS而采用的酸水解条件敏感。另外，较少量的半乳糖(唯一的O-抗原残基)表明所检测的组分主要是核心OS，没有明显的O-抗原延伸。

制备LPS-OH并通过凝胶过滤色谱分级。对与含有低比例O-抗原相一致的体积时洗脱的组分，通过CE-ES-MS进行分析(实施例2，表1)。观察到一种简单的质谱，该质谱对应于与组成2Hex、5Hep、Kdo、P、脂质A-OH相一致的2537amu的分子。对双电荷离子m/z 1268进行CE-MS/MS分析(数据未给出)在m/z 951和1584产生两个单电荷峰，证实了O-脱酰脂质A的大小为952amu，核心OS的大小为1584。O-脱酰脂质A种类(952amu)由N-乙酰化(3-OH C 14:0)葡糖胺残基的二糖组成，每个残基被磷酸分子取代。对分级的OS样品的ES-MS和CE-ES-MS分析显示其质量为1505 Da，与组成2Hex、5Hep、Kdo一致(实施例2，表1)(图11)。更晚洗脱的核心OS组分的CE-ES-MS光谱具有1562的质量，比主要糖型高57amu(实施例2，表1)。该质量对应于氨基酸甘氨酸，这最近已经在脑膜炎双球菌和流感嗜血杆菌的LPS中观察到。CE-ES-MS/MS分析将该甘氨酸残基定位于Kdo分子的第二个庚糖残基(Hep II)上(数据未给出)。

在核心OS上进行甲基化分析，以确定该分子的连接型式。仅对对应于核心OS的组分进行分析表明，存在大约等摩尔量的末端Glc、6-取代的Glc、末端DD-Hep、末端LD-Hep、6-取代的DD-Hep、2-取代的LD-Hep和3，4，6-三取代的LD-Hep。对主要含有O-抗原的更早的OS组分进行分析表明，存在6-取代的Gal(O-抗原组分)，证实了O-抗原的连接型式。

为了阐明OS的准确位置和连接型式，对不含O-抗原的收集OS组分进行NMR研究(图12a)。通过COSY和TOCSY实验实现对OS的¹H共振的识别。图13显示从OS中每个残基的端基异构体¹H共振的一系列选择性1D-TOCSY实验。在NMR分析的过程中，很明显Ap 5a OS在结构上与溶血性曼氏杆菌核心OS的结构相关，Ap 5a OS光谱的识别可参考该¹H NMR数据来帮助进行(实施例2，表2)。

在Ap 5a OS的选择光谱中，从庚糖残基(Hep I，(图13a)，Hep II，(图13b)，Hep III，(图13c)，Hep IV(图13d)和Hep V，(图13e))产生的自旋***很容易从5.11(HepI)、5.70(Hep II)、5.17(Hep III)、4.96(Hep IV)和5.03(Hep V)ppm处的端基异构体¹H共振辨别，所述共振与指向甘露-吡喃糖基环***的自旋***的形态相耦合。Hep I和Hep II的端基异构体质子中观察到的异质性(图12a)是由于Kdo残基在酸水解时重排造成的。基于自旋***的形态(图13f)，5.21ppm(Glc II)处的α-端基异构体区中的其他残基确定为吡喃型葡萄糖。该光谱低磁场区(4.45-6.00ppm)的其余端基异构体共振都可归因于β-连接的残基，这是由于它们的端基异构体¹H共振以及，在残基已经解析的情形下，它们较高的J^1.2(约8Hz)耦合常数。从自旋***的形态(图13g)，在4.66ppm(Glc I)处的一个共振被识别为葡糖-构型。从TOCSY实验中的H-4共振的特征性自旋***的形态(图13h)，将低磁场区中的4.49(Gal I)ppm处的剩余共振识别为半乳糖-吡喃糖基残基。该实验还涉及Kdo自旋***，因为4.48ppm处的Kdo H-6¹H共振也被照射，并显示在4.10和4.21ppm分别有H-4和H-5¹H共振。然而，Kdo自旋***难以完全确定，这是因为Kdo残基在核心水解时重排，以及可能由于氘交换而导致的亚甲基H-3质子的强度水平极低。然而，在另一个1-D TOCSY实验中，从1.92ppm的H-3中轴进一步识别该自旋***，显示2.08ppm处的赤道质子和4.10ppm处的H-4质子的¹H共振(数据未给出)。

邻近的糖基残基上的端基异构体和苷元质子之间的残基间¹H-¹H NOE测量可确定OS中糖基残基的序列，并证实和扩展甲基化分析数据。用这种方法确定了Ap 5a OS的连接型式(图14)(实施例2，表2)。因此质子对Hep III H-1和Hep II H-2(图14a)以及Hep II H-1和Hep I H-3(图14b)之间强烈的跨糖苷NOE连接性的出现，确立了三个LD-庚糖残基的序列和附着点。这种连接型式在溶血性曼氏杆菌和流感嗜血杆菌的内核OS中经常遇到。而且，端基异构体质子Hep III H-1和Hep II H-1之间的残基间NOE验证了1，2-键接。从Glc I的H-1检查NOE的连接性表明，该葡萄糖残基与4-位的Hep I连接，这是根据Hep I H-4和Hep I H-6的残基间NOE(图14c)得出的。H-6的残基间NOE的形态对于4-取代的庚糖残基来说经常出现。Glc I的H-1和Glc II的H-1之间出现远程NOE连接性表明，α-构型的葡萄糖残基(Glc II)在6-位取代Hep I，这在溶血性曼氏杆菌OS中已经观察到。检查Glc II的H-1的NOE连接性证实，该葡萄糖残基在6-位与Hep I连接，这是根据Hep I H-6的残基间NOE(图14d)得出的。类似地，对于Glc I，在Glc I和Glc II的端基异构体1H共振之间观察到远程NOE连接性。其他庚糖残基(Hep IV和Hep V)的连接位置按如下方法导出。检查Hep IV的H-1的NOE连接性表明，该庚糖残基在6-位与Glc I连接，这是根据Glc I H-6和H-6’的残基间NOE(图14e)得出的。最后，确定Hep V在6-位取代了Hep IV，这是根据从Hep V H-1到Hep IVH-6的NOE连接性(图14f)得出的。另外，对血清型5a的OS进行NMR分析使得能够辨别O-链半乳糖残基的附着点。只含有一种半乳糖残基的组分用于该目的。端基异构体¹H共振的NOE连接性包括3.68和3.93ppm处的H-3和H-5的内部连接性，以及3.93ppm处的之间连接性(图15a)。然后将选择性1-D实验用于辨别3.93ppm处的质子共振的自旋***。在NOESY步骤中，进行Gal的H-1质子的1D NOESY-TOCSY实验，然后在TOCSY步骤中，在3.93ppm处进行共振的选择激发，证实了3.93ppm处的共振和4.06ppm处的共振的连接性(图15b)。使用150ms的混合时间，在5.16ppm进行Hep III残基的端基异构体质子共振的1-D TOCSY实验显示了在3.82ppm处该自旋***的H-4和H-5质子共振(图13c)。然后在NOESY步骤中该共振被选择性照射，显示出4.06ppm处的Hep III H-6共振，从而证实了Hep III残基的7-位是O-链的附着点(图15c)。从¹³C-¹H HMBC实验获得验证性数据，该实验辨别出4.48ppm处的O-链半乳糖残基的端基异构体¹H共振的交叉峰，该交叉峰与70.3ppm处的¹³C共振相关(图15d)，在¹³C-¹HHSQC实验中该交叉峰被发现与3.93ppm处的质子共振相关(图15e)，在¹³C-¹H HSQC光谱中该交叉峰显示为具有-CH₂-基特征的正峰，证实了庚糖残基的7-位是O-链的附着点。该结论通过在只含有一种半乳糖残基的组分上进行甲基化分析来证实，表明存在7-取代的LD-Hep残基；在对没有O-链的核心OS组分进行甲基化分析时没有观察到这种过甲基化醛醇醋酸酯衍生物。

研究胸膜肺炎放线杆菌血清型5b

对血清型5b的LPS、LPS-OH和OS所做的所有分析都与前面在血清型5a中描述的分析相同或极其相似(实施例2，表1和2；图12b)。

研究胸膜肺炎放线杆菌血清型2

对完整LPS的糖分析表明存在Glc、DD-Hep、LD-Hep、Rha、Gal、GlcNAc和GalNAc，其比例大约为8∶2∶2∶1∶2∶1∶2，与该材料中存在O-抗原和荚膜多糖相一致。对分级的酸水解产物进行糖分析，表明在较早的洗涤组分中存在Glc、Rha、Gal和GalNAc，其比例大约为2∶1∶1∶1，与富含O-抗原的组分一致。缺少O-抗原的较晚的组分显示只存在Glc、DD-Hep和LD-Hep，其比例大约为3∶2∶3，与该核心OS组分中缺少O-抗原一致。

制备LPS-OH并通过凝胶过滤色谱分级。对与含有低比例O-抗原相一致的体积时洗脱的组分，通过CE-ES-MS以阴离子模式进行分析(实施例2，表1)。观察到一种简单的质谱，该质谱对应的分子是2700amu，与组成3Hex、5Hep、Kdo、P、脂质A-OH相一致，还有少量质量小于80amu的第二种分子，其与缺失磷酸酯基相吻合。对三电荷离子m/z 899进行CE-MS/MS分析(数据未给出)在m/z 951产生一个单电荷峰，证实了O-脱酰脂质A的大小为952amu，较大分子的质量为2700amu。对缺少O-抗原的分级的核心OS样品的CE-ES-MS分析显示其质量为1667 Da，与组成3Hex、5Hep、Kdo一致(实施例2，表1)。因而质谱分析表明，血清型2的核心OS与血清型5a和5b的OS相比，多包含一个葡萄糖残基。

对缺少O-抗原的核心OS组分进行甲基化分析，表明存在末端Glc、6-取代的Glc、末端DD-Hep、末端LD-Hep、2-取代的DD-Hep、2-取代的LD-Hep、4，6-二取代的DD-Hep和3，4，6-三取代的LD-Hep，其比例大约为6∶3∶3∶2∶1∶2∶3∶2。血清型2和5b OS的甲基化数据之间的主要差异在于单-6-取代的DD-Hep被4，6-二取代的DD-Hep替换，实验性地证实了内部DD-Hep残基的4-位是附加的葡萄糖残基的附着点。通过甲基化分析辨别的血清型2和5b之间的末端葡萄糖残基的比例，也与在血清型2核心OS中存在附加的末端葡萄糖残基这一结论一致。

¹H-NMR数据(实施例2，表2(图12c))确证了质谱和甲基化分析数据，证实了血清型2的核心OS与血清型5b的相同，但是多辨别出一个末端α-构型的葡萄糖残基(Glc III)。NOE数据可确定Glc III的附着点在Hep IV的4-位，这是根据从4.53ppm处的Glc III的端基异构体质子的¹H共振到3.96ppm处的Hep IV的4位的¹H共振的之间NOE连接性(数据未给出)得出的。对Hep IV的6-位也观察到NOE连接性，这先前在4-取代的庚糖残基中也已经观察到。

研究胸膜肺炎放线杆菌血清型1

对柱分级的LPS进行糖分析显示存在Rha、Glc、Gal、GlcNAc、DD-Hep和LD-Hep，比例大约为1∶3∶1∶0.5∶1∶3。辨别出Rha和GlcNAc表明在该组分中仍然存在一些O-抗原组分。对缺少O-抗原的核心OS组分进行糖分析表明，Glc、Gal、DD-Hep和LD-Hep的比例为2∶1.5∶1∶3。对含有全长O-抗原的较早的组分进行糖分析显示Rha、Glc和GlcNAc的比例大约为2∶1∶1，与已经公开的该血清型O-抗原的结构一致。

制备LPS-OH并通过凝胶过滤色谱分级。对与含有低比例O-抗原相一致的体积时洗脱的组分，通过ES-MS和CE-ES-MS以阴离子模式进行分析(实施例2，表1)。观察到一种简单的质谱，该质谱对应的分子是2874amu，其与组成4Hex、HexNAc、4Hep、Kdo、P、脂质A-OH相一致，还有少量质量大于123amu的第二种分子(与另外存在的磷酸乙醇胺残基一致)和质量小于80amu的第三种分子(与缺失磷酸残基相吻合)。对三电荷离子m/z 957进行CE-MS/MS分析(数据未给出)在m/z 951产生一个单电荷峰，证实了O-脱酰脂质A的大小为952amu，较大分子的质量为2874amu，并且在m/z 959产生一个双电荷峰，对应于核心OS。对缺少O-抗原的几种核心OS组分的ES-MS和CE-ES-MS分析显示其质量为1840 Da，与组成4Hex、HexNAc、4Hep、Kdo一致(实施例2，表1)。对m/z 930的双电荷离子以阳离子模式进行CE-MS/MS分析显示出单电荷离子，这与血清型1核心OS中存在下列残基一致，包括HexNAc m/z 204、Hex-Hex-HexNAc m/z 528、Hep-Hex-Hex-HexNAc m/z 720(图16)。因此，质谱分析表明血清型1核心OS比血清型5a和5b核心OS少含有一个DD-Hep残基，但是多含有两个Hex和一个HexNAc残基。然而，在对缺少O-抗原的核心OS进行糖分析中，缺少HexNAc的证据开始让人费解。

对缺少O-抗原的核心OS组分进行甲基化分析显示存在大约等摩尔量的末端Glc、6-取代的Glc、3-取代的Gal、末端LD-Hep、4，6-二取代的Gal、4-取代的DD-Hep、2-取代的LD-Hep和3，4，6-三取代的LD-Hep。缺少HexNAc的任何证据仍然让人困惑。

因此，质谱、糖和甲基化分析数据与血清型2、5a和5b中所观察到的内核结构一致，¹H NMR数据确证了这些推断(图12d)(实施例2，表2)。¹H NMR数据还使得能够辨别在血清型2、5a和5b的核心OS中不存在的其他的核心OS残基。根据在TOCSY实验中H-4¹H共振的特征性自旋***，在5.18ppm处识别了α-构型半乳糖残基(Gal II)。根据其端基异构体质子的¹H共振和其特征性自旋***的形态，在4.55ppm处识别了β-构型半乳糖残基(Gal I)。根据4.34ppm处H-2质子的¹H共振(与¹³C-¹H HSQC实验中52.6ppm的¹³C化学位移相关(图17a))，在4.88ppm处识别了α-构型N-乙酰己糖胺残基(HexNAc)。¹³C化学位移与氮取代的碳原子一致。然而，很难接近H-2质子上该HexNAc残基的自旋***，H-2质子的化学位移似乎位于相当低的磁场。残基间NOE连接性建立了4.55ppm处Gal I残基的端基异构体质子和3.94ppm处Hep IV的4位的连接型式。类似地，5.18ppm处的Gal II端基异构体质子和3.79ppm处的Gal I残基的3位的NOE连接性建立了该连接。然而，4.88ppm处的HexNAc残基的端基异构体质子和4.25ppm处的Gal II残基的4位，以及4.12和4.01ppm处的该残基的6位之间的残基间NOE连接性表明了HexNAc残基在4位和6位取代了Gal II残基，这与甲基化分析数据一致，但仍然令人困惑(图17c)。甲基化OS的FAB-MS使得对OS的该部分的糖序列有了进一步的了解。所观察到的A型主要糖基氧鎓离子和次要离子(缺少甲醇)如下：464→432(Hex，HexNAc)⁺，668→636(Hex₂，HexNAc)⁺，916→884(Hex₂，HexNAc，Hep)⁺，1120→1088(Hex₃，HexNAc，Hep)⁺，1368(Hex₃，HexNAc，Hep₂)⁺，1572→1540(Hex₄，HexNAc，Hep₂)⁺，以及1865→1833(Hex₃，HexNAc，Hep₄)⁺。该FAB数据与NOE和阳离子CE-ES-MS/MS数据一致，但缺少末端HexNAc残基的证据让人困惑，但是与糖分析和甲基化分析数据一致。缺少HexNAc残基的确切数据使得我们进行更加复杂的NMR研究，以试图辨明推测的HexNAc残基的本质，确定血清型1的核心OS的该区域的连接型式。

由4.88ppm处、混合时间的范围从30到150ms的HexNAc残基的H-1¹H-共振的一系列选择性1D实验显示出4.34ppm处的H-2¹H-共振和识别为4.13ppm处H-3和3.36ppm处H-4的弱信号。为了验证这些推论，完成该HexNAc残基的识别，进行了其他的选择实验。从3.36ppm处的H-4¹H-共振获得1-D TOCSY实验，验证了H-2和H-3识别，分别在3.93、3.66和3.64ppm处分辨出H-5和H-6、6’共振(图17d)。从4.34ppm处的H-2¹H-共振获得1-D TOCSY实验，验证了H-3和H-4识别(图17e)。从3.36ppm处的H-4¹H-共振获得1-D NOESY实验，验证了H-2、H-3、H-5和H-6、6’识别(图17f)。从这些实验测定耦合常数，得到j_1，24.8Hz，j_2，31.0Hz，J_3，49.7Hz，J_4，51.4Hz，J_5，66.5Hz，J_5，6’6.5Hz，K_6，6’-12Hz。进行了2D-¹³C-¹H-HSQC NMR光谱(图17e)，辨别出HexNAc分子的C-1到C-6位的¹³C-化学位移分别为101.1ppm，52.6ppm，68.5ppm，70.0ppm，70.7ppm和64.1ppm。该数据最初令人困惑，然而对本实验室的糖数据库进行的检索发现了变形菌(Proteus)菌种的核心OS中的开链N-乙酰半乳糖胺残基的一组类似数据。发现开链残基尽管出人意料，却与糖、甲基化和FAB分析数据一致，这是因为此残基对糖和甲基化分析中所采用的水解条件敏感，在FAB分析中该末端残基的糖基氧鎓离子的形成会被该残基的开链构型所阻碍。

因此，血清型1、2、5a和5b的核心OS的结构分析已经完成，在所有菌株中辨别出保守性内核结构，在该保守性结构上具有不同的修饰，如图18所示。

对血清型1、2、5a和5b的核心寡糖(代表核心类型I、II、II和II)的结构分析显示出相对保守的结构。每条链的内核OS均相同，由与Kdo残基连接的三糖L-甘油-D-甘露-庚糖残基组成。每种血清型中，邻近的庚糖残基(Hep I)在3位被L-甘油-D-甘露-庚糖三糖的第二个L-甘油-D-甘露-庚糖残基(Hep II)取代，在4位被β-葡萄糖残基(Glc I)取代，在6位被α-葡萄糖残基(Glc II)取代。在每条链中Glc I残基的6位都发现有一个D-甘油-D-甘露-庚糖残基(Hep IV)。在血清型2、5a和5b中，第二个D-甘油-D-甘露-庚糖残基(Hep V)取代了6位的Hep IV。血清型2和5a、5b之间的唯一区别是，在血清型2中，在Hep IV残基的4位多连接有一个葡萄糖残基。在这些OS结构和前面发现的溶血性曼氏杆菌血清型A1的OS结构之间存在着惊人的相似性。5b、5a OS结构和溶血性曼氏杆菌血清型A1核心OS之间唯一的区别是，在溶血性曼氏杆菌A1 OS的Hep V中缺少另外的末端半乳糖残基。在血清型1中没有Hep V残基，Hep IV在4位被三糖α-GaloNAc-(1-4，6)-α-Gal-(1-3)-β-Gal-取代，其中，HexNAc残基为罕见的开链构型。在血清型1中，被识别为从Hep I的最初的三糖延伸的结构排布与先前在杜克雷嗜血杆菌菌株2665 LPS中发现的相同，然而与在杜克雷嗜血杆菌中发现的DD-Hep间断的乳糖-N-新四糖结构相比，血清型1 LPS在Gal I残基上有不同的延伸。

因而，对于在SDS-PAGE中观察到的Ap LPS的两种核心类型，获得了结构上的解释。核心类型II的血清型2、5a和5b具有非常相似的LPS结构，区别仅在于血清型2中多有一个葡萄糖残基。然而核心类型I的血清型1缺少DD-Hep残基，但是有两个己糖和一个新的开链HexNAc残基。为了研究该新的开链HexNAc残基是否在其他的核心类型I血清型中存在，检查了来自血清型6、9和11的LPS。开链HexNAc的证据在血清型9和11中的MS和NMR实验(数据未给出)中均被发现，但在血清型6中没有发现。对用于对核心类型进行分类的SDS-PAGE图样进一步研究显示，血清型6具有两种核心类型的LPS迁移模式，因此有可能我们检查的血清型6菌株只有核心类型II图样。

在Ap的LPS生物合成的遗传控制中可用的数据很少。最近Galarneau等人的一篇论文辨别了转座子诱变的三个基因，似乎涉及Ap血清型1 LPS的核心OS区的生物合成。基于与其他糖基转移酶的同源性，这些基因被暂时辨别为糖基转移酶。据推测，这三个基因为lbgB，α-1，6-DD-庚糖基转移酶，lbgA，β-1，4-半乳糖基转移酶，以及己糖或N-乙酰-己糖胺转移酶。前两个基因，lbgAB，与本文在血清型1核心OS中辨别的结构一致，具有与杜克雷嗜血杆菌LPS相同的基因座排布。Rioux等人的另一篇论文辨别了基因galU，UTP-α-D-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的结构基因。从血清型1 Ap galU突变株分离的LPS的SDS-PAGE具有不同的核心-脂质A区的迁移模式，该突变株对猪气管细胞的粘附性较弱，对猪的毒力较弱，说明核心OS区本质或呈现的改变对该动物病原体的毒力有影响。

辨别出新的开链HexNAc残基很令人感兴趣。该结构以前只在两种变形菌菌种、最近在沙雷菌(Shewanella oneidensis)中辨别出来，其意义还不清楚。如同现有文献中已经发现的那样，本文中辨别的开链残基被发现同时在4和6位双取代相邻的残基，所以这可能是此类残基共有的排布方式。

前面，在几种菌株包括溶血性曼氏杆菌、杜克雷嗜血杆菌和非典型性流感嗜血杆菌中，已经观察到从Hep I的寡糖延伸中的DD-Hep残基的辨别。在溶血性曼氏杆菌中，观察到两个DD-Hep残基，而在杜克雷嗜血杆菌和流感嗜血杆菌中，只发现一个DD-Hep残基。在Ap中存在两种情况：在从HepI的寡糖延伸中血清型2和5a、5b具有两个DD-Hep残基，血清型1只有一个DD-Hep残基。前面在溶血性曼氏杆菌、杜克雷嗜血杆菌和流感嗜血杆菌中还观察到三-LD-庚糖基内核基团。这里在所有研究过的App菌株中发现的3，4，6-三取代的Hep I残基以前在溶血性曼氏杆菌LPS中都已经观察到，然而杜克雷嗜血杆菌LPS只具有与在流感嗜血杆菌中发现的相同的3，4-二取代的Hep I残基。

辨别出Hep III残基的7位为血清型5a的O-抗原半乳糖残基的附着点是令人非常感兴趣的，并与所观察到的血清型1的三种不同截短型的核心寡糖突变体中仍然具有O-抗原这一现象相一致，这是由于这三种截短型基因产物的预期功能不会干扰内核LD-庚糖基三糖单元的生物合成，从而O-抗原附着的受体仍然在突变型LPS核心寡糖中存在。

该研究从结构上表征了几种Ap菌株(代表两种核心类型)的核心寡糖区域，辨别出保守性内核结构和新的外核组成。已知该区域涉及Ap的粘附性，从而涉及到毒力。因此，该研究能够促进对Ap LPS的核心寡糖区域的结构和该生物潜在毒力的相关性的进一步研究。

材料和方法-实施例2

培养基和培养条件

将Ap血清型1(菌株4074)、2(菌株4226)、5a(菌株K17)和5b(菌株L20)首先在巧克力琼脂平板上37℃下培养过夜，培养物用于接种1 L脑心浸液(BHI)培养基，该培养基添加有终浓度为5ug/ml的βNAD(SigmaN-7004)、终浓度为5ug/ml的氯化血红素(haemin，Sigma H-2250)以及1％葡萄糖glucose(10g)。然后将培养物在37℃下以200rpm温育6小时，并用于接种在28 L NBS发酵罐中的23 L BHI培养基(添加成分同上)。然后将该培养物在37℃、24 lmin^-1通气200rpm搅拌下培养18小时。杀死细胞(2％苯酚w/v，4小时)，使用Sharples连续离心机收获(约40g湿重)。

分离和纯化脂多糖

通过下述方法从血清型5a和5b的干细胞群中分离脂多糖(LPS)：在用有机溶剂洗涤干细胞群后，再使用热水/酚法。将水相使用水透析，冻干，若为血清型2，LPS从充分透析的酚相中分离。将干燥的样品溶于水中，生成1-2％的溶液(w/v)，使用脱氧核糖核酸酶I(DNase)(0.01mg/ml)和核糖核酸酶(RNase)(0.01mg/ml)在37℃下处理3小时，然后使用蛋白酶K(0.01mg/ml)处理3小时。将透析、干燥的样品溶于水中，生成1％的溶液，超速离心(5小时，100,000g)。将LPS沉淀重新溶于水中，冻干，在Bio-Gel P-2(1cm×100cm)柱上通过凝胶过滤纯化，以水作为洗脱液，收集含有糖的组分，冻干。使用无水肼在37℃、搅拌下处理纯化的LPS一小时，制备O-脱酰LPS(LPS-OH)。将反应在冰浴上冷却，缓慢加入冷丙酮(-70 C，5倍体积)，以破坏过量的肼，沉淀的LPS-OH通过离心分离。然后将样品如上所述过Bio-Gel P-2柱纯化。核心寡糖(OS)通过下述方法分离：使用1％乙酸处理(10mgml^-1，100℃，1.5小时)纯化的LPS，然后通过离心(5000g)去除不溶性脂质A。冻干的OS以冻干的各组分通过Bio-GelP-2柱进一步纯化。

分析方法

糖以其糖醇乙酸酯衍生物的形式通过GLC-MS测定。将样品使用4 M三氟乙酸在100℃下水解4小时。将水解产物在H₂O中还原(NaBD₄)过夜，以残留的乙酸钠作为催化剂，使用乙酸酐在100℃乙酰化2小时。在GLC-MS上装上30 M DB-17毛细管柱(180℃到260℃，3.5℃/min)，Varian SaturnII质谱仪上以电子碰撞模式进行MS。甲基化分析通过NaOH/DMSO/甲基碘方法进行，并通过如上的GLC-MS分析。

质谱测定

在VG Quattro质谱仪(Micromass，Manchester，U.K.)上以阴离子模式进行ESI-MS，直接将样品注入含0.5％乙酸的25％乙腈水溶液中。在crystal Model 310(CE)设备(AYI Unicam)上进行毛细管电泳(CE)-ESI-MS，该设备通过微型离子喷射接口与API 3000质谱仪(Perkin-Elmer/Sciex)连接。将保护液(sheath solution)(异丙醇-甲醇，2∶1)以1 L/min的流速输给较低的死体积三通管(tee)(250μm i.d.，ChromatographicSpecialties)。所有的水溶液在使用前通过0.45-μm滤器(Millipore)过滤。将电喷射不锈钢针(27号)与较低的死体积三通管对接，以使保护液能够流到毛细管柱的端头。使用10mM乙酸铵/氢氧化铵的去离子水溶液(pH9.0，含5％甲醇)，在约90cm长的裸熔融石英毛细管上获得分离物。注射时一般应用20kV的电压。使用激光钳(Sutter Instruments)将毛细管的出口拉细至大约15μm i.d.。以采样时间3.0ms、每步1m/z单位、全质量扫描方式获得质谱。以采样时间1.0ms、每步1m/z单位获得MS/MS数据。在只有RF的四极碰撞室中，由氮与所选先驱离子碰撞活化所形成的片段离子，通过扫描第三级四极来进行质谱分析。

核磁共振

使用5mm或3mm三重共振(¹H，¹³C，³¹P)探针，在Varian Inova 400、500和600 MHz光谱仪上进行NMR实验。将冻干的糖样品溶于600 L(5mm)或140 L(3mm)99％的D₂O中。该实验在25℃下进行，同时HOD(氘化H₂O)在4.78ppm处的信号受到抑制。丙酮的甲基共振用作内部标准，2.225ppm对应¹H光谱，31.07ppm对应¹³C光谱。将来自Varian、COSY、TOCSY、NOESY、¹³C-¹H HSQC、¹³C-¹H HSQC-TOCSY和¹³C-¹H HMBC的与标准的同核和异核有关的2D脉冲序列用于常规识别。进行带有Z滤光片和选择性1D-TOCSY和1D-NOESY实验，以及3-D NOESY-TOCSY和TOCSY-NOESY实验的1-D类似实验来完成残基识别，并确定¹H-¹H核的Overhauser增强。选择性脉冲的脉冲宽度为30-80Hz。将30-150ms的混合时间用于1D-TOCSY实验。将400-800ms的混合时间用于1D-NOESY实验。

实施例2，表1：胸膜肺炎放线杆菌血清型1、2、5a和5b的O-脱酰LPS和核心寡糖的阴离子ES-MS和CE-ES-MS数据以及推测的组成。平均质量单位用于计算基于如下推测的组成的分子量：Hex，162.15；HexNAc，203.19；Hep，192.17；Kdo，220.18；P，79.98；PEtn，123.05；Gly，57.05.O-脱酰脂质A(脂质A-OH)为952.00。

血清型	观察到的离子(m/z)		分子质量(Da)		推测的组成
						(M-2H)2-3H)3-	(M-	观察值	计算值
	1O-脱酰	139614361497	930957998	279428742997						2792.72872.62995.7	HexNAc，4Hex，4Hep，Kdo，脂质A-OHHexNAc，4Hex，4Hep，Kdo，P，脂质A-OHHexNAc，4Hex，4Hep，Kdo，P，PEtn，脂质A-OH
核心OS					919928	-	18401858	1840.71858.7	HexNAc，4Hex，4Hep，aKdoaHexNAc，4Hex，4Hep，Kdo
	2O-脱酰	13091349	872899	26202700						2620.52699.5	3Hex，5Hep，Kdo，脂质A-OH3Hex，5Hep，Kdo，P，脂质A-OH
核心OS					832	-	1667	1667.5	3Hex，5Hep，Kdo
	5aO-脱酰	1268	845	2537						2537.4	2Hex，5Hep，Kdo，P，脂质A-OH

血清型	观察到的离子(m/z)		分子质量(Da)		推测的组成
						(M-2H)2-3H)3-	(M-	观察值	计算值
	核心OS	752780		15051562						1505.31562.3	2Hex，5Hep，Kdo2Hex，5Hep，Kdo，Gly
5bO-脱酰					1268	845	2537	2537.4	2Hex，5Hep，Kdo，P，Lipid A-OH
	核心OS	752780	-	15051562						1505.31562.3	2Hex，5Hep，Kdo2Hex，5Hep，Kdo，Gly

^a数离子对应于分子离子-18(失去H₂O)。

实施例2，表2：胸膜肺炎放线杆菌血清型1、2、5a和5b的核心OS的¹H-和¹³C-NMR化学位移。

	H-1	H-2	H-3	H-4	H-5	H-6	H-7	NOE’s
											内核a血清型1，2，5a，5b								之间	内部	远程
Kdo(k)	-	-	2.081.92	4.10	4.21	4.48	nd
											Hep-I(a)	5.11(98.9)	4.01(71.2)	3.97(73.7)	4.21(74.7)	3.79(72.6)	4.13(80.3)	3.883.73(62.9)	4.20Kdo H-5	4.01 H-2
Hep-I(A)	5.37(101.3)	4.08(71.2)	3.95(73.5)	4.22(74.6)	3.78(72.6)	4.13(80.3)	3.883.73(62.9)	nd	4.00 H-2

Hep-II(b)	5.70(100.2)	4.19(80.5)	3.87(70.7)	3.89(67.5)	3.55(72.7)	4.04(70.3)	3.763.74(64.2)	5.15 Hep III H-13.97 Hep I H-3	4.19 H-23.87 H-3	3.79 Hep I H-53.82 Hep III H-53.77 Hep III H-7a3.56 Glc I H-2
											Hep-IIIb(c)	5.17(102.3)	4.00(71.5)	3.88(71.6)	3.82(67.1)	3.82(72.4)	4.06(70.2)	3.933.93(70.3)	5.70 Hep II H-14.19 Hep II H-2	4.00 H-2	4.0g Hep IV H-23.80 Hep IV H-33.63 Glc I H-4
Hep-IIIc(c)	5.17(102.3)	4.00(71.5)	3.88(71.6)	3.82(67.1)	3.82(72.4)	4.04(70.2)	3.773.62(64.6)	5.70 Hep II H-14.19 Hep II H-2	4.00 H-2	4.08 Hep IV H-23.80 Hep IV H-33.63 Glc I H-4
											β-Glc(Glc-I)(d)	4.66(104.0)	3.56(74.1)	3.43(77.8)	3.63(70.3)	3.54(74.5)	4.063.70(65.5)	-	4.21 Hep I H-44.13 Hep I H-6	3.54 H-53.43 H-3	5.21 Glc II H-1
α-Glc(Glc-II)(e)	5.21(102.6)	3.58(72.8)	3.81(73.8)	3.59(69.3)	3.92(72.4)	3.963.76(60.2)	-	4.13 Hep I H-6	3.58 H-2	4.66 Glc I H-1

外核血清型5a，5b
											Hep-IV(f)	4.96(99.8)	4.08(70.5)	3.80(71.7)	3.78(68.1)	3.93(71.9)	4.13(77.0)	3.903.80(61.2)	4.06 Glc I H-6a3.70 Glc I H-6b	4.08 H-2
Hep-V(g)	5.03(99.0)	3.92(70.8)	3.84(71.5)	3.79(68.2)	3.97(73.7)	4.02(73.1)-	3.793.74(63.0)	4.13 Hep IV H-63.93 Hep IV H-5	3.92 H-23.97 H-5	4.19 Hep II H-24.04 Hep II H-63.93 Hep IV H-5
											β-Gal(Gal-I)(h)	4.49(104.2)	3.55(71.6)	3.68(73.4)	3.97(69.5)	3.93(74.5)	3.753.61(65.7)	-	3.93 Hep III H-7a3.93 Hep III H-7b	3.68 H-33.93 H-5
血清型2
											Hep-IV	4.96	4.13	3.90	3.96	4.05	4.30	3.97	4.06 Glc I H-6a	4.14 H-2

	(99.5)	(70.3)	(70.6)	(78.0)	(70.3)	(75.4)	3.82(60.9)	3.70 Glc I H-6b
										Hep-V	5.02(98.6)	3.88(70.7)	3.82(71.5)	3.78(68.1)	3.97(73.9)	4.00(73.0)	3.803.74(62.8)	4.30 Hep IV H-64.05 Hep IV H-5	3.88 H-2
β-Glc(Glc III)	4.53(103.4)	3.33(74.0)	3.51(76.4)	3.41(70.4)	3.51(77.0)	3.953.74(61.6)	-	3.96 Hep IV H-44.30 Hep IV H-64.05 Hep IV H-5	3.51 H-33.52 H-5
										血清型1
Hep-IVd	4.95(99.7)	4.13(70.2)	3.94(70.7)	3.94(79.5)	3.94(72.9)	4.17(66.9)	3.833.80(61.9)	4.15 Glc I H-6a3.74 Glc I H-6b	4.13 H-2

β-Gal(Gal-I)	4.55(103.9)	3.67(70.3)	3.79(78.4)	4.17(65.9)	4.17(71.6)	3.873.75(62.4)	-	3.94 Hep IV H-4	3.79 H-34.17 H-5
										α-Gal(Gal-II)(j)	5.18(97.3)	3.97(68.8)	4.06(68.7)	4.25(76.7)	4.13(64.2)	4.124.01(69.5)	-	3.79 Gal I H-3	3.97 H-2
α-GalNAc开链(i)	4.88(101.1)	4.34(52.6)	4.13(68.5)	3.36(70.0)	3.93(70.7)	3.663.64(64.1)	-	4.25 Gal II H-44.12 Gal II H-6a4.01 Gal II H-6b	4.34 H-2

^a；内核数据来源于血清型5a；残基的字母标号如括号中所示。来自其他血清型内核残基的化学位移实质上相同

^b；血清型5a和5b的取代的Hep III残基的数据

^c；血清型1和2的末端Hep III残基的数据

^d；对于血清型1的1H-共振，Glc I H-6a和H-6b分别为4.15和3.74ppm。

实施例3本实施例形成了Glycobiology 15：323(2005)中一篇出版物的基础。研究多杀性巴氏杆菌菌株Pm70

对纯化的LPS进行糖分析表明葡萄糖(Glc)，半乳糖(Gal)和L-甘油-D-甘露-庚糖(LD-Hep)的各自的比例大约为4∶2∶3。还识别到少量的N-乙酰-葡萄糖胺(GlcNAc)和N-乙酰-半乳糖胺(GalNAc)，并且，与最近所研究的其他兽类的病原体相比，没有识别到D-甘油-D-甘露-庚糖(DD-Hep)(Brisson，et al，2002；St.Michael et al，2004)。核心寡糖(OS)衍生的丁基-糖苷的GLC分析表明，Glc、Gal和GalNAc残基以它们的D-异构体形式存在。

制备O-脱酰LPS(LPS-OH)，并用凝胶过滤色谱分级，以及用CE-MS分析(实施例3，表1)。在CE-MS分析中，观察到简单质谱，主峰为m/z1173.8的三电荷离子，该峰对应于与组成HexNAc2，Hep4，Hex6，PEtn，Kdo，P，Lipid A-OH相一致的3525amu的分子，还有少量由m/z1132.9^3-和1215.2^3-表征的从主要碎片中失去或者得到一个PEtn残基的离子峰。对三电荷离子m/z 1173.8的CE-MS分析(未显示数据)得到一个m/z951的单电荷峰和一个m/z 1236.5的双电荷离子，从而确定O-脱酰脂质A的大小为952amu，核心OS的大小为2475amu。O-脱酰脂质A的主要种类(952amu)由N-酰(3-OH C 14∶0)葡糖胺残基二糖组成，每一残基由一个磷酸分子取代。有趣的是，对应于缺少己糖和磷酸分子，同时增加Kdo分子的少量糖型，由m/z 1125.7^3-和1166.7^3-表征，这暗示分子的Kdo区域存在两种截然不同的排布(实施例3，表1)，即Kdo-P或Kdo-Kdo排布。在KOH处理的LPS的CE-MS光谱中观察到含有一个和两个Kdo残基糖型的一种类似混合(实施例3，表1)。ES-MS和CE-MS分析发现经分级的核心OS样品具有2492Da，这与HexNAc2，Hep4，Hex6，PEtn，Kdo的组成一致(实施例3，表1)(图19)。对核心OS用阳离子模式进行CE-MS/MS分析，以获得OS分子中的一些官能团的定位信息。对m/z 1246.5²⁺的双电荷离子的MS/MS分析表明了几种产物离子(图20)。一种与203.5⁺的HexNAc残基和两种407.5⁺的HexNAc残基对应的单电荷离子占优势。还识别出对应图20中所示组成的其他产物离子。在对m/z 316(对应Hep-PEtn基团)的先驱离子的扫描中，根据对m/z 817.52⁺(Hex3，Hep4，Kdo，PEtn)、898.52⁺(Hex4，Hep4，Kdo，PEtn)、979.52⁺(Hex5，Hep4，Kdo，PEtn)、1059.52⁺(Hex6，Hep4，Kdo，PEtn)和1263.52⁺(HexNAc2，Hex6，Hep4，Kdo，PEtn)(图21)的水合双电荷离子的识别，将核心OS的PEtn区定位于内核的一个庚糖残基(Hep)。通过对m/z 893⁺(对应HexNAc-HexNA基团)的先驱离子的扫描，揭示了893⁺的单电荷离子，该单电荷离子对应于Hex3，HexNAc2(未显示数据)组成。因此，这两种先驱离子扫描实验表明了内核组成Hex3、Hep4、Kdo和PEtn，并带有一3Hex和2HexNAc残基的外核延伸。

为确定分子的连接模式而对核心OS进行的甲基化分析显示末端Glc，6-取代的Glc，4-取代的Glc，4-取代的Gal，3-取代的Gal和末端LD-Hep以摩尔比约为2∶1∶1∶1∶1∶1∶1的比率存在，并观察到有较少的末端Gal，2-取代的LD-Hep，3，4-二取代的LD-Hep和3，4，6-三-取代的LD-Hep。另外，通过比较来自胸膜肺炎放线杆菌(Ap)血清型2的过甲基化糖醇乙酸酯，将4，6二-取代的LD-Hep残基的保留时间与4，6二-取代DD-Hep残基区分开来，确定了其归属，并且与Pm LPS中无DD-Hep一致。

为了阐明OS的确切位置及连接模式，对OS组分以及完全脱酰(KOH处理)的样品(图22)进行了NMR研究，其中对OS组分提供了最清楚，最均一的谱图。通过COSY和TOCSY(图5a)实验识别了OS和KOH处理的LPS的¹H共振，同时参照了溶血性曼氏杆菌(Mh)和Ap的结构上相关的核心OS(Brisson，et al，2002；St.Michael et al，2004)(实施例3，表2)。

在Pm70 OS和KOH处理的LPS的¹H-NMR谱图中，从庚糖残基(Hep I(E)，Hep II(F)，Hep III(G)和Hep IV(J))在5.10_OS(OS样品)/5.19_KOH(KOH处理样品)(Hep I，E)，5.87os/5.74_KOH(Hep II，F)，5.23_os&KOH(Hep III，G)和5.12_os&KOH(Hep IV，J)ppm的端基异构体¹H共振中识别到源于上述庚糖残基的自旋***，结合这些自旋***的形态，将上述自旋***确定为甘露-吡喃糖基环***。由于相邻Kdo分子在酸水解后的多种重排产物的存在，观察到在OS样品中有Hep I端基异构体质子的异质性(详述OS样品中较多Hep I信号的识别)。仅从残基内NOE’s在H1和H2共振之间的出现，能显而易见的确定庚糖残基的α-构型。5.22os_&KOHppm(Glc II，H)和5.09os/5.53_KOHppm(GalNAc II/GAlN II，P)的α-端基异构体区的两个残基，根据其自旋***的形态分别被确定为葡萄糖-吡喃糖和半乳糖-吡喃糖。半乳糖-构型残基在5.09os/5.53_KOHppm下被确定为氨基糖，这是根据其在4.24os/3.65_KOHppm下的H-2质子的¹H共振而确定的，在¹³C-¹H HSQC实验中，其与50.4os/51.5_KOHppm的¹³C化学位移有关。该¹³C化学位移与氮取代的碳原子一致。在TOCSY实验中，在4.95os/4.99_KOHppm(Gal II，N)下，根据其特征性自旋***出现在H-4共振，将α-端基异构体区剩余残基确定为半乳糖-吡喃糖(图23)。在光谱的低磁场区(4.45-6.00ppm)的剩余的端基异构体共振，根据他们的异头1H共振的化学位移和在该残基已经解析情况下的高J_1，2(～8Hz)耦合常数，归因于β-连接残基。在4.65os_&KOHppm(GlcI，I)，4.70os&KOHppm(Glc III，K)和4.69os_&KOHppm(Glc IV，L)下的共振，根据他们的自旋***的形态，将其确定为葡萄糖-构型。在TOCSY实验中，在低磁场区4.53os_&KOHppm(Gal I，M)和4.73os/5.01_KOHppm(GalNAc I/GalNI，O)下，根据H-4共振的特征性自旋***出现在，将剩余共振确定为半乳糖-吡喃糖残基。在4.73os/5.01_KOHppm下，根据半乳糖-构型残基在4.12/3.53ppm下，H-2质子的¹H共振，将其确定为一个氨基糖，其与在¹³C-¹H HSQC实验中、51.9os/53.1_KOHppm的¹³C化学位移有关。该¹³C化学位移与氮取代的碳原子一致。在3.27和4.16ppm下的OS样品中，观察到PEtn部分的CH₂质子信号，其分别与¹³C-¹H HSQC实验中、在40.1和62.2ppm下的特征性¹³C化学位移相关。另外，在2.06和2.04ppm下的OS样品中，观察到氨基糖的乙酰基特征性信号，其分别与¹³C-¹H HSQC实验中、在22.4和22.1ppm下的¹³C化学位移相关。

通过残基间¹H-¹H NOE测定法，将OS中糖基残基的顺序确定在相邻的糖基残基的端基异构体质子和苷元质子之间，并且确定和扩充了甲基化作用的分析数据。使用这种方式确定了Pm70脱酰寡糖的连接模式(图24)(实施例3，表2)。这样，就如同常观察到的三-庚糖基部分一样，在质子对Hep III(G)H-1和Hep II(F)H-2，Hep II(F)H-1和Hep I(E)H-3和Hep I(E)H-1和Kdo(C)H-5之间出现与糖苷强的NOE连接关系，建立起这三种LD-庚糖残基的顺序和附着点，这种连接模式经常在流感嗜血杆菌(Hi)和Mh的内核OS中遇到(Cox et al，2001 a；Brisson et al，2002)。而且，在Hep III(G)H-1和Hep II(F)H-1之间的端基异构体质子的残基间NOE’s为1，2-连接键提供了确认(Romanowska et al，1988)。对Glc I(I)H-1的NOE连接性考察，通过Hep I(E)H-4和Hep I(E)H-6的残基间NOE，说明该葡萄糖残基与Hep I(E)在4-位连接。一个H-6的残基间NOE对4-取代庚糖残基来说经常发生(Backman et al，1988)。如在前面Mh和Ap的OS中所观察到的，在Glc I(I)H-1和Glc II(H)H-1之间的远程NOE连接性的出现表明α-构型葡萄糖残基(Glc II(H))在6-位取代Hep I(Brisson，et al，2002；St.Michael et al，2004)。对Glc II(H)H-1的NOE连接性考察，通过Hep I(E)H-4的残基间NOE，确定这个葡萄糖残基与Hep I(E)在6-位连接。类似Glc I(I)，在GlcI(I)和Glc II(H)端基异构体1H共振之间观察到一个远程NOE连接性。通过Glc I(I)H-6a和H-6b的残基间NOE，对Hep IV(J)H-1的NOE连接性进行考察，揭示出这个庚糖残基与Glc I(I)在6-位连接。在之前的Mh和Ap中观察到内核单糖结构Hep IV残基(J)是D-甘油-D-甘露构型，而这里的Hep IV残基(J)是L-甘油-D-甘露构型，这是因为在糖分析中识别到的庚糖残基的唯一构型。根据NOE连接性和¹³C-¹H-HMBC证据，以及甲基化作用分析数据推断出外核残基的连接模式。两个葡糖构型残基(K&L)，它们的端基异构体质子在4.70_OS&KOH/4.69O_S&KOHppm下的共振表明在4.15_OS&KOH和4.31_OS&KOHppm下Hep IV残基(J)H-4和H-6质子共振的NOE连接性，与甲基化分析中观察到的4，6-二取代LD-庚糖残基一致，并且与前面在Ap血清型2中观察到的DD-HepIV排布相似(St.Michael et al，2004)。通过¹H-¹³C HMBC实验(图25)可以确定，Glc III(K)在4位上连接于HepIV(J)，Glc IV(L)在6位上连接于HepIV(J)。从Gal I(M)在4.53_OS&KOHppm下的端基异构体质子共振到Glc IV(L)的H-4质子共振NOE间的连接性显示，Gal I(M)在4-位上取代Glc IV(L)。从Gal II(N)的端基异构体质子共振到Gal I(M)的H-4质子共振NOE间的连接性显示，Gal II(N)在4-位上取代Gal I(M)，与甲基化分析数据所确定的两个4-连接己糖残基，即一个4-连接葡萄糖和一个4-连接半乳糖残基相一致。从GalNAc I/GAlN I(O)的端基异构体质子共振到Glc II(N)的H-3质子共振NOE间的连接性显示，GalNAc I/GAlN I(O)在3-位上取代GlcII(N)，又通过甲基化分析确认到一个3-连接己糖残基而确定。最后，从GalNAc II/GalN II(P)的端基异构体质子共振到GalNAc I/GalN I(O)的H-3质子共振NOE间的连接性显示，GalNAc II/GalN II(P)在3-位上取代GalNAc I/GalN I(O)，与MS/MS确认的一个HexNAc-HexNAc二糖相一致。通过以OS样品的³¹P-¹H-HSQC和³¹P-¹H-HSQC-TOCSY实验确认Hep II(F)的3-位为PEtn的取代位置。HSQC实验识别到一个从磷信号到4.41ppm处的质子共振的交叉峰，该交叉峰归属于Hep II残基(F)的3位，这在HSQC-TOCSY实验中被进一步确认和扩充，该HSQC-TOCSY实验显示Hep II(F)的H-2和H-1质子共振分别位于4.31和5.87ppm(未显示数据)。

通过对经KOH处理的LPS的分析确定了Hep I-Kdo-脂质A区(E-C-B-A)的连接为L-α-D-Hep I-(1-5)-α-Kdo4P-(2-6)-β-GlcN4P-(1-6)-α-GlcN1P(实施例3，表2)。通过色谱分离和MS识别得到含有两种Kdo的组分，但其量不足以用于NMR分析。

Pm70菌株基因组序列的利用(May et al，200)连同对OS结构的全面的认知，加上糖基转移酶信息，使几种用于Pm70 OS生物合成的候选糖基转移酶被确认(图26)，所述糖基转移酶将在结构上和分类学上相关的种类联系起来，。在Pm70基因组序列中确认了几种推测的庚糖转移酶，包括一个Hep III Tase PM1294，一个Hep II Tase PM1844，两个Hep I TasesPM1302和PM1843以及一个Hep IV Tase PM1144。在实施例3，表3中详细描述了这些基因中的每一个在数据库中的最佳同源物，这种高度同源性显示候选PM基因会有所示的功能。前面我们小组和合作者曾表明，PM1294在另一Pm菌株VP161中是Hep III Tase(Harper et al，2004)。将α-葡萄糖(H)加到Hep I(E)的6-位的基因不是公知的，但对β-葡萄糖基转移酶(其在4-位取代Hep I(E))，有一个很好的同源物PM1306。由于Kdo转移酶有广泛数目的极好的同源物，因而其已很容易地被识别是PM1305，然而，在Pm基因组中只识别到一个Kdo转移酶同源物。有趣的是，几个与Kdo(C)，Hep I(E)，Glc I(I)的生物合成相关的基因成簇地存在于在该条染色体的这个区域。外核区推测的糖基转移酶似乎也成簇出现在从PM1138到PM1144的染色体的某一区域。在这种菌属中并不总是能观察到这种糖基转移酶基因簇，实际上，Hi OS的糖基转移酶广泛地分散于整个基因组。在Pm(从PM0506到PM0512)基因组的另一区域，可以找到另一个推测的糖基转移酶基因座。在Hi和杜克雷嗜血杆菌(Hd)中，这种基因座都与所谓的lsg基因座很好地排布在一起。这种未被指定任何具体作用的基因座在HiOS生物合成中的作用是文献(Phillips et al，1996，2000；Cox et al，2001b)中的一个讨论问题。但在这个Pm70基因座中间是一个唾液酸转移酶同源物(PM0508)，该同源物是Pm70(也是PM0188和PM1174)基因组中三个唾液酸转移酶同源物之一，并且在我们实验室，结构研究仍在进行以考察在适当的生长条件下，Pm70是否可能唾液酸化。在实施例3，表3中，还详述了被激活的核苷酸糖供体候选基因。

讨论

对Pm菌株的Pm70基因组的寡糖结构分析显示出一种结构，该结构类似于之前所确定的相关菌种Mh(Brisson et al，2000)，Ap(St.Michaelet al，2004)，Hd(Schweda et al，1994)和Hi(Cox et al，2001a)的LPS核心寡糖结构。在每种情况下，核心OS包含连接在Kdo残基上的一个等同连接的三-庚糖基单元。有趣的是，在多数情况下，在Pm中3-位的HepII残基被PEtn残基替代，而Ap，Hd和Mh不包含PEtn残基，Hi在HepII的6-位有一个PEtn残基。Pm的Hep I残基的取代模式与在兽类病原体Ap和Mh中发现的相同，在4-位和6-位有两个葡萄糖残基，而在Hi和Hd的Hep I残基中，只有4-位被取代。另外，在三种兽类病原体、Hd以及Hi的一些菌种中，在Hep I 4-位的葡萄糖残基总是被一个庚糖残基在6-位取代。然而，与在Ap、Hd、Mh和一些Hi菌株中的D-甘油-D-甘露构型的庚糖残基相比，在Pm(和一些Hi菌株)中取代葡萄糖残基的庚糖残基是L-甘油-D-甘露构型。在这些菌株中，庚糖残基的取代模式多种多样，在OS结构的这一方面，在多种菌株之间保守内核结构相似性终止。在Pm中庚糖残基在4-和6-位被两个葡萄糖残基二-取代，与在Ap血清型2中庚糖残基在相同位置被二-取代相似，但在4-位是被另一庚糖残基而不是被葡萄糖残基取代。Mh在4-位也有另一个D，D-庚糖残基，而在Ap血清型1、Hd和Hi中也有来自于第四个庚糖残基进一步的己糖延伸，但是在这里没有观察到在新的GalNAc-GalNAc二糖单元终止的延伸。

在Pm70基因组中，基于Pm70 OS结构识别到有相似特异性的关于糖基转移酶的同源物Pm。考虑到依赖于一或两个Kdo残基的存在的两个LPS成员的新发现，会有趣地注意到在Pm基因组中只识别到一个关于Kdo残基转移酶的同源物。这并不令人惊讶，因为Kdo转移酶的多效性本质已被充分证明，例如相同的Kdo转移酶能够转移一个Kdo残基到脂质A而将第二个Kdo残基转移到初始的Kdo残基。Pm LPS的新特征虽然是有一和两个已被公开的Kdo残基的成员，但就我们所知，在之前没有被识别到过。但是，在Pm70基因组中观察到两个很好的Hep I(E)到Kdo(C)(α-1，5庚糖转移酶)的转移酶的同源物。一个转移酶对Hi的HI 0261(OpsX)有最高同源性，其中LPS结构中包含一个Kdo残基；第二个转移酶对来自大肠杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌的WaaC具有最高同源性，所述大肠杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌中LPS结构中有两个Kdo残基。因此，两个Hep I转移酶的识别与Pm70 LPS的Kdo区域中两种结构排布的出现相符，并且理解这种生物体Kdo转移酶的规律是非常有趣的。

这项研究从结构上表征了Pm基因组菌株的核心OS区域，确认出用于核心OS的完全生物合成的推定的糖基转移酶。

材料、方法

培养基和生长条件

Pm菌株Pm70(NRCC#6232)先在巧克力琼脂平板上于37℃培养过夜，将培养物接种到1L脑-心浸液(BHI)培养基，该培养基添加有，终浓度为5ug/ml的β NAD(Sigma N-7004)，终浓度5ug/ml的氯化血红素(SigmaH-2250)，和1％葡萄糖(10g)。然后将培养物在37℃，200rpm下培养6小时，接种到一个28L NBS发酵罐中的24L BHI培养基(添加同上)。再将培养物于37℃，每分钟通气24次，转速在200rpm，20％O₂饱和下培养18小时。接着用透明质酸酶(1g，Sigma，)处理，杀死细胞(2％苯酚w/v，4小时)，用Sharples连续式离心机收集(～240g湿重)。

脂多糖的分离纯化

接下来用有机溶剂洗涤冻干细胞块(～70g)得到～50g，从用热水、苯酚方法清洗的10g冻干细胞块中分离出脂多糖(LPS)(Westphal and Jann，1965)。将水相除水透析并冻干。将干样品溶于水中得到1-2％的溶液(w/v)，用脱氧核糖酸梅I(DNase)(0.01mg/ml)和核糖核酸酶(RNase)(0.01mg/ml)于37℃处理3小时，然后用蛋白酶K(0.01mg/ml)消化3小时。将透析、干燥样品溶解于水中制得1％的溶液，于8K低速离心去除不溶物质(124g)后于45K超速离心。45K离心而得的LPS沉淀用水再溶解并冻干(180g)。纯化的LPS(75g)用无水肼于37℃摇动处理1小时以制备O-脱酰LPS(LPS-OH)。反应于冰浴中冷却，并逐渐加入低温丙酮(-70℃，5倍体积)以破坏剩余的肼，离心分离出沉淀的LPS-OH(60mg)。如上面所述，将该样品通过Bio-Gel P-2柱纯化。通过用1％乙酸(10mg/ml^-1，100℃，1.5小时)处理纯化的LPS(100mg)，随后离心(5000g)除去不溶的脂质A以分离出核心寡糖。用冻干的各组分通过Bio-Gel P-2柱进一步纯化冻干的OS(50mg)。将LPS-OH(20mg)用4N KOH在125℃处理16小时，中和后用前面所述的阴离子交换液相色谱分级，分离出完全脱酰的LPS(Vinogradov，E and Bock，K.1999)。

分析方法

通过GLC-MS糖被确认为是其糖醇乙酸酯衍生物(Sawardeker et al，1965)。将样品用4M三氟乙酸于100℃水解4小时，然后在水中还原(NaBD4)过夜，并以残留乙酸钠为催化剂用醋酸酐于100℃乙酰化2小时。GLC-MS配备有一个30 M DB毛细管柱(180℃到260℃，以3.5℃/min)，MS在VarianSaturn II型质谱仪上以电子碰撞模式进行。通过NaOH/DMSO/甲基碘方法(Ciucanu and Kerek，1994)进行甲基化分析，并通过上述的GLC-MS进行分析。绝对构型由丁基糖苷衍生物的GLC分析决定(St.Michael et al，2004)。

质谱法

ESI-MS用VG Quattro质谱仪(Micromass，Manchester，U.K.)以阴离子模式进行，直接注入含0.5％乙酸的25％乙腈水溶液中的样品。毛细管电泳(CE)-MS在Prince CE***(Prince Technologies，TheNetherlands)上进行，该***经由一个微型喷雾接口结合API 3000质谱仪(Applied Biosystem/Sciex，Concord，Canada)。以1pL/min的流速递送保护液(异丙醇-甲醇，2∶1)到具有低死体积的三通管(250μm i.d.，Chromatographic Specialties)中。所有水溶液在使用之前用0.45μm滤膜(Millipore)过滤。用一个电喷射不锈钢针(27号)邻接低死体积的三通管以使保护液的递送到毛细管柱的末端。用10mM乙酸铵/氢氧化铵、pH9.0、含有5％甲醇的去离子水溶液在约90cm长的空融硅毛细管上完成分离。在注射部位一般施用20kV的电压。使用一个激光钳(SutterInstruments)使毛细管的出口渐缩为约15μm i.d。在全质量扫描模式下，每1m/z单元步骤的驻留时间为3.0ms，即可获得质谱光谱。每1m/z单元驻留时间为1.0ms，得到MS/MS数据。在只有RF的四极碰撞室中，所选择的先驱离子与氮气碰撞活化形成碎片离子，通过扫描第三级四极对碎片离子进行质谱分析。

核磁共振

NMR实验使用5mm或3mm三重共振(¹H，¹³C，³¹P)探针，在Varian Inova400，500和600MHz光谱仪上完成。将冻干糖样品溶解于600μL(5mm)或140μL(3mm)的99％的D₂O中。上述实验在25℃下进行，以抑制4.78ppmHOD(氘化水)信号。丙酮的甲基共振作为在2.225ppm的¹H光谱和31.07ppm的¹³C光谱的内部参数。来自Varian，COSY，TOCSY，NOESY，¹³C-¹H HSQC，¹³C-¹H HSQC-TOCSY和¹³C-¹H HMBC的与标准同核和异核相关的2D脉冲序列被用于一般性归属。2D ¹H-³¹P HSQC实验在Varian Inova 400光谱仪上进行6小时完成。通过系列1D-HSQC实验在12Hz优化耦合常数。F2(¹H)维的扫描宽度为6.0ppm，F1(³¹P)维的扫描宽度为16.2ppm。在松弛延迟期，水预饱和延迟是1.5s，t2的取数时间是0.21s，在每隔180(HMQC)扫描的模式下，可获得32格。2D ¹H-³¹p HSQC-TOCSY实验与HSQC实验采用相同的参数在Varian Inova 400光谱仪上进行8小时，TOCSY混合时间为80ms。

实施例3，表1：来自于多杀性巴氏杆菌菌株Pm70的核心OS、O-脱酰和KOH处理的LPS的阴离子CE-MS和推测的组成。平均质量单位根据如下推测组成用于计算分子量：Hex，162.15；Hep，192.17；Kdo，220.18；HexNAc，203.19；HexN，161.15；PEtn，123.05。

菌株	[M-3H]3-	[M-2H]2-	观察到的分子离子	计算的分子离子	相对强度	推测组成
							Pm70核心OS	-829.8	1111.21173.11245.3	2224.42348.22492.5	2224.02347.02491.2	0.10.21.0	2HexNAc，4Hep，5Hex，Kdo2HexNAc，4Hep，5Hex，PEtn，Kdo2HexNAc，4Hep，6Hex，PEtn，aKdo
Pm70O-脱酰	1125.71132.91166.71173.81215.2	1689.31700.71750.41761.4-	3380.33402.53502.93524.63648.6	3378.23400.13501.23523.13646.2	0.10.30.21.00.2	2HexNAc，4Hep，5Hex，2Kdo，脂质A-OH2HexNAc，4Hep，6Hex，Kdo，P，脂质A-OH2HexNAc，4Hep，5Hex，PEtn，2Kdo，脂质A-OH2HexNAc，4Hep，6Hex，PEtn，Kdo，P，脂质A-OH2HexNAc，4Hep，6Hex，2PEtn，Kdo，P，脂质A-OH
							Pm70KOH	980.3973.3	1471.3-	2944.32922.9	2944.22922.8	1.00.2	6Hex，4HexN，4Hep，Kdo，4P5Hex，4HexN，4Hep，2Kdo，3P

实施例3，表2：对于来自于多杀性巴氏杆菌Pm70的完全脱酰(KOH处理的)LPS^a和核心OS^b的¹H-和¹³C-NMR化学位移。

	H-1	H-2	H-3	H-4	H-5	H-6	H-7	H-8	NOE’s
												α-GlcNa(A)	5.74(92.5)	3.46(55.0)	3.93(70.3)	3.52(70.6)	4.14(73.4)	4.313.89(70.1)			之间	内部	远程
-	3.46 H-2
			β-GlcNa(B)	4.89(99.9)	3.17(56.4)	3.91(72.6)	3.92(75.2)	3.78(74.7)	3.723.57(63.2)												4.31α-GlcN H-63.89α-GlcN H-6	3.91 H-33.78 H-5
Kdoa(C)	-	-										2.372.03(35.0)	4.62(71.1)	4.28(72.7)	3.83(73.0)	3.77(70.1)	3.973.72(64.5)	3.72β-GlcN H-63.57β-GlcN H-6
			Hep Ia(E)	5.19(100.1)	4.15(71.0)	4.03(74.1)	4.20(75.0)	4.20(72.4)	4.08(81.4)	4.083.92(63.7)											4.28 Kdo H-53.77 Kdo H-7	4.15 H-2
Hep Ib(E)	5.10(99.4)	4.02(70.6)										3.99(nd)	4.22(73.9)	nd(nd)	4.11(79.5)	3.863.73(62.1)		ndnd	4.02 H-2
			Hep IIa(F)	5.74(99.8)	4.34(79.8)	4.47(75.3)	4.09(66.6)	3.67(72.8)	4.09(69.4)	3.713.62(64.1)											5.23 Hep III H-14.03 Hep I H-3	4.34 H-2

Hep IIb(F)	5.87(99.4)	4.31(80.6)	4.41(76.3)	4.09(66.2)	3.67(72.3)	4.09(69.7)	ndnd(nd)	5.23 Hep III H-13.99 Hep I H-3	4.31 H-2
											Hep IIIab(G)	5.23(102.0)	4.06(71.7)	3.90(71.8)	3.87(67.2)	3.88(72.7)	4.06(70.6)	3.803.76(64.6)	5.87 Hep II H-14.31 Hep II H-2	4.06 H-2
β-Glc(Glc I)ab(I)	4.65c(104.2)	3.56(74.4)	3.41(78.2)	3.63(70.6)	3.53(74.9)	4.113.75(65.8)	-	4.22 Hep I H-44.11 Hep I H-6	3.53 H-53.41 H-3	5.22 Glc II H-1
											α-Glc(Glc II)ab(H)	5.22(101.9)	3.60(72.3)	3.83(73.1)	3.61(68.7)	3.93(71.7)	3.973.77(60.6)	-	4.11 Hep I H-6	3.60 H-2	4.65 Glc I H-1
Hep IVab(J)	5.12(100.2)	4.01d(70.1)	4.00(69.8)	4.15(78.0)	3.94(71.1)	4.31(80.1)	ndnd(nd)	4.11 Glc I H-63.75 Glc I H-6	4.01 H-2
											β-Glc(GlcIII)ab(K)	4.70(103.5)	3.36(74.3)	3.55(76.6)	3.44(70.6)	3.58(76.9)	3.963.76(61.7)		4.15 Hep IV H-4	3.55 H-33.58 H-5
3-Glc(Glc IV)ab(L)	4.69(104.4)	3.46(74.1)	3.71(75.2)	3.71(79.8)	3.70(75.7)	4.023.84(61.1)		4.31 Hep IV H-64.15 Hep IV H-4	3.71 H-33.70 H-5

β-Gal(Gal I)ab(M)	4.53(104.3)	3.61(71.8)	3.77(73.2)	4.07(78.4)	3.81(76.4)	3.933.86(61.4)	3.71 Glc IV H-4	3.77 H-33.81 H-5
										α-Gal(Gal II)a(N)	4.99(101.2)	4.07(68.8)	4.17(79.9)	4.32(69.9)	4.42(71.4)	3.723.72(61.2)	4.07 Gal I H-4	4.07 H-2	3.81 Gal I H-5
α-Gal(Gal II)b(N)	4.95(101.4)	3.93(68.7)	4.02(79.9)	4.29(69.9)	4.41(71.3)	3.713.71(61.4)	4.07 Gal I H-4	3.93 H-2	3.81 Gal I H-5
										β-GalN Ia(O)	5.01(101.3)	3.53(53.1)	4.20(74.3)	4.40(63.9)	3.80(76.2)	ndnd(nd)	4.17 Gal II H-3	4.20 H-33.80 H-5
β-GalNAc Ib(O)	4.73(103.7)	4.12(51.9)	3.84(75.7)	4.13(64.7)	3.67(75.9)	ndnd(nd)	4.02 Gal II H-3	3.84 H-33.67 H-5
										α-GalN IIa(P)	5.53(92.6)	3.65(51.5)	4.23(67.0)	4.07(68.8)	4.01(73.4)	3.823.82(62.1)	4.20 GalNAc I H-3	3.65 H-2
α-GalNAc IIb(P)	5.09(94.5)	4.24(50.4)	3.82(68.7)	4.03(69.3)	3.89(72.5)	3.823.82(61.8)	3.84 GalNAc I H-3	4.24 H-2	4.12 GalNAc I H-2

pEtnb	3.26(40.1)	4.16(62.2)
			CH3C＝Ob	2.06(22.4)
CH3C＝Ob	2.04(22.1)

^a来自KOH处理的LPS数据；^b来自核心OS样品的数据；^ab来自KOH处理的LPS和OS样品的数据，归属一致；除了来自KOH处理的LPS的残基I的^cH-1化学位移是4.60ppm和来自KOH处理的LPS的残基J的^dH-2化学位移是4.11ppm。

实施例3，表3.在多杀性巴氏杆菌基因组菌株Pm70中，LPS核生物合成的椎定糖基转移酶。

·多杀性巴氏杆菌基因	推定功能	最佳同源体	e-value
				M1305	Kdo to lipid Aa-2，6 Kdo转移酶	KdtA Hi(HI0652)KdtA Hd(HD0454)	e-152e-120
M1843	Hep I to Kdoα-1，5庚糖基转移酶	WaaC KpWaaC Ec	e-96e-94
				M1302	Hep I to Kdoα-1，5庚糖基转移酶	OpsX Hi(HI0261)	e-149
M1844	Hep II to Hep Iα-1，3庚糖基转移酶	RfaF Hi(HI1105)RfaF Hd	e-164e-139
				M1294	Hep III to Hep IIα-1，2庚糖基转移酶	OrfH Hi(HI0523)	e-127
M0223	PEtn to Hep II	Lpt3 Nm(NMB2010)	e-154
				M1306	G1c I to Hep Iβ-1，4葡糖基转移酶	LgtF Hi(HI0653)	e-108
M1144	Hep IV to Glc Iα-1，6庚糖基转移酶	LbgB AppLbgB Hd(HD1720)	e-93e-87
				M1143	Glc IV to Hep IVβ-1，6葡糖基转移酶	LbgA Hd(HD1721)LbgA App	e-74e-73
M1141	Gal I to Glc IVβ-1，4半乳糖基转移酶	Lic2a Hi(HI0550)	e-38
				M1139	Gal II to Gal Iα-1，4半乳糖基转移酶	LgtC Hi(HI0258)LgtC Nm	e-62e-59
M1140	GalNAc I to Gal IIα-1，3 N-乙酰半乳糖氨基转移酶	LgtD Hi(HI1578)	e-83

M1138	GalNAc II to GalNAc Iβ-1，3 N-乙酰葡萄糖氨转移酶	GTase App	e-62
				M0858	CMP-Kdo合成酶	HI0058	e-103
M0884	ADP-Hep焦磷酸化酶	HI1526	0
				M1289	UDP-Glc焦磷酸化酶(galU)	HI0812	e-145
M0286	UDP-Glc-4-异构酶(galE)	HI0351	e-173
				M1030	UDP-N-乙酰葡萄糖氨异构酶	HI0873	e-122

实施例4本实施例形成了在“Carbohydrate Research340，59(2005)”中一篇文献的基础。多杀性巴氏杆菌菌株VP161的脂多糖结构分析。

本实施例阐明了来源于多杀性巴氏杆菌菌株VP161的脂多糖结构。该脂多糖易于受到多种降解过程的影响。通过单糖和甲基化分析、NMR光谱及质谱建立起纯化产物的结构。如下的脂多糖结构是在这些实验的结合数据的基础上确定的，

其中，根据NMR数据，所有的糖都以吡喃糖环形式存在，Kdo代表2-酮-3-脱氧-辛酮糖酸，L-α-D-Hep代表L-甘油-D-甘露-庚糖，PPEtn代表焦磷酸乙醇胺，PCHo代表磷酸胆碱。有趣的是，当检测O-完全脱乙酰基的LPS时，很明显，在该分子的Kdo区域的排布中存在变化性。发现带有一个Kdo-P部分的糖型，以及具有Kdo-Kdo基团的糖型。此外，当存在两个Kdo残基时，Glc II残基没有连接到Hep I上，但是当Kdo-P排布很复杂时，Glc II残基则是连接到Hep I上的，这揭示出一种生化合成的不相容性，这种不相容性归结于空间位阻作用或者不合适的受体构象。在包括基因组株Pm70在内的，其他被研究的多杀性巴氏杆菌菌株中LPS的Kdo区也发现了这种变化。

多杀性巴氏杆菌(Pm)是革兰氏阴性菌，也是多个物种的病原体，会在可食用动物和人类中产生很严重的疾病。Pm菌是鸡或火鸡的禽霍乱，牛的出血败血症，猪的萎缩性鼻炎以及人的猫狗咬伤传染病的致病媒介。之前就已经识别出了一些Pm毒性因子，这些毒性因子包括血清组A和B的荚膜及LPS。然而，关于从Pm分离出来的LPS的内毒素性质，存在有互相矛盾的报告。从血清组B：2株分离出的被证明是内毒性的LPS，静脉注入LPS能在美洲野牛中产生出血性败血症的临床症状。但是，发现火鸡幼禽能相对抵抗从Pm血清组A株中分离的LPS的致死作用，尽管其炎症反应和显微镜观测的肝损伤与在哺乳动物宿主中所观察到的相似。与之相反的，发现鸡胚胎和小鼠对于Pm LPS的毒性作用高度敏感。

基于对LPS的抗体应答，Pm菌株可归类于Heddleston血清型，同时，针对热灭活Pm疫苗而产生的抗体主要用于抵抗LPS，并保护宿主抵抗具有相同血清型的菌株。早期研究表明，采用热酚/水方法纯化并被注射到小鼠和兔子体的LPS产生很弱的抗体应答，并且不产生抵抗Pm感染的保护作用，然而，相同的LPS注射到鸡体内，则诱导出很好的抗体应答，这种抗体应答能被动地保护接种者抵抗疾病。由血清型A菌株的LPS产生的单克隆抗体显示出具有杀菌性，并能够完全保护小鼠抵抗同源攻击。此外，抗Pm血清型B菌株LPS的调理性单克隆抗体，表现出能够部分保护小鼠抵抗Pm感染。

经过修饰的LPS结构无疑会影响Pm在生物体内的生存力。最近，辨别出了三株被大幅度减毒的Pm菌株VP161的突变体，每一个突变体在基因pm1294(命名为waaQpm)处都有一个单转座子***。该基因pm1294随后被证明用于编码庚糖基转移酶，该基因的突变产生高度截短的LPS结构。此外，Pm galE突变体之前就已经被构建出来，并在小鼠体内减毒，但没有其LPS结构分析被报导过。采用被荚膜抗原敏化的红血球进行的被动血球凝集试验，根据Pm荚膜抗原，将其分离株按血清型分组为5种血清型组A、B、D-F。血清组A(透明质酸)，D(肝素)和F(软骨素)的荚膜的结构信息是可获得的，所述透明质酸、肝磷脂和软骨素中的每一种都是已经被充分研究的粘多糖。体细胞(LPS)类型也可以用来鉴定细胞株，这里有两种主要报道过的***。Namioka***基于试管凝集实验，能够识别11种血清型；而Heddleston体系应用凝胶扩散沉淀反应，能够识别16种血清型，是目前的优选方法。

1981年，开始推荐使用一种鉴定多杀性巴氏杆菌血清型的标准***，该***利用字母A、D、E和F辨别Carter荚膜类型，同时利用数字辨别Heddleston体细胞类型。Pm表达不具有多聚体O-抗原的LPS分子，即所谓的粗糙型LPS。近来，我们分析了基因组菌株Pm70的LPS结构，该LPS结构展示出粗糙型LPS结构。该项研究也在另一种Pm菌株，即VP161(一种高毒性的血清型A：1菌株)上进行，以获得对PmLPS结构的启示，以及研究在菌株中的Kdo区域是否存在变异。之前，我们已经表征出VP161的庚糖基转移酶突变体的核心OS，这里我们报道LPS的完整结构，包括在LPS分子的Kdo区域的新型排布。

实验

培养基和培养条件

多杀性巴氏杆菌VP161在巧克力琼脂平板上于37℃初始生长16h，然后将培养物接种到1L脑心浸液(BHI)培养基，该脑心浸液(BHI)培养基添加有终浓度为5ug/ml的β-NAD(Sigma N-7400)，终浓度为5ug/ml的氯化血红素(Sigma H-2250)和1％葡萄糖(10g)。然后，将培养物在37℃、200rpm温育6h后，接种到发酵罐。然后，多杀性巴氏杆菌VP161在28L发酵罐内，在24L BHI肉汤中，在37℃、20％DO值条件下培养18h。加入苯酚到2％来杀死细胞，加入苯酚3h后加入1g透明质酸酶(RocheChemicals)并搅拌1h；之后，使用Sharples连续离心机(～210g)收获细胞。

脂多糖的分离、纯化和降解

将多杀性巴氏杆菌细胞(湿重约210g)冻干，得到约56g冻干细胞。为了提高LPS萃取效率，将冻干细胞用有机溶剂洗涤(1倍乙醇，2倍丙酮，2倍轻石油醚)去除脂质和其他亲脂性成分。洗涤后的细胞(从约42g得到10g)采用热酚/水方法进行萃取，水相合并并相对流水透析48h。将渗余物冻干，得到约1.6g，配制为2％水溶液，用DNA酶和RNA酶在37℃处理4h，接下来用蛋白酶K在37℃处理4h。透析除去小肽。冻干后，将透析物(约0.2g)配制为2％水溶液，8000g下离心15分钟(得约85mg的8K沉淀)，接着将上清液在100,000g下进一步离心5h。将含有纯化的LPS的沉淀重新溶解、冻干(得约17mg)。为了制备O-脱乙酰基LPS(LPS-OH)，将8K沉淀材料(约40mg)以无水肼在37℃搅拌处理1h。上述反应冰浴冷却，然后，逐步地，加入冷丙酮(-70℃，5倍体积)破坏过量的肼，通过将重新溶解的沉淀(约35mg)离心、冻干分离得到沉淀的LPS-OH。然后，样品以冻干的各组分通过Bio-Gel P-2柱进行纯化。以1％冰醋酸(10mg/ml，100℃，1.5h)分别处理8K沉淀材料(约45mg)和LPS(约17mg)，随后通过离心(5,000g)去除不溶的脂质A，分离得到核心寡糖(OS)。接着，采用与上述相同的过程，将来自8K沉淀的冻干OS样品通过Bio-Gel P-2柱进行进一步纯化。以4N KOH在125℃处理LPS-OH(约12mg)16h，可将完全脱酰的LPS分离出来；随后的中和产物可通过阴离子交换液相色谱分离。

分析方法

可通过GLC-MS以其糖醇乙酸酯衍生物的形式测定糖。在100℃用4M三氟乙酸水解样品4h，水解产物在水中用NaBD4还原16h；然后，以残留的乙酸钠为催化剂，用乙酸酐在100℃乙酰化2h。GLC-MS仪装备有30MDB-17毛细管柱(以3.5℃/min的速度从180℃升温到260℃)，MS在VarianSaturn II质谱仪的电子撞击模式下进行。通过NaOH/DMSO/甲基碘方法进行甲基化分析，并应用GLC-MS进行分析。绝对构象可通过丁基糖苷衍生物的GLC分析来确定。

质谱分析

直接将样品分散到含有0.5％乙酸的25％乙腈水溶液中，在VGQuattro质谱分析仪(Micromass，Manchester，U.K.)的阴离子模式下进行ESIMS分析。毛细管电泳(CE)-MS在Prince CE***(PrinceTechnolgies，The Netherlands)中进行，该Prince CE***通过一微喷雾接口与API 3000质谱分析仪(Applied Biosysten/Sciex，Concord，Canada)连接。保护液(异丙醇-甲醇，2∶1)以1μL/min的速度输送到一个具有低死体积的三通管(250μm i.d.，ChromatographicSpecialties)中。所有的水溶液在使用前经过0.45-μm滤膜(Millipore)过滤。一个不锈钢电子喷射针头(27号)邻接该低死体积的三通管，使保护液能够输送到毛细管柱的末端。使用pH9.0，含有5％甲醇的10mM乙酸铵/氢氧化铵的去离子水溶液作为洗脱液，在长约90cm的空融硅毛细管中完成分离。在注射部位一般使用20kY电压。使用激光钳(SutterInstruments)将毛细管的出口渐缩为15μm i.d。在全质量扫描模式下，每1m/z单元步骤的驻留时间设置为3.0ms，即可获得质谱光谱。每1m/z单元驻留时间设置为1.0ms，得到MS/MS数据。在只有RF的四极碰撞室中，所选择的先驱离子与氮气碰撞活化形成碎片离子，通过扫描第三级四极对碎片离子进行质谱分析。

核磁共振

NMR实验在使用一个5mm或3mm三重共振(¹H，¹³C，³¹P)探针，在VarianInova 400，500和600MHz光谱仪上进行。冻干的糖样品溶解于600μL(5mm)或者140μL(3mm)的99％D20中。该NMR实验在25℃下进行，以抑制在4.78ppm处的HOD(氘化H₂O)信号。丙酮在2.225ppm的¹H光谱和31.07ppm的¹³C光谱的甲基共振作为内部基准。来自Varian，COSY，TOCSY，NOESY，¹³C-¹H HSQC，¹³C-¹H HSOC-TOCSY和¹³C-¹H HMBC，与标准同核和异核的相关的2D脉冲序列被用于一般性归属。1D¹³P实验在一台扫描宽度为40ppm，20000transient，采集时间1.6s的Varian Inova 200光谱仪中进行。2D¹H-³¹P HSQC实验在Varian Inova 400光谱仪上进行6h。在10Hz通过进行一系列1D-HSQC实验来优化耦合常数。F2(¹H)维的扫描宽度为6.0ppm，F1(³¹P)维的扫描宽度为16.2ppm。松弛延迟期的水预饱和时间为1.5s，t2采集时间为0.21s，在每格180(HMQC)扫描的模式下，可获得32格。采用与HSQC实验相同的参数，2D¹H-³¹P HSQC-TOCSY实验在Varian Inova 400光谱仪下进行8h，其中TOCSY混合时间为150ms。

结果与分析

多杀性巴氏杆菌菌株VP161的研究

纯化的LPS和8K沉淀材料的糖分析结果显示，葡萄糖(Glc)，半乳糖(Gal)和L-甘油-D-甘露-庚糖(LD-Hep)的比例分别约为2∶1∶4。同时，也鉴定出到少量N-乙酰-葡糖胺(GlcNAc)。丁基-糖苷衍生的核心寡糖的GLC分析结果表明Glc和Gal均是D-型异构体。

LPS-OH可由发酵罐培养细胞的LPS制备得到，然后应用CE-MS对其进行分析(实施例4表1)。在m/Z为992.0，999.0和1040.0处观察到三价离子，对最小分子来说，这些三价离子对应于2PCho，4Hep，3Hex，2Kdo和羟基脂质A的组成。如下面所显示的那样，较大的糖型对应于这样的分子，该分子中磷酸分子替代第二个Kdo残基，在核寡糖上有多于一个的己糖残基；对于最大的糖型(m/z 1040.0)，则对应于在Kdo-P处有附加的PEtn残基。经巧克力琼脂平板培养之后，另外的糖型可通过m/z为1033.0和1081.0的三价离子显示出来(实施例4表1)。MS/MS分析结果显示，在糖型混合物中，发现了两种不同的羟基脂质A-OH类型，其是分子质量为952amu的基础类型，可根据MS/MS的m/z为475.5和951.5的二价和一价离子显示出来；另一种含有附加PEtn残基的类型，根据MS/MS的m/z为536.5的二价离子而被显示出来(图27C)。O-脱酰脂质A的基础类型(952amu)包括N-乙酰(3-OH C 14:0)葡糖胺残基的二糖，每一个残基都用一个磷酸分子取代。由于m/z为1033.0，1040.0和1081.0的三价离子的存在，较大的脂质A类型只有在平板生长细胞中才能观察得到。此外，根据糖型的MS/MS找到了存在一部分P-PEtn的证据，此与借助单价离子(m/z为219.5)的三价离子m/z1040.0和1081.0的相对应(图27c)。根据m/z为992.0，999.0和1033.0的三价离子的MS/MS没有发现这个离子。进一步的MS/MS试验显示了核心OS分子的大小。对于m/z为992.0的三价离子，如m/z为1012.5的二价离子所表明的那样，核心OS为2027amu(图27a)。这对应于2Kdo、2PCho、4Hep和3Hex的组成。对于m/z为999.0的三价离子，如m/z为1023.5的二价离子所表明的那样，核心OS为2049amu(图27b)。这对应于Kdo，P，2PCho，4Hep，3Hex的组合。对于m/z为1040.0的三价离子，如m/z为1084.5的二价离子所表明的那样，发现核心OS为2172amu，或者，如m/z为536.5的二价离子所表明的那样，推测核心OS为2049amu，其对应于带有附加PEtn残基的基础脂质A类型(图27C)。因此，如那两个用于识别m/z为475.5和536.5的两种脂质A类型的特征二价离子所证实的那样，m/z为1040.0的离子对应于异构糖型，该异构糖型在Kdo上具有部分P-PEtn或在脂质A上具有附加PEtn。在MS/MS分析中也观察到了从Kdo失去CO₂的证据，通常情况下均如此。

对核心寡糖(来源于LPS和8K沉淀材料，产生相同的光谱)单独进行的MS分析，显示出来源于m/z 903.0和984.0的二价正离子的不同碎片形式，这些二价正离子对应于实施例4表1中在m/z为902.0和983.0的二价负离子，这与最接近Kdo的庚糖残基(Hep I)上己糖残基的存在与缺失相一致。m/z 903的二价离子(图28a)的MS/MS显示了与在Hep I上缺失Hex残基相一致的碎片形式。m/z 984的二价离子(图28b)的MS/MS显示，与前者相比，较大的OS有附加己糖残基，该己糖残基位于Hep I残基上，这一点可通过m/z682.0的二价离子的存在，并且根据m/z 903.0的二价离子的MS/MS的该信号的消失但m/z 697.0的二价离子的出现来确定(图28a)。这些数据综合起来表明VP161 LPS产生了一组新糖型，一些糖型包含一个带有磷酸或者连接有焦磷酸乙醇胺部分的一种Kdo类型，以及包含两个Kdo分子的另一种。在包含两个Kdo分子的种类中，在核心OS最接近的庚糖残基上不存在己糖残基，这表明这种排布的生物合成是不可能的。PCho残基的位置也可通过这些在正离子模式下的MS/MS试验来确定。m/z为424.5的二价离子发现对应于2PCho、2Hex和Hep的组成，该二价离子的后继MS/MS/MS显示出分别与PCho-Hex和PCho-Hex-Hep相对应的m/z为328.5和520.5的一价离子，这表明两个PCho-Hex部分连接于Hep残基(图28c)。

为了确定分子的连接方式，对O-脱酰LPS(LPS-OH)进行了甲基化分析，结果显示末端Glc，6-取代的Glc，末端LD-Hep，2-取代的LD-Hep和4，6-二取代的LD-Hep以摩尔比约为1∶1∶1∶1的比例存在，同时，也发现了极少量的末端Gal，3，4-二取代的LD-Hep和3，4，6-三取代的LD-Hep。在为除去磷酸残基的HF处理过程之后(这些磷酸残基会在水解过程中阻碍磷酸化糖的最优释放)，重复进行甲基化分析，结果显示，除t-Gal残基之外，相同的糖以相同的比例存在，该t-Gal残基现在两倍于其他成分的量，这表明PCho残基取代了Gal糖基。

为了阐明OS的确切位置和连接方式，对那些能发出最具决定的和均一的光谱的OS部分进行了NMR研究。以那些结构相关的核心OS作为参考，所述核心OS来源于多杀性巴氏杆菌株Pm70以及相关的菌种(溶血性曼氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌)，通过COSY和TOCSY实验获得了OS样品的1H共振信号的归属(实施例4表2)。从最近公开的多杀性巴氏杆菌株Pm70来看，内核残基(Hep IV(f/f’))丝毫不差地连接于内核上，实施例4表2所列出的归属也与之相一致。然而，在VP161核心OS的HepII(b)的3-位没有PEtn残基。对于核心OS样品来说，有趣的是，在HepI(a)上GlcII残基(e)的存在与缺失会对余下的内核残基导致两组信号的辨别(图29)。如上所述，在4.64(d)和4.51(d’)ppm的两个Glc I信号可通过连接到HepI(a)的4-位和6-位的NOE识别出来，然而，当Glc II缺失时，在GlcII(e)和在4.51ppm处GlcI残基(d’)的端基异构体质子共振之间的NOE连接的消失鉴定出该GlcI(d’)残基的自旋***。反之，当GlcII存在时，GlcII(e)和在4.64ppm处GlcI残基(d)的端基异构体质子共振的NOE间连接的存在，则表征出该GlcI(d)残基的自旋***(图29)，先前就已经在Pm70和相关物种溶血性曼氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌的LPS中观察到了这种端基异构体NOE间的连接。采用这种方式，基于GlcII(e)的存在与缺失，归属余下的内核残基就成为了可能。在Hep IV(f/f’)上的己糖残基的位置与鉴定仍然还需要阐明。MS分析显示，两个己糖残基都取代有PCho残基，并且都取代到HepIV(f/f’)上。在HF处理之后进行的甲基分析中所确定的t-Gal量的增加证实了这一点，这表明支撑PCho的己糖残基都是Gal糖基。两个β构型的Gal残基(Gal I和GalII)，依靠它们的耦合常数以及H-4的特定旋转***，分别在4.70(g)和4.66(h)ppm处的核心OS样品中被识别出来。Gal I(g)和Gal II(h)在Hep IV(f/f’)上的连接位置可以通过NOESY实验推测出来，该NOESY实验显示GalI残基(g)连接在Hep IV(f)的4-位，Gal II残基连接到Hep IV(f/f’)的6-位(图29)。这种推测可以通过¹³C-¹H-HMBC实验得到证实，该¹³C-¹H-HMBC实验同时也证实在核心OS上的其他连接关系(图30)。为了确定两个PCho残基的位置，进行了³¹P-¹H-HSQC和³¹P-¹H-HSQC-TOCSY实验，结果确认事先归属的每一Gal残基的3-位是每一PCho残基的连接位置(图31)。这可以通过¹³C-¹H-HMQC实验得到证实，该实验确认每一在低磁场区(约78ppm)Gal残基的C-3原子的化学位移与磷酸化相一致。

为了进一步探索在分子的Kdo区域的新排布，对经KOH处理之后的脱乙酰基样品进行了测试。将含有一个和两个Kdo残基的完全脱乙酰基的LPS部分分离出来，这是能够做到的(图32a和b)。图32清楚无误地显现存在有包含糖型的一个和两个Kdo残基，与在图32b中两组横轴和纵轴质子信号(z3e，z3a、z’3e和z’3a)相比，对于图32a中Kdo的H-3质子只有一组横轴和纵轴信号是可见的。对于包含样品的一个Kdo残基来说，完整的归属是可能的，但是，由于只能获得极少量的这种糖基，导致很微弱的光谱信号，对于包含样品的两个Kdo残基来说，仅仅部分归属是可能的。然而，这两个光谱信号端基异构体区域的基础研究(rudimentary examination)明白无误地显示，在图32a中，存在Glc II残基(e)信号(这里，仅存在一个Kdo残基)；在图32b中，不存在Glc II残基(e)的信号(这里，存在两个Kdo残基)。正如核心OS数据所显示的那样，Glc II残基的存在或缺失会影响几个其他端基异构体质子共振的化学位移，特别是，Hep I(a)，Hep II(b)和Glc I(d)信号的化学位移，这与对内核分子构象的影响相吻合。包含糖型的一个Kdo残基的归属列于实施例4表2，这确认了基于核心OS样品的归属，并且可以将其扩展到包括含有一个Kdo残基的糖型的Kdo-脂质A区域在内的归属。

多杀性巴氏杆菌(Pm)VP161株寡糖的结构分析显示了一种与之前已确定的LPS核心寡糖结构具有相似性和差异性的结构，这些核心寡糖结构是针对Pm的基因组菌株Pm70和其他相关物种溶血性曼氏杆菌(Mh)，胸膜肺炎放线杆菌(Ap)的。在每种情况下，核心OS包含一个连接到Kdo残基上的等同连接的三庚糖单元。有趣的是，在Pm70中，Hep II残基的3-位多数情况都被PEtn残基所取代，而在VP161菌株和其他相关物种App和Mh中，则没有发现内核PEtn残基。排除以PEtn取代HepII这点变化，Pm菌株与相关的家畜物种Mh和App享有一个相对保守的内核结构。Pm内核结构的仅有的其他区别是，与在App和Mh中所遇到的D-甘油-D-甘露构型的庚糖残基相比，L-甘油-D-甘露构型的庚糖残基位于HepI的GlcI残基的延伸，以及Pm内核GlcII残基的存在是可变的，很显然这是由分子Kdo区域的变化性造成的Pm。在App和Mh的内核LPS中化学定量地发现了该GlcII残基。在VP161菌株中发现了在该保守内核区域的不同延伸，由此，HepIV残基被在4-位和6-位的PCho-Gal的部分双取代。据我们所知，以前还没有观察到这种结构排布。在同一LPS分子中碰到两个PCho残基，这是很少见的；非典型Hi携带菌株11和16是这种排布的仅有的文献记载例子。PCho残基的存在可能关系到Pm生物体的毒性，文献已经报道了PCho在呼吸道中的附着和集群作用。同时也发现，菌株VP161的突变体在小鼠模型和鸡中都被减毒，该突变体呈现出缺失两个PCho残基的被截短的LPS结构。其他作者的早期研究也发现了在Pm血清型D菌株的galE突变体毒性上的降低，可能由于LPS结构的改变所造成的。然而，VP161 LPS结构最吸引人的地方就是所发现的Kdo区域变异，在该Kdo区域已经发现到了包含一个Kdo和两个Kdo的糖型。此外，由Kdo区域排布变化所导致的对内核结构的影响，即HepI上Glc II的存在或者缺失，是令人感兴趣的。负责GlcII向Hep I残基转移的α-1，6葡糖基转移酶目前并不为人所知。需要指出的是，在Pm基因组菌株Pm70中仅识别出Kdo转移酶的唯一同源物，该Pm菌株的LPS同样包含带有一个和两个Kdo的种类的群组。有趣的是，通过比较来源于Pm、App和Mh的Kdo转移酶的基因序列，以探究任何序列上的差异以及探究其它的调控因子涉及所述的变异，上述序列上的差异可归因于Pm转移酶的双官能特性PmPmMh。本研究确定了第二种Pm菌株的LPS结构，这两种菌株具有相似的内核结构以及可变的外核修饰，并且都在分子的Kdo区域展示出有趣的变异，这种变异的重要性需要进一步研究。

实施例4，表1：来自多杀性巴氏杆菌菌株VP161的O-脱酰LPS(LPS-OH)和核心OS的阴离子CE-MS数据和推测组成。平均质量单位根据如下推测组成用于计算分子量：Hex，162.15；Hep，192.17；Kdo，220.18；PEtn，123.05；Lipid A-OH，952.00。

菌株	[M-3H]3-	[M-4H]4-	观察到的分子离子	计算的分子离子	脂质A大小	核心OS大小	推测组成
								VP161LPS-OHVP161核心OS	992.0999.01033.01040.01040.01081.0	744.0749.0774.0780.0780.0810.0[M+2H]2+901.8982.9	2979.52999.53101.03123.53123.53245.01805.61967.8	2977.62999.53100.73122.63122.63245.61805.41967.6	952952107595210751075--	2025.62047.52025.72170.62047.62170.6	2PCho，3Hex，4Hep，2Kdo，脂质A-OH2PCho，4Hex，4Hep，Kdo-P，脂质A-OH2PCho，3Hex，4Hep，2Kdo，脂质A-OH2PCho，4Hex，4Hep，Kdo-P-PEtn，脂质A-OH2PCho，4Hex，4Hep，Kdo-P，脂质A-OH2PCho，4Hex，4Hep，Kdo-P-PEtn，脂质A-OH2PCho，3Hex，4Hep，Kdo2PCho，4Hex，4Hep，Kdo

实施例4，表2：对于来自于多杀性巴氏杆菌VP161的核心OS和完全脱酰(KOH处理的)LPS的1H-和¹³C-NMR化学位移。^aKOH处理的LPS数据是来自包含Kdo残基的糖型；^b核心OS样品的数据；^abKOH处理的LPS和OS样品的数据，归属一致。由于Pcho残基的水解和迁移引入的相当大的异源性，因而不包括来自GaI-I和GaI-II的KOH处理的LPS的数据。

	H-1	H-2	H-3	H-4	H-5	H-6	H-7	H-8	NOE’s
												α-GlcNa(x)	5.75(92.7)	3.47(55.1)	3.93(70.5)	3.53(70.7)	4.13(73.7)	4.313.90(70.2)			之间	内部	远程
			β-GlcNa(y)	4.88(100.0)	3.17(56.6)	3.92(72.8)	3.94(75.3)	3.78(74.9)	3.753.59(63.4)
Kdoa(z)	-	-										2.372.06(35.0)	4.62(71.2)	4.29(72.9)	3.84(nd)	3.77(70.3)	3.963.72(64.6)

Hep-Ia(a)	5.18(100.4)	4.13(71.3)	4.01(75.2)	4.19(75.2)	4.19(72.8)	4.11(81.5)	ndnd(nd)	4.29 Kdo H-5	4.09 H-2
											Hep-Ib(a)	5.07(101.9)	4.09(71.3)	3.96(73.9)	4.20(74.7)	3.78(72.9)	4.13(80.3)	3.883.75(62.9)	nd	4.09 H-2
Hep-Ib(a’)	5.01(101.4)	4.15(71.3)	4.04(73.9)	4.26(74.2)	nd(nd)	4.05(nd)	ndnd(64.2)	nd	4.15 H-2
											Hep-IIa(b)	5.62(100.7)	4.26(80.8)	3.90(70.9)	3.90(67.8)	3.63(72.4)	4.07(69.7)	3.723.62(64.6)	5.14 Hep III H-13.96 Hep I H-3	4.19 H-2	3.75 Hep I H-5
Hep-IIb(b)	5.70(100.1)	4.19(80.5)	3.86(70.7)	3.84(67.6)	3.55(72.8)	4.05(70.3)	3.763.65(64.5)	5.14 Hep III H-13.96 Hep I H-3	4.19 H-2	3.75 Hep I H-5

Hep-IIb(b’)	5.76(99.7)	4.17(80.5)	3.85(70.7)	3.83(67.6)	3.60(72.8)	4.05(70.3)	3.763.65(64.5)	5.11 Hep III H-14.04 Hep I H-3	4.17 H-2	3.76 Hep I H-5
											Hep-IIIab(c)	5.11(102.4)	4.01(71.4)	3.87(70.8)	3.83(67.0)	3.78(71.6)	4.05(70.3)	3.773.65(64.9)	5.76 Hep II H-14.17 Hep II H-2	4.01 H-2	3.94 Hep IV H-33.59 Glc I H-4
Hep-IIIb(c’)	5.14(102.4)	4.02(71.4)	3.87(70.8)	3.83(67.0)	3.78(71.6)	4.05(70.3)	3.773.65(64.9)	5.70 Hep II H-14.19 Hep II H-2	4.02 H-2	3.94 Hep IV H-33.57 Glc I H-4
											β-Glc-Iab(d)	4.64(104.3)	3.54(74.2)	3.40(77.6)	3.59(70.5)	3.51(74.6)	4.093.76(65.8)	-	4.20 Hep I H-44.13 Hep I H-6	3.51 H-53.40 H-3	5.20 Glc II H-1
β-Glc-Ib(d’)	4.51	3.53	3.42	3.57	3.57	4.05	-	4.26 Hep I H-4	3.57 H-5

	(104.2)	(74.2)	(77.7)	(70.5)	(74.7)	3.83(65.6)		4.05 Hep I H-6	3.42 H-3
											α-Glc-IIab(e)	5.20(102.6)	3.58(72.8)	3.81(73.8)	3.58(69.4)	3.91(72.4)	3.933.74(60.4)	-	4.13 Hep I H-6	3.58 H-2	4.64 Glc I H-1
Hep-IVab(f)	4.95(99.9)	4.17(70.1)	3.93(71.0)	4.19(77.2)	3.91(70.3)	4.32(79.9)	3.973.75(64.0)	4.09 Glc I H-63.77 Glc I H-6	4.17 H-2
											Hep-IVb(f’)	4.93(99.9)	4.16(70.1)	3.93(71.0)	4.19(77.2)	3.91(70.3)	4.32(79.9)	3.973.75(64.0)	4.04 Glc I H-63.83 Glc I H-6	4.16 H-2
β-Gal-Ib(g)	4.70(103.2)	3.69(71.0)	4.19(78.5)	4.12(68.6)	3.80(75.7)	ndnd(nd)	-	4.19 Hep IV H-4	4.19 H-33.80 H-5

β-Gal-IIb(h)	4.66(104.5)	3.73(71.0)	4.18(78.5)	4.11(68.6)	3.76(75.5)	ndnd(nd)	4.32 Hep IV H-6	4.18 H-33.76 H-5
									PCho-I	4.38(60.4)	3.68(66.8)	3.22(54.7)
PCho-II	4.38(60.4)	3.68(66.8)	3.21(54.7)

实施例5本实施例形成了Carbohydrate Research 340，1253(2005)中一篇文献的基础。来自多杀性巴氏杆菌菌株X73的核心寡糖的结构分析。

本实施例中，阐明了来自多杀性巴氏杆菌菌株X73的脂多糖的核心寡糖的结构。该脂多糖经过多种降解过程。通过单糖和甲基化分析，NMR谱和质谱，可建立起纯化后的寡糖的结构。下述结构显示与最近从另一个多杀性巴氏杆菌菌株VP161中识别到的寡糖相似的结构，但是它有另外的磷酸乙醇胺部分对末端半乳糖残基的对称性取代，

其中，根据NMR数据，所有的糖都被发现是吡喃糖环形式，Kdo是2-酮-3-脱氧-辛酮糖酸，L，D-α-Hep是L-甘油-D-甘露-庚糖，PEtn是磷酸乙醇胺和PCho是胆碱磷酸。

多杀性巴氏杆菌(Pm)是革兰氏阴性菌，也是多个物种的病原体，会在可食用动物和人类中产生很严重的疾病。对基因组菌株Pm70和一种毒性血清型A：1菌株VP161中的脂多糖(LPS)进行结构分析，显示出一个带有变化的外核OS结构的保守内核寡糖(OS)结构。这项研究在另外的一种毒性血清型A菌株X73上进行，纯化的LPS产物的结构分析，显示出一个与菌株VP161相似的OS结构，但在外核OS上带有额外的对称磷酸化型式。菌株X73中的纯化的LPS和8k沉淀材料的糖分析，显示出与菌株VP161有相似的组成，该菌株中含有的糖，即葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)和L-甘油-D-甘露庚糖(LD-Hep)各自近似比例为2∶1∶4。O-脱酰LPS(LPS-OH)经发酵培养的细胞中制得，并经CE-MS分析(实施例5表1)。观察到与在菌株VP161中观察到的相似的质谱图样，但其主要成分为m/z1081.0的三价离子，与来自VP161 LPS-OH的多数种类(m/z 999.0)相比，它对应于另外两个PEtn残基。MS/MS分析显示出所有脂质A分子是基础种类，包括一个N-酰化(3-OH C 14:0)葡萄糖胺残基的二糖，每一个残基被磷酸分子所取代，通过m/z 475.5和951.5的二价和一价离子确定该磷酸分子的分子量为952amu。所以该MS/MS分析表明了菌株X73的额外PEtn残基位于LPS分子的核心OS区域中，核心OS分子的推测的质谱表示在实施例5的表1。

对核心寡糖单独进行MS分析，显示了一系列的离子与从LPS-OH数据推测得到的组成相一致，在与菌株VP161比较时显示存在额外的PEtn残基。采用阳离子模式从MS/MS实验可确定PEtn残基的位置。与最大糖型相应的二价离子m/z 1108的破碎产生的离子，包括m/z 183.5⁺(Pcho)，450.5⁺(PCho-Hex-PEtn)，547.5²⁺(2Pcho，2PEtn，2Hex，Hep)和916.5²⁺(M-Kdo-Hex)。在m/z547.5²⁺处的二价离子在与菌株VP161中m/z 424²⁺二价离子作比较时有特别之处，因为它显示出一个具有较高质量246amu的糖型，与两个PEtn残基的存在一致。对m/z 916.5²⁺二价离子进行MS/MS/MS分析，显示产物离子光谱示于图33a。图33a中的破碎模式PEtn残基定位于HepIV残基上的末端HEX-Pcho部分，后续的破碎m/z 450.5离子的MS/MS/MS实验中(图33b)，证实该离子与最初推断的PCho-Hex-PEtn部分相一致。

为了证实和扩展这些推测，对分级的核心OS样品进行NMR实验，该样品包含有两种PEtn残基(由未显示的MS数据确定)。除了两个末端半乳糖残基外，所有归属与在菌株VP161的核心OS获得的相同。观察到VP161样品的半乳糖残基的H-1和H-2共振的化学位移，但是H-3和H-4共振向低场区轻微漂移，分别从4.17和4.12漂移到4.21和4.17ppm。之前观察到从半乳糖残基的NOE间连接，尽管现在在3.94ppm处观察到至H-5残基的NOE内连接(与菌株VP161的3.80和3.76ppm相反)(实施例5表2)。为了证实这两个PEtn残基的位置，可通过一个³¹P-¹H-HSQC实验来完成，证实在4.07ppm处有一共振作为每一PEtn残基的附着点，后续的³¹P-¹H-HSQC-TOCSY实验证实在3.94ppm处半乳糖残基的H-5共振(图34)。4.07ppm归属半乳糖残基H-6共振是通过¹³C-¹H-HMQC实验被确认，这表明作为a-CH₂部分的一个特征正峰，在低区值(～65ppm)的每个Gal残基的C-6原子的低磁场化学位移与磷酸化一致。最后，³¹P-¹H-HSQC-TOCSY实验证实在C-6和H-5共振(也可以说是H-5和C-6共振)的交叉峰，证实两个半乳糖残基的6位作为在菌株X73核心OS发现的额外两个PEtn部分的附着点(图35)。

所以这项研究证实了来自又一个血清型A菌株的LPS中的相似核心OS结构。进一步研究将扩展LPS结构分析到另外的血清型，来检验这异常的终端结构是否存在与其它血清型中。在六碳糖的6位上PEtn的证实多少不寻常。PEtn通常在脑膜炎双球菌和流感杆菌的庚糖残基6位上发现。我们实验室最近的研究已经证实PEtn在许多流感杆菌菌株的终端GalNAc残基的6位处，新近的报道也发现在柠檬酸细菌属样品的3-连接位的半乳糖分子的6位上的PEtn残基。在这里观察到带有相似化学位移的PCM1443(血清型039)。

1、实验

1.1细菌的培养，LPS的分离和分级

多杀性巴氏杆菌菌株X73(NRCC#6235)培养并分离。简言之，将多杀性巴氏杆菌细胞(～210g湿重)冻干，得到～65g。冻干细胞用有机溶剂(1×乙醇，2×丙酮，2×轻石油醚)清洗以除去类脂和其它亲脂成分，增强LPS提取效率。洗过的细胞(从～42g中取10g)通过热酚/水方法提取，并将水相合并，相对流水透析48小时。渗余物冻干得到～0.57g，制成约2％的水溶液，在37℃用DNA酶和RNA酶处理4小时，接着用蛋白酶K在37℃处理4小时。小肽经透析除掉。冻干后，渗余物(～0.42g)制成约2％的水溶液，在8000g离心15分钟(得到一种约～265mg的“8K沉淀”)，接着对上清进一步在100,000g离心5h。包含有纯化过的LPS的沉淀重新溶解和冻干(得到～3mg)。分离和分级出LPS-OH和核心OS。简言之，8K沉淀原料(～15mg)和LPS(～3mg)在37℃搅拌下用无水肼处理1h，制备LPS-OH，从8K制备物中得到～10mg，从LPS中为～1mg。用1％乙酸(10mg/ml，100℃，1.5h)处理8K沉淀原料(～115mg)，后经离心(5,000x g)去除不溶类脂A，分离出核心OS。随后将冻干的上清液以各冻干组分用Bio-Gel P-2柱进一步纯化，得到～40mg。

1.2分析方法

糖以其糖醇乙酸酯衍生物的形式通过GLC-MS测定。甲基化分析通过NaOH/DMSO/甲基碘方法进行，并用GLC-MS来分析。

1.3质谱和NMR光谱学

所有质谱和NMR实验按上面的描述完成。

实施例5，表1：来自多杀性巴氏杆菌菌株X73的O-脱酰LPS(LPS-OH)和核心OS的阴离子CE-MS数据和推测的组成。平均质量单位根据如下推测组成用于计算分子量：Hex，162.15；Hep，192.17；Kdo，220.18；PEtn，123.05；Pcho，165.05；脂质A-OH，952.00。相对强度表示为相对于LPS-OH分子光谱中最大的三价离子的强度。

菌株	[M-3H]3-	[M-4H]4-	观察到的分子离子	计算的分子离子	相对强度	脂质A大小	核心OS大小	推测组成
									X73	992.0	744.0	2979.5	2977.6	0.1	952	2025.6	2PCho，3Hex，4Hep，2Kdo，脂质A-OH
LPS-OH	999.01033.01040.01074.01081.01122.0	749.0774.0780.0805.0810.0841.0	2999.53101.03123.53224.13245.03368.5	2999.53100.73122.63223.73245.63368.7	0.20.20.40.31.00.2	952952952952952952	2047.52148.72170.62271.72293.72416.7	2PCho，4Hex，4Hep，Kdo-P，脂质A-OHPEtn，2PCho，3Hex，4Hep，2Kdo，脂质A-OHPEtn，2PCho，4Hex，4Hep，Kdo-P，脂质A-OH2PEtn，2PCho，3Hex，4Hep，2Kdo，脂质A-OH2PEtn，2PCho，4Hex，4Hep，Kdo-P，脂质A-OH3PEtn，2PCho，4Hex，4Hep，Kdo-P，脂质A-OH
									X73核心OS	[M-3H]3-	[M-2H]2-

-----736.8

901.3962.8982.81024.31044.31106.3

1804.61927.61967.62050.32090.62214.0

1805.21928.21967.62051.32090.62213.7

------

------

2PCho，3Hex，4Hep，KdoPEtn，2PCho，3Hex，4Hep，Kdo2PCho，4Hex，4Hep，Kdo2PEtn，2PCho，3Hex，4Hep，KdoPEtn，2PCho，4Hex，4Hep，Kdo2PEtn，2PCno，4Hex，4Hep，Kdo

实施例5，表2：来自多杀性巴氏杆菌菌株X73的核心OS的末端区域的¹H-和¹³C-NMR化学位移：所有其他残基具有与菌株VP161相同的化学位移。

残基	H-1	H-2	H-3	H-4	H-5	H-6	H-7	NOE连接性
										Hep IV	4.95(99.9)	4.18(70.0)	3.96(70.9)	4.18(77.4)	3.93(70.2)	4.32(79.9)	3.973.75(63.5)	之间	内部
4.09 GlcI H-63.77 GlcI H-6	4.18 H-2

β-Gal I	4.72(103.4)	3.70(70.7)	4.20(78.2)	4.17(68.2)	3.94(74.0)	4.074.07(65.4)	-	4.18 HepIV H-4	4.20 H-33.93 H-5
										β-Gal II	4.70(104.5)	3.73(70.7)	4.21(78.1)	4.17(68.2)	3.94(74.0)	4.074.07(65.4)	-	4.32 HepIV H-6	4.21 H-33.93 H-5
PEtn I	4.13(62.7)	3.31(40.8)
										PEtn II	4.13(62.7)	3.31(40.8)
PCho I	4.38(60.4)	3.68(66.8)	3.22(54.7)
										PCho II	4.38(60.4)	3.68(66.8)	3.21(54.7)

实施例6本实施例形成了Infect.Immun.72：3436(2004)中一篇文献的基础。一种多杀性巴氏杆菌的庚糖转移酶突变株产生一个截短的脂多糖(LPS)结构，并且其毒性减弱。

对多杀性巴氏杆菌VP161的野生型LPS分析表明一个“粗糙型”LPS，与从流感杆菌、杜克雷嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌以及N.Gonorrhoeae等革兰氏阴性粘膜性病原体分离出的LPS或脂寡糖相似，只有一个短的非重复多糖单元与脂质A相连。多杀性巴氏杆菌LPS的内核结构与流感杆菌、溶血性曼氏杆菌、杜克雷嗜血杆菌相似，并具有一个经由一个KDO残基与脂质A相连的三庚糖单元(图30)。在AL251突变株中，waaQpm的失活导致LPS表达为在内核区缺乏第三庚糖分子(Hep III)的高度截短的LPS。突变株中含量最高的LPS糖型同样缺少第一个庚糖远侧的所有糖，表明waaQPM的失活阻止了糖的进一步添加。因此很可能由于第三庚糖的缺失导致的LPS中间体的构像改变大大阻碍了后续转移酶的活性。

材料和方法

菌株，质粒，培养基与培养条件。本研究中使用的菌株与质粒见实施例6，表1。大肠杆菌(Escherichia coli)采用常规Luria-Bertani培养基培养。多杀性巴氏杆菌菌株采用脑心浸液(BHI)或营养肉汤(NB)培养基(加入3％酵母抽提物)(Oxoid，Basingstoke，United Kingdom)的营养培养基培养。添加1.5％琼脂制备固体培养基。需要时，向培养基中加入2.5μg/ml浓度的四环素。在结构研究中，多杀性巴氏杆菌菌株VP161和AL251培养于28升发酵罐中24L的BHI培养基中，37℃下，20％的DO饱和度下培养18h。添加苯酚到2％以杀灭细胞，维持3h后加入1克透明质酸酶(Roche Chemicals)，搅拌1h，然后采用Sharples连续流离心机收获细胞。

转座子稳定性研究。多杀性巴氏杆菌菌株AL251于培养10ml NB中，37℃震荡。在培养大约10，34，58代后，取出培养样品，适当稀释，接种于NB琼脂上。温育过夜后，100个克隆转接于含四环素的NB上，37℃温育过夜。转座子丢失由四环素敏感克隆的百分比来表示。

SDS-PAGE与银染。LPS的分析采用Bio-Rad小型蛋白凝胶装置，按照在Laemmli，Nature  227，680(1970)文中描述的SDS-PAGE进行。通过银染后可见LPS。

DNA操作。限制性消化，连接和聚合酶反应按照厂商NEB(Beverley，MA)或Roche Diagnostics GmbH(Mannheim，Germany)提供的酶操作者手册进行。质粒DNA采用碱解法制备，使用Qiagen柱(QIAGEN GmbH，Germany)或PEG沉淀法(Ausubel，1995)进行纯化。基因组DNA采用CTAB方法制备。DNA的PCR扩增使用Taq DNA聚合酶或Expand High Fidelity PCR***(Roche Diagnostics)，使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化。研究中使用的寡核苷酸列于实施例6，表1。DNA序列采用373 A型DNA测序仪(Applied Biosystems)测定，使用Sequencher Version 3.1.1(GenCodes，Ann Arbor，MI)软件分析。

waaQpM的反向互补。从多杀性巴氏杆菌VP161的基因组DNA中使用寡核苷酸片段BAP2146和BAP2147(实施例6，表1)扩增完整的waaQpM基因。扩增后的1.1kb的DNA片段连接Sail和BamHI-消化的质粒载体pAL99(实施例6，表1)，所以转录可被多杀性巴氏杆菌tpiA启动子驱动，筛选出存在正确质粒的E.Coli转化株，同时，指定的pAL170质粒被用于转化多杀性巴氏杆菌AL251菌株，产生菌株AL298。pAL99质粒载体被单独转化AL251产生菌株AL438用作对照(实施例6，表1)。

竞争性生长分析。竞争性生长分析按照Harper(2003)描述的方法进行并定量多杀性巴氏杆菌LPS突变株AL251和互补突变株AL298的相对生长速率。从输出培养(output culture)获得的(在体外或在体内)四环素抗性克隆百分比除以从输入培养(input culture)获得的四环素克隆百分比确定竞争因子(CI)。衡量体内生长与体外生长差异的相对竞争因子(rCI)，由体内CI除以体外CI确定。通过使用单边z-test(one sidedz-test)(p＜0.05)统计分析，如果rCI值显著小于1.0，则突变株被确定为减毒突变株。

毒性试验。一组十只12周龄的购得的Leghorn-cross鸡使用多杀性巴氏杆菌VP161或AL251，以两个不同剂量胸肌注射100μl进行感染。在感染AL251后的不同时间点取血样，并依照动物伦理道德要求对被认为不能存活的鸡实施安乐死。血样用含肝素的BHI稀释两倍并涂布BHI平板。从血中分离的多杀性巴氏杆菌克隆涂布于NB琼脂平板和含四环素的NB琼脂平板。

血清敏感性分析。多杀性巴氏杆菌和E.coli对新鲜鸡血清的敏感性采用Chung et al于Infect.Immun.69，2487(2001)中所述的方法测定。.

LPS的纯化。多杀性巴氏杆菌细胞(210g，VP161；254g of AL251)冻干，得56g的VP161和52g的AL251。用有机溶剂洗涤冻干菌体细胞除去脂类或其他亲脂类成分以提高LPS的抽提效率。洗涤后的细胞(42g，VP161；50g，AL251)用热酚/水法抽提并相对流水透析48h。渗余物冻干，配成2％水溶液后，用DNA酶和RNA酶在37℃条件下处理4小时后，加入蛋白酶K并在37℃下处理4小时。透析除去小肽。冻干后，渗余物配成2％水溶液，8000g离心15分钟后，取上清，100,00g离心5小时。含纯化LPS的沉淀，重溶并冻干。用1％乙酸(10mg/ml，100℃，1.5h)处理纯化的LPS，然后5000g离心除去不溶的脂质A分离得到核心寡糖(OS)。

分析方法。糖通过它们的糖醇乙酸酯衍生物的GLC-MS被确定。LPS用4M三氟乙酸在100℃水解4小时，用NaBD4水溶液还原过夜，然后用乙酸酐在残余的乙酸钠催化下100℃乙酰化2小时。GLC-MS采用30 M DB-17毛细管柱(以3.5℃/min，180℃到260℃)，质谱使用Varian Saturn II质谱仪电子撞击模式。甲基化分析采用NaOH/DMSO/甲基碘方法，并用上述的GLC-MS分析。

MS分析。毛细管电泳-电喷射离子MS(CE-ESI-MS)采用晶体Model 310毛细管电泳(CE)设备(AYI Unicam)进行，该设备经由一个微喷雾接口偶联到API 3000质谱仪(Perkin-Ehner/Sciex)。保护液(异丙醇-甲醇，2∶1)，以1L/min流速加入到一低死体积三通管(250μm i.d.，Chromatographic Specialties)。所有水溶液用前经0.45-μm(Millipore)过滤器过滤。

核磁共振。使用3mm三重共振(¹H，¹³C，³¹P)探针，在Varian Inova500MHz光谱仪上获得NMR谱。亲脂性的糖样品溶解在140μL(3mm)99％D2O中。实验在25℃下进行，以抑制在4.78ppm处的HOD(氘化H2O)信号。丙酮的甲基共振作为在2.225ppm的¹H光谱和31.07ppm的¹³C光谱的内部或外部基准。来自Varian、COSY、TOCSY、NOESY、¹³C-¹H HSQC、¹³C-¹HHSQC-TOCSY和¹³C-¹H HMBC的、与标准的同核和异核相关的2D脉冲序列，用于一般性归属。

结果

减毒的多杀性巴氏杆菌STM突变株产生截短的LPS，该LPS通过与功能性waaQpM基因互补可恢复产生全长的LPS。标记标签的突变株(STM)被用于鉴定减毒突变株，以便用于在小鼠和鸡中培养。在前述的分析中一个突变株被鉴定(命名为AL251)，它在鸡和小鼠中都表现为弱毒性。突变株的序列分析表明单个转座子***在waaQpM基因中，该waaQpM基因被预言负责编码所推测的庚糖基转移酶和一种负责添加庚糖到LPS上的糖基转移酶。

我们使用聚丙烯酰胺凝胶电泳然后银染的方法比较了来自菌株AL251、AL251的野生型亲本VP161以及互补突变株AL298的LPS结构。来自AL251的LPS在凝胶中相对于野生型LPS迁移更远，这表明由突变株产生的LPS被显著缩短(图36a)。而且，来自互补突变株AL298的LPS，与野生型LPS迁移速度相同表明突变株AL251与一个完整的waaQPM基因互补能恢复野生型LPS的合成(图36a)。

与waaQ_pM互补的AL251菌株的体内生长恢复到野生型水平。由于waaQpM基因的互补，AL251菌株恢复产生野生型LPS，因此我们想确定是否互补失活的waaQPM也能在体内恢复AL251突变株的到野生型生长水平。关于互补突变株AL298的前期研究表明，一旦去除对该互补质粒pAL170的抗生素选择，该质粒就会显著减少(6小时后剩余44％)。因此，选择小鼠代替鸡进行竞争性生长分析，如之前研究所阐述的，从所需感染时间到收获菌体只要6小时而鸡感染则要超过12小时。三只小鼠被注射等量的VP161与互补株AL298的混合物。作为对照，两只小鼠被注射等量的野生菌株VP161与对照菌株AL438(AL251带有载体质粒pAL99)的混合物。互补突变株AL298的平均rCI为1.0，能与野生型菌株VP161平等竞争，而对照菌株AL438的平均rCI值为0.57(p＝0.03)，与前面报道的AL251在小鼠中的rCI值相似。这些结果表明waaQpm不仅为产生全长的LPS而且为感染过程中的正常生长所必需。

多杀性巴氏杆菌的waaQpm突变株不会在鸡中致病。菌株AL251在鸡中显示了一个极度减缓的生长速率。希望确定它在这些宿主中是否仍然能够致病。鸡被两种不同剂量的VP161或AL251测试(实施例6，表2)。所有注射了野生型VP161的鸡都在20小时内死亡。与此相反，大部分用AL251测试的鸡在开始20小时内保持健康，但在4天内，不论何种剂量接种了AL251的鸡，都病死于禽霍乱感染。从疾病的后期或末期的AL251-感染鸡的血液中分离出多杀性巴氏杆菌，发现所有分离得到的多杀性巴氏杆菌克隆都具有四环素敏感性，这表明转座子已经不再在细菌中存在。恢复克隆的waaQPM基因的序列分析表明在所有克隆中转座子已被敲除，因此重建了一个功能性waaQPM基因。有趣的是，除了一个分离体外，序列分析也表明在转座子敲除点的核苷酸替代导致在waaQPM中的两个氨基酸改变(aminoacids 88，89；Ser to Leu，and Asp to Cys)。这些氨基酸改变不影响waaQPM的功能，因为用AL251测试的鸡得到的多杀性巴氏杆菌的分离株中LPS的结构都与野生型菌株相同(图36b)。综上所述，这些结论表明接种AL251的鸡中观察到禽霍乱的晚期攻击完全是由于AL251的野生型回复突变，因而具有一个失活的waaQPM基因的菌株不能致病。

waaQpM突变株对鸡的毒性减弱不是由于增加了对鸡血清的敏感性。为了确定野生型多杀性巴氏杆菌菌株VP161和LPS突变株AL251对补体介导的杀伤的相对敏感性，用每个菌株和对照菌株E.coli DH5α的对数生长期细胞，在常规或热处理的鸡血清中培育3小时。野生型多杀性巴氏杆菌菌株VP161，在加热的或是未加热的血清中，以相同速率生长，表明它是完全血清抗性的，这与以前报导的其它多杀性巴氏杆菌血清型A菌株相似。鸡血清的细菌活性用E.coli对照菌株证实，在热处理的血清中增殖19倍而在未处理的血清中细菌活性则减少大约9倍。有趣的是，对于AL251突变株，在热处理的血清与普通血清中的生长并无差异，都大约有160倍的增殖。这些结果表明在鸡的LPS突变株中观察到的毒性减弱不是由于对补体增加了的敏感性所致。

来自多杀性巴氏杆菌VP161和AL251的LPS的结构分析。来自亲株VP161的糖结构分析表明有葡萄糖(Glc)，半乳糖(Gal)，N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)，L-甘油-D-甘露-庚糖(LD-Hep)，其各自的比例为2∶1∶1∶3。相反，来自突变株VP251的LPS分析表明仅有葡萄糖(Glc)，L-甘油-D-甘露糖-庚糖(LD-Hep)，其各自的比例为1∶3，以及痕量的半乳糖(Gal)，N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)。GlcNAc的存在可能取决于除了每个LPS分子的脂质A区域中预期的两个残基外，已知的本血清组透明质酸荚膜的残基数量。来自亲本VP161 LPS的核心OS样品的CE-ES-MS分析显示了一个简单质谱(图37a)，其与分子量1805与1967 Da的糖型相符，其中较小的糖型与2PCho，3Hex，4Hep，Kdo的组成一致，Kdo是独有的LPS糖2-酮-3-脱氧-辛酮糖酸，PCho是磷酸酯部分磷酸胆碱。其中较大的糖型含有一个额外的庚糖种类(实施例6，表3，图37a)。与突变株AL251LPS的SDS-PAGE分析一致，其核心OS样品的CE-ES-MS分析显示出一个高度截短的分子量605Da的分子的简单质谱(实施例6，表3，图37b)。这一分子量符合2Hep，1Kdo的组成。观察到一个的更大些的糖型，该糖型符合一个附加的庚糖残基(767 Da)。观察到痕量的一个多延伸的分子量1448Da(PCho，3Hep，3Hex，Kdo)的糖型，但在被观察到的糖型中没有含有全部亲本的4庚糖残基互补物(实施例6，表3)。为了完整表征突变株在核心OS截短的特性，进行了亲本与突变株核心寡糖的¹H-NMR实验。由于质谱数据表明在突变株中的OS中丢失一个庚糖残基，并且氨基酸同源性对照表明WaaQpm是一个庚糖基转移酶，高度关注分子中庚糖残基的共振。¹H-NMR光谱表明最邻近Kdo残基的Hep残基的变异性(常在核心寡聚糖中观察到)是由于在获得核心OS的酸水解条件下Kdo残基重排引起(图38)。对来自于亲本菌株的核心OS，在～5.7ppm识别到HepII的端基异构体质子的化学位移，与2-位取代这一残基符合(图38a)。然而，在AL251突变株的OS¹H-NMR光谱(图38b)中，Hep II的端基异构体共振的化学位移向高场偏移为大约0.5ppm，与残基不再在2-位被取代相一致。如同以前在H.somnus菌株中观察到的，HepII残基成为末端部分，并且H-4共振的化学位移与这种排布相符。通过2D NOESY实验获得突变株结构特征的确定性证据(图39)。观察到VP161核心OS在HepIII和HepII端基异构体质子间的特征性NOE，表明在HepIII和HepII残基之间是α-1-2连接的(图39)。AL251突变株的核心OS的NOESY光谱证实HepII残基缺少2-位取代，如上所述的特征性NOE缺失，证实在突变株的OS中不存在HepIII残基。关于亲本OS的HepII和HepIII残基的化学位移和NOE光谱数据以及关于突变株OS的HepII残基的化学位移和NOE光谱数据总结于实施例6，表4。结构技术表明突变基因waaQPM在LPS结构上的效应是阻止HepIII添加到Hep II(图40)，这种作用与所编码的蛋白和已知的庚糖基转移酶的高度相似性一致。

讨论

使用STM首次在小鼠和鸡中识别到的多杀性巴氏杆菌LPS突变株AL251，显示有一个转座子***在预测的庚糖转移酶基因waaQ_PM中，并且在鸡和小鼠中致病毒性显著下降。野生型VP161和AL251的细胞溶解物的银染聚丙烯酰胺凝胶显示来自突变株的LPS显著缩短(图36A)，这与waaQ_PM编码一个负责将一个庚糖分子添加在LPS结构的核心区的庚糖基转移酶相符。

对多杀性巴氏杆菌的Pm70基因组的分析表明，基因waaQ_PM可能独立转录，因此产生缩短的LPS结构直接由于waaQ_PM基因的失活而不是下游基因的偶极作用减缓多杀性巴氏杆菌在鸡和小鼠的体内生长。这一点通过互补实验证实，当导入一个反向野生型waaQ_PM基因不仅恢复LPS的结构(图36A)，而且在小鼠中的生长恢复到野生型水平。

使用LPS突变株AL251在鸡中的毒性试验导致的禽霍乱症状(实施例6，表2)的推迟出现以及具有疾病症状的鸡中分离的多杀性巴氏杆菌对四环素敏感，说明不再带有转座子。对从感染的鸡中分离的多杀性巴氏杆菌DNA的核酸序列数据证实waaQ_PM基因是完整的，并在多数情况下在原来***转座子处存在碱基改变，导致两个氨基酸改变。从AL251感染的鸡中获得的分离株的LPS显示其为野生型的LPS，证实尽管氨基酸变化，但waaQ_PM基因是有功能的(图36B)。综上，这些数据表明在接种AL251的鸡中观察到的感染仅是因为回复突变株丢失转座子***所致。野生型多杀性巴氏杆菌菌株VP161是一种极高毒性微生物，在鸡中少于50个细菌就可导致禽霍乱。我们的研究检测到从AL251细胞中转座子的消除速率，在最初的十代后为1％，(体外过夜生长)上升到58代后的4％(未显示数据)，这一消除速率导致在鸡中野生型回复突变体的传代与选择，是以一个在试验过程中足以产生致死禽霍乱感染的速率。因此，一个稳定失活的waaQ_PM将导致多杀性巴氏杆菌菌株不能产生禽霍乱。然而，构建限定的多杀性巴氏杆菌的突变株的可靠方法还未建立。

多杀性巴氏杆菌菌株野生型LPS分析显示一个“粗糙型”LPS，与从革兰氏阴性粘膜病原体，如流感杆菌、H.ducreyi、脑膜炎奈瑟菌以及N.gonorrhoeae等分离出的LPS或脂寡糖(LOS)相似，只有一个短的非重复多糖单元与核心相连。多杀性巴氏杆菌LPS的内核结构与在流感杆菌、溶血性曼氏杆菌、杜克雷嗜血杆菌描述的LPS结构相似，带有一个三庚糖单元，该单元经由一个Kdo残基与脂A相连(图39)。在AL251突变株中，waaQ_PM的失活导致表达出在内核区域缺乏第三庚糖分子(Hep III)的高度截短的LPS。突变株中含量最高的LPS糖型同样缺少连接在第一个庚糖的所有糖残基，表明waaQ_PM的失活阻止了糖的进一步添加(实施例6，表3)。因此很可能由于在大部分第三庚糖的缺失导致的LPS中间体的构像改变大大阻碍了后续转移酶的活性。

全长LPS分子的缺失明显影响突变株AL251在小鼠中的生长能力和在鸡中的致病能力。这一毒性减弱的具体原因还不清楚。然而，在野生型多杀性巴氏杆菌VP161 LPS中，识别到两个PCho基团而突变株AL251 LPS中仅在一种非常稀少的糖型中含有一个PCho基团(实施例6，表3)。在VP161 LPS中存在一个以上的PCho残基是不同寻常的；具有PCho-修饰的LPS的细菌通常只有一个相连的残基，尽管连接到LPS结构上的位置多种多样。仅有一种不同细菌，一种非典型流感嗜血杆菌菌株，已知有两个PCho残基连接到LPS。有趣的是，在血清型A火鸡分离出PM70的LPS上没有PCho基团，该菌株对鸡类也是无毒的。

PCho基团经常连接到粘膜病原体表面上的多种细菌结构中，所述病原体如流感嗜血杆菌、伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)、肺炎链球菌(Strep tococcus pneumoniae)和奈瑟菌属种(Neisseria spp.)，通过与血小板活化受体(PAF)连接，在黏附和入侵上皮和内皮宿主细胞中起关键作用。具有LPS的PCho阳性糖型的非典型性流感嗜血杆菌经由一系列信号活动可以黏附并侵入人支气管上皮细胞。然而，在流感嗜血杆菌和奈瑟菌属种中，尽管在LPS上的PCho表达在黏附和侵入人的上皮细胞中是必要的，它的存在减少在某些宿主生态中的存活，因为表达Pcho的菌株具有更强的血清敏感性，通过Pcho连接到C-活性蛋白和补体***的后续激活来调解。有趣的是，现有研究表明LPS突变株AL251仍对鸡血清补体的细菌活性有高度抗性，说明一个完整的野生型的LPS结构并非细菌具有全血清抗性所必需。毫不奇怪，因为多杀性巴氏杆菌血清型A菌株的荚膜赋予血清抗性。

总之，一个多杀性巴氏杆菌的waaQ_PM突变株表达一个极度截短的LPS。野生型多杀性巴氏杆菌的LPS分子和waaQ_PM突变分子的内核结构被确定，这表明一个有功能的waaQ_PM基因为添加第三庚糖残基到LPS的内核所必需。因此，waaQ_PM被鉴定为一个庚糖基转移酶III并通过毒性试验表明其活性在多杀性巴氏杆菌对自然宿主鸡的细菌毒性中是必须的。waaQ_PM的失活导致在内核中第三庚糖基的完全缺失，即产生完全野生形糖型。从突变株LPS中识别到的多数糖型缺乏PCho残基，在其他革兰氏阴性粘膜病原体的LPS中，该残基在细菌毒性中起关键作用。

实施例6，表1.用于本研究的细菌菌株、质粒和寡核苷酸(oligo)。

菌株、质粒或者寡核苷酸	相关描述	来源或者参考文献
			菌株多杀性巴氏杆菌VP161	血清型A：1，来自鸡的越南分离株	Wilkie et al.Vet.Microbiol. 72，57(2000).
AL251AL298AL438	VP161 Tn916EΔC waaQPM突变株带有质粒pAL170的AL251带有质粒pAL99的AL251	Harper et al.Infect.Immun. 71，5440(2003).本研究本研究
			E.coliDH5α	deoR，endA1，gyrA96，hsdR17(rk -mk +)，recA1，relA1，supE44，thi-1，(lacZYA-argFV169)，Φ80lacZ ΔM15，F-	Bethesda ResearchLaboratories
质粒pPBA1100	多杀性巴氏杆菌/大肠杆菌穿梭载体	Homchampa et al.Vaccine 15，203(1997).
			pAL99	将含有多杀性巴氏杆菌tpiA启动子区的240bpEcoRI片断克隆到ppBA1100 EcoRI位点	本研究
pAL170	包含waaQPM基因的pAL99	本研究
			寡核苷酸BAP2146	waaQPM扩增的正向引物有BamHI位点用于克隆GAGTAGGATCCTGAAACATGTTCCC	本研究
BAP2147	waaQPM扩增反向引物有Sal I位点用于克隆GGTTGGGTCGACCAAGCCACATTACTG	本研究

实施例6，表2.VP161和AL251在几组鸡(每组10只)中的毒性。

CFU＝菌落形成单位，h＝小时，N.D＝未检测到。

菌株	剂量(CFU)	死亡的平均时间(h)	范围(h)
				VP161	1.5×1021.5×103	＜20＜20	NDND
AL251	707×102	6530	33-12023-42

实施例6，表3.从多杀性巴氏杆菌菌株VP161(亲本)和AL251(突变株)的核心OS的阴离子CE-MS数据和的推测组成。根据如下的推测组成，平均质量单位被用于分子量计算：Hex，162.15；Hep，192.17；Kdo，220.18；Pcho，165.05。相对强度表示为二价或-价离子的相对高度。

菌株	[M-H]-	[M-2H]2-	观察到的分子离子	计算的分子离子	相对强度	推测组成a
							VP161核心OS	1804.41822.4-1966.31988.4	901.8910.9921.8982.9993.9	1805.61823.11845.11967.81989.1	1805.41823.41845.41967.61989.6	0.21.00.30.90.3	2PCho，4Hep，3Hex，aKdob2PCho，4Hep，3Hex，Kdo2PCho，4Hep，3Hex，Kdo，Na2PCho，4Hep，4Hex，aKdo2PCho，4Hep，4Hex，aKdo，Na
AL251核心OS	603.5621.5765.51447.5	----	604.5622.5766.51448.5	604.5622.5766.71448.2	1.00.90.80.1	2Hep，aKdo2Hep，KdoHex，2Hep，aKdoPCho，3Hep，3Hex，aKdo

^aPCho，磷酸胆碱；Hep，庚糖；Hex，己糖；Kdo，2-酮-3-脱氧辛酮糖酸

^baKdo指脱水-Kdo衍生物

实施例6，表4.来自多杀性巴氏杆菌菌株VP161(亲本)和AL251(突变株)的核心OS的Hep II和Hep III残基的1H-NMR化学位移。在D20中于25℃记录。未确定在2.225ppm.nd参照内部丙酮的化学位移。由于核水解后Kdo分子的异质性，对应每-残基观察到两个共振。

	H-1	H-2	H-3	H-4	H-5	H-6	H-7	NOEs
										VP161 Hep-II	5.76	4.17	3.85	3.83	3.60	4.05	3.763.65	之间	内部
5.11 Hep III H-14.04 Hep I H-3	4.17 H-2
		Hep-II	5.70	4.19	3.86	3.84	3.55	4.05	3.763.65									5.14 Hep III H-13.96 Hep I H-3	4.19 H-2
Hep-III	5.14									4.02	3.87	3.83	3.78	4.05	3.773.65	5.70 Hep II H-14.19 Hep II H-2	4.02 H-2
		Hep-III	5.11	4.01	3.87	3.83	3.78	4.05	3.773.65									5.76 Hep II H-14.17 Hep II H-2	4.01 H-2

AL251 Hep II	5.22	4.07	3.89	3.72	nd	nd	nd	4.03 Hep I H-3
									Hep II	5.17	4.06	3.88	3.65	nd	nd	nd	nd

实施例7

表现出一种兽类病原体特定的保守LPS结构的溶血性曼氏杆菌的D-甘油-D-甘露-庚糖基转移酶突变株的制备，以及对这种LPS结构的抗体的产生和交叉反应。

对来自兽类病原体溶血性曼氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的脂多糖的以前的结构研究已经识别出一种保守内核寡糖结构，该结构存在于被研究的所有菌株中。为了考察这种内核结构作为疫苗的潜能，采用一种诱变策略来干扰溶血性曼氏杆菌的D-甘油-D-甘露庚糖转移酶基因(losB)。这种基因编码的酶负责增加D-甘油-D-甘露庚糖残基，该残基是保守内核外的第一残基，而且它的失活使保守内核结构暴露作为突变体LPS分子上的末端单元。随后的分析确定突变株LPS的结构如下，且与losB的反向互补确定了losB基因编码一种α-1，6-D-甘油-D-甘露庚糖基转移酶。

在小鼠体内产生这种LPS结构的多克隆和单克隆抗体，发现这些抗体可识别溶血性曼氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌三种菌株的LPS和全细胞。

菌苗或者简单修饰的活菌株是实践中的传统疫苗，然而，现场试验和实验性研究已经反复证实菌苗无效，实际上经常引起负作用。本工作探索满足有效、准确要求的亚单位疫苗候选物。可以考虑作为疫苗候选物的抗原几乎确定必须处在自然状态下的细菌的表面上，以获得随后靶向活的有机体的疫苗抗原的免疫应答。

在此背景下，包含表面暴露的糖部分的兽类病原体可用作疫苗候选物。该糖部分是脂多糖(LPS)和荚膜多糖。荚膜多糖是直接连接于细菌表面的几个糖残基的重复单元，而LPS由三个区域组成，一个经由脂肪酸残基将LPS分子连接于细菌表面的脂质A区，一个将脂质A区连接于第三区的相对保守的核心寡糖区，以及可变多糖抗原(O-抗原)。荚膜和O-抗原多糖的菌株异质性将这些结构排除作为经济可行的疫苗候选物，因为他们的能力只能覆盖同源菌株或产生相同结构的菌株。另一种情况，如果能识别出一个保守核心LPS结构，该结构也许可以利用作为一种对所有菌株提供广泛覆盖的疫苗候选物。

在我们实验室中，之前和现在的对三个菌株，App，Pm和Mh的LPS结构的结构分析识别出一个存在于所有考察的菌株(App，Pm和Mh)中的保守内核LPS结构。为了考察保守内核单元的潜能，必须将该结构暴露成为末端残基，为此采用诱变策略，将编码负责外核生物合成的糖基转移酶基因破坏。这种诱变的结果从而使得保守内核结构被暴露。

本研究描述了来自溶血性曼氏杆菌的庚糖基转移酶基因的识别、克隆和诱变，该庚糖基转移酶在外核修饰中负责第一生物合成步骤。来自突变株的LPS结构分析确定，LPS被适当截短了。然后，将突变菌株用于产生对抗保守LPS结构的抗体，并且那些抗体检测三个靶向菌株间的交叉反应。

实验

细菌菌株和培养条件

Mh菌株A1 Sh1217(S.Highlander，Baylor College of Medicine，Houston Texas)和A1菌株01A ADRI(Perry Fleming，IBS)于37℃在BHI平板或BHI肉汤上进行常规培养。E.coli DH10B(Invitrogen，Carlsbad California)用于重组质粒的克隆和制备，并在加有适量抗生素的LB培养基上培养(氨比西林100μg/ml，氯霉素25μg/ml)。需要时，溶血性曼氏杆菌菌株在加有氨比西林(50μg/ml)和氯霉素(5μg/ml)的BHI培养基上培养。

包括***到losB基因的重组质粒的构建。

将来自菌株01A的染色体DNA的losB基因使用侧翼引物通过PCR扩增。所使用的引物是losB-kpn 5’ATATGGTACCTATCAGCGGTAGAGATTC TAAC和losB-xba 5’TGCTC TAGACCGAACCTGCACCAAAAAGATTTAACGC。这些引物扩增出一个2Kb的片断，用Kpn/Xba限制性内切酶消化后将该片断克隆到pBluescript，接着电穿孔到E.coli DH10B。使用如下对应losB结构基因的引物5’CCGCTGCGAGAGATAAGTGGATACTTTATC-3’和5’GACATTGGGATCTTTATTTAGATTTCAAACCGAC-3’进行以该质粒为模板的反向PCR，从琼脂糖凝胶上切取产物并用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化。来自pNFplpcat的经修饰的氯霉素乙酰转移酶(Cat)盒(plpCat)通过PCR扩增，将粘性末端产物连接到上述PCR产物制成pSK losB::at。限制性酶切图和重组质粒序列确定Cat盒被以与losB基因相同方向***到losB结构基因。

losB菌株的筛选

质粒pSKlosB::cat通过电穿孔转化到Mh细胞中。简言之，电穿孔后将细胞立即转移到1ml的预热的BHI肉汤，于37℃培养1.5h。平板接种到含有5mg/ml氯霉素的BHI琼脂上以筛选转化株。为确定该转化株不再带有pSKlosB::cat质粒克隆，将其拷贝平板接种到BHI/Amp平板上，氨比西林敏感克隆通过PCR检测。倍增重组后losB基因的***失活用PCR确认。在初始克隆实验中所使用的针对losB-Kpn和losB-Xba的上游和下游序列的引物，确定Cat cassette***到losB基因的染色体拷贝中。

losB突变株与losB反向基因的互补

通过使用Xba和Kpn的限制性内切酶消化从pSK losB(见上)上切取losB基因的野生型拷贝，克隆到穿梭质粒pNF2176中以产生pNF2176AalosB。然后将该质粒电穿孔到Mh losB突变株和在Amp/Cat上筛选的转化株中。

突变株LPS特征描述

使用常规技术从灭活细胞中分离出。如之前所述，准备糖分析和部分甲基化的糖醇乙酸酯。纯化核心OS和O-脱酰LPS(LPS-OH)。纯化完全脱酰LPS。使用质谱检测法和核磁共振光谱检测法。

抗体制备

用***灭活、PBS洗涤的Mh losb 0.5ml，其中有108细胞，在天数(D)0，14和35时对5只雌性BALB/c小鼠进行腹膜内注射(ip)免疫。在D42进行实验取血，从每只小鼠的面静脉抽取少量血，将分离出的血清通过ELISA检测与Mh losB和Mh wt LPS的交叉反应性。在D54，每只小鼠接受重复ip免疫接种，并且小鼠#2也接受一次静脉(iv)注射0.2ml，其中有4×10⁷细胞。在D57，从这些小鼠上切下脾并与一种骨髓瘤细胞系融合。该融合体的初始筛选的抗原是来自Mh losB和Mh wt的纯化LPS。小鼠#3和小鼠#5在D90用Mh losB全细胞(～10⁸)ip。小鼠#3在D131用Mh losB细胞ip和iv加强免疫，为D134的脾细胞融合作准备；小鼠#5在D152用来自Pm菌株VP161经***灭活的全细胞ip和iv注射加强免疫，在D155将其脾细胞融合。针对小鼠#3和小鼠#5融合体的初始筛选的抗原是来自App血清型5a和Pm菌株VP161的纯化LPS。制备含有单克隆抗体的腹水。

LPS ELISA

纯化的并充分表征的野生型和突变株LPS被用于固相间接ELISA以确定mAb的结合专一性。

全细胞ELISA

使用酚灭活细胞

结果

候选糖基转移酶的识别。

来自3种所感兴趣的菌株(Mh，App和Pm)的LPS表现有相同的内核结构(实施例7，表1)。为考察这种保守内核结构作为一种有用的疫苗候选物的潜能，必须去除这个区域外的外核修饰。为帮助完成此事，采取方法以识别和改变在外核修饰中负责第一个单糖加入的糖基转移酶基因。由于相对于App，Mh中的O-抗原的数量低，不会干扰随后的免疫研究，因而选择Mh进行诱变研究。Pm菌株Pm70[24]的基因组序列测定完成，Pm(菌株P-3480)、App(血清型1和5b)和Mh(A1菌株)的正在进行。在App血清型1和Mh菌株A1中都识别到如图41所示的候选糖基转移酶。Galameau等人鉴别出App中的lbgA基因定位于两个基因中间，所述两个基因通过mini-Tn10转座子诱变发现与核寡糖生物合成相关。相邻基因lbgB显示与杜克雷嗜血杆菌的一个D-甘油-D-甘露庚糖基转移酶有相当高的同源性。使用App的lbgB基因序列对Mh基因组序列(Baylor College，Houston)进行Blast分析，揭示出在Mh基因组序列中有两个相邻的D-甘油-D-甘露-庚糖基转移酶的同源物。所识别的最佳lbgB同源物据推测为负责在第一个L-甘油-D-甘露-庚糖残基的延伸上添加第一个D-甘油-D-甘露-庚糖残基的D-甘油-D-甘露-庚糖转移酶，因此我们推测，第二个同源物(我们称为losB)是负责添加第二个D-甘油-D-甘露-庚糖残基的D-甘油-D-甘露-庚糖转移酶。

Mh中losB的诱变

在Mh中质粒pSKlosB::cat不能复制，因此在功能上作为一种***性质粒。随后电穿孔(5μg质粒DNA)进入Mh中，获得136个cat^R转化体，其中104个是amp^s。随机选择其中的两个作进一步研究。通过用包含***位点的引物的PCR确认两个突变株都曾有过双交换作用(未显示数据)。为确定对LPS结构(见下文)的影响是由losB基因的失活造成的，我们在穿梭质粒pNF2176上用losB基因的野生型拷贝反向互补突变菌株。

losB突变株的LPS的表征

常规方法分离LPS。纯化的LPS的糖分析揭示，葡萄糖(Glc)、D-甘油-D-甘露-庚糖(DD-Hep)和L-甘油-D-甘露-庚糖(LD-Hep)各自的比例大约为2∶1∶3，还可观察到痕量的N-乙酰-葡糖胺(GlcNAc)。这种糖组成与突变株LPS的预期结构一致，并且暗示突变的losB基因，如同源性数据所预示的，是特异性的庚糖转移酶基因，而不是与庚糖生物合成有关的基因，因为四个其他庚糖残基保留在突变株的LPS中。常规方法制备O-脱酰LPS(LPS-OH)，并用CE-MS分析(实施例7，表2)。观察到一个有二价(1172.32)，三价(781.3^3-)和四价(585.^4-)离子的简单质谱(图42a)，所观察到的离子与预期的Hex2，Hep4，Kdo-P，脂质A-OH组成一致。还观察到少量带电离子；二价(1065.3^2-)，三价(709.8^3-)和四价(532.3^4-)，与多存在一个Kdo残基、同时缺少己糖、庚糖和磷酸部分相对应。以前在相关兽类病原体多杀性巴氏杆菌中观察到这种情况。纯化核寡糖(OS)并用CE-MS相似地检测(实施例7，表2)，给出一个一价(1312^-)和二价(655.6^2-)离子的质谱，与预期的Hex4，Hep2，Kdo组成相一致。为了证明突变株LPS的连接模式没有因诱变而改变，在核心OS上进行了甲基化分析，显示末端Glc，6-取代的Glc，末端LD-Hep，末端DD-Hep，2-取代的LD-Hep和3，4，6-三取代LD-Hep以大约相等的比例存在，这又与预期的突变株LPS结构相一致。在完全脱酰的LPS上的NMR实验获得了突变株LPS的核心OS结构的最后确认，并与野生型LPS光谱(图43)比较发现，在突变株LPS中很明显没有末端Gal-Hep二糖。化学位移的排布揭示(实施例7，表3)，保守核心OS的所有连接与野生型LPS的相同，因此已获得想要的结构。从互补突变株获得LPS-OH，CE-ES-MS分析确认出带有少量的具有附加Kdo残基的糖型的wt LPS表形(实施例7，表2，图42b)。

抗体制备

经初始和加强免疫后，检测5只小鼠的血清识别Mh losB和Mh wt LPS的能力(图44)。由于小鼠#2对wt菌株有最高的IgG滴定率，选择这种小鼠进行第一次融合实验以产生mAb。产生九个识别Mh losB的稳定的杂交瘤，并检测他们与Mh，App和Pm的wt LPS的交叉反应的能力(图45)。然而，没有mAb能识别App和PmLPS，并且只有四个mAb能识别Mh wt LPS。D42多克隆血清的检测揭示，存在能识别纯化的App血清型5a、Pm菌株VP161和X73 LPS而不能识别App血清型1的LPS的抗体(图46)。因此，在小鼠#3上制得融合物，但是没有鉴别到能识别App血清型5a和Pm菌株VP161的纯化LPS的杂交瘤。最后，因为在D152时多克隆血清检测显示出与Mh losB和wt，App血清型1和5a以及Pm菌株VP161和X73的LPS的交叉反应，所以在小鼠#5用Pm菌株VP161的灭活完整细胞最后一次加强免疫后，制得融合物(图47)。获得十四个杂交瘤，十一个只能能识别Pm菌株VP161的纯化LPS，三个能识别App血清型5a和Pm菌株VP161的纯化LPS。随后发现这三个交叉反应杂交瘤能识别App血清型1、Pm菌株X73以及Mh losB和wt的纯化LPS，而上述十一个识别Pm VP161的杂交瘤，也是只能识别相关的Pm菌株X73(图48，实施例7，表4)。

目前没有有效的疫苗来对抗由兽类病原体Mh，Pm和App引起的疾病。对抗由Mh引起的疾病的疫苗方法仍然主要是基于菌苗和活减毒株。最近的活疫苗中引入了分泌或者提取的Mh抗原，如神经氨酸酶、白细胞毒素、唾液糖蛋白酶、外膜以及未识别的蛋白。白细胞毒素在常规上一直是主要的亚单位疫苗候选物，但使用表达非毒性白细胞毒素的突变株进行免疫接种在小牛攻击模型中仍然部分有毒，并且白细胞毒素与荚膜多糖联合使用时不能产生防护性免疫应答。相比而言，LPS已显示出可稳定的白细胞溶解活性，所以基于LPS和去毒白细胞毒素的联合疫苗可带来希望。

目前对抗由App引起的疾病的疫苗方法是基于活减毒株，它们中含有高度不稳定的Apx毒素，该毒素可诱导防护所需的中和抗体。这些Apx毒素形成了针对App的主要亚单位疫苗的基础，但似乎只能诱导部分临床防护。有人提出将粘附素(包括LPS的核心OS)作为改善的疫苗候选物。

目前预防猪Pm病的疫苗由类毒素和体细胞抗原如荚膜和外膜蛋白组成。巴斯德(Pasteur)首先表明Pm可引起鸡的禽霍乱，目前对该病的防护手段是利用Pm减毒株。然而一般来说，由于该免疫应答仍然是血清型限制的，不能提供对其他血清型的交叉保护，所以这种手段受到极大限制。然而已经表明Pm的LPS在感染的免疫中起部分作用。

最近已经积累了相当的证据表明来自这些生物中每一种的LPS都可能是亚单位疫苗设计的良好候选物。已经显示LPS是Mh表面上可见的和主要的抗原决定簇，由A1 LPS诱导的mAb有助于吞噬作用而无助于补体介导的体外杀伤。

对于pm，核糖体-LPS疫苗保护鸡类免受由同源Pm菌株引起的禽霍乱感染。另外，使用LPS-蛋白复合物对小鼠进行免疫接种，当使用同源菌株攻击小鼠时该免疫接种可提供100％的保护，然而当分开使用时，该复合物的单一组分无法提供保护。来自Pm的LPS诱导的MAb在小鼠模型中只能提供部分保护，尽管它们具有调理吞噬作用，但在补体存在下不具有杀菌作用。然而在另一项实验中，针对PmLPS的mAb可完全保护小鼠免受同源攻击，并且具有杀菌作用。一种模拟来自A型的LPS的抗独特型疫苗在小鼠模型中当其受到同源生物攻击时可起到保护作用。

在App中，LPS，更具体地说是LPS的核区与该细菌的粘附能力有关。BSA与App血清型1 LPS连接的联合疫苗可在同源攻击而不能在异源攻击后保护小鼠，来自血清型5和1的光滑型和粗糙型App LPS的联合疫苗表明App细胞壁的糖部分在猪免疫应答中起重要作用。

因而，我们从事这个研究以制造出一个保守的截短的核心LPS，该LPS是所有三种有机体中都有的。已显示LPS在对这些兽类病原体的每一种的免疫力中都起作用，如果能识别到一种保守LPS抗原，那么对同源菌株的保护应答或许能延伸到异源菌株甚至菌种。结合结构分析数据表明，所有这些兽类病原体都有一个共同的保守性内核心OS结构。因此决定探索基于LPS的疫苗的可能性。该过程的第一步是构建突变株，该突变株只表达保守性内核心OS表位作为末端暴露结构。

该研究已经从Mh菌株A1获得α-1，6-D-甘油-D-甘露-庚糖基转移酶基因的突变体，以便以末端暴露部分的形式呈现保守性内核表位。在Mh中，诱变策略决不是简单的。以前有限数量的研究制备出aroA基因、lpp基因座、荚膜nmaAB基因座以及白细胞毒素lktCABD基因簇的突变株。尽管电穿孔是将外源DNA导入Mh细胞的一种有效方法，但是通过同源重组将外源DNA***到染色体中是很难的，并且出现频率低，而单交换事件频繁发生，导致靶基因的突变株和功能性拷贝的存在。在Mh中不稳定的质粒(***型质粒)已被几个人用于此方法，在当前研究中被成功使用。突变株的LPS的结构分析证实了预期的LPS表型，互补实验证实所观察到的结果确实是由于这种基因的失活造成的。重新反向导入losB基因的完整拷贝使LPS结构回复为野生型证实，losB基因是α-1，6-D-甘油-D-甘露-庚糖基转移酶。诱导针对此截短的LPS结构的mAb和pAb，以检验在这些兽类病原体的一定范围的菌株中此结构的保守性和可达性的程度。获得了三种mAb，它们能够与Ap、Pm和Mh的所有研究过的菌株的LPS发生交叉反应，因而建立了这三种重要的兽类病原体之间共有的保守***叉反应性LPS表位的可能性。

实施例7，表1：来自兽类病原体溶血性曼氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的LPS的核心寡糖的保守和多变区的结构。

菌种	菌株/血清型	R	R’	R”
					溶血性曼氏杆菌	A1	H	β-D-Galp-(1-7)-D-α-D-Hepp-(1-	H
	A8	H	D-α-D-Hepp-(1-	H
						SH1217	H	β-D-Galp-(1-7)-D-α-D-Hepp(1-	H
					胸膜肺炎放线杆菌	1	(1S)-GalaNAc-(1-4，6)-α-D-Gal-(1-3)-β-D-Gal-(1-	H	H
	2	β-D-Glc-(1-	D-α-D-Hep V-(1-	□

	5a	H	D-α-D-Hep V-(1-	H
						5b	H	D-α-D-Hep V-(1-	H
					多杀性巴氏杆菌*	Pm70	β-D-Glc(1-	α-D-GalpNAc-(1-3)-β-D-GalpNAc-(1-3)-α-D-Gal-(1-4)-β-D-Gal-(1-4)-β-D-Glc-(1-	PEtn
	VP161	PCho-3-β-D-Gal-(1-	PCho-3-β-D-Gal-(1-	H
						X73	(PEtn-6)-PCho-3-β-D-Gal-(1-	(PEtn-6)-PCho-3-β-D-Gal-(1-	H

对于多杀性巴氏杆菌，庚糖残基Hep IV是L-□-D构型，在少数糖型中没有葡萄糖残基□-Glc II。

实施例7，表2：来自溶血性曼氏杆菌losB突变株和互补突变株的O-脱酰LPS和核心寡糖的阴离子CE-ESI-MS数据和推测组成。平均质量单位根据如下推测组成用于计算分子量：Hex，162.15Hep，192.17；Kdo，220.18；P，79.98.O-脱酰脂质A(脂质A-OH)是952.00。

菌株	观察到的离子(m/z)				分子质量(Da)		推测组成
									(M-H)-	(M-2H)2-	(M-3H)3-	(M-4H)4-	观察值	计算值
O-脱酰losBlosB(comp)核心OSlosBlosB(comp)	----1312.4-	1172.31065.31349.31242.3655.6832.8	781.3709.8899.3827.8--	585.8532.3674.3620.8--	2347.02133.02701.02486.51313.31667.6	2345.12131.02699.42485.31313.21667.5	2Hex，4Hep，Kdo-P，脂质A-OHHex，3Hep，2Kdo，脂质A-OH3Hex，5Hep，Kdo-P，脂质A-OH2Hex，4Hep，2Kdo，脂质A-OH2Hex，4Hep，Kdo3Hex，5Hep，Kdo

实施例7，表3：来自溶血性曼氏杆菌losB突变株KOH处理的LPS的¹H-和¹³C-NMR化学位移。

	H-1	H-2	H-3	H-4	H-5	H-6	H-7	H-8	NOE’s
												α-GlcN(x)	5.41(94.3)	3.89(54.6)	3.93(70.5)	3.53(70.7)	4.13(73.7)	4.143.87(68.9)			之间	内部	远程
			β-GlcN(y)	4.60(102.2)	3.80(55.9)	3.92(73.1)	3.94(75.4)	3.78(74.9)	3.753.59(64.0)
Kdo(z)	-	-										2.352.02(35.0)	4.59(71.1)	4.27(72.9)	-(nd)	-(70.3)	3.963.72(64.4)
			Hep-I(a)	5.18(100.4)	4.13(71.1)	4.03(75.0)	4.17(75.0)	-(72.8)	4.11(81.0)	ndnd(nd)											4.27 Kdo H-5	4.13 H-2
Hep-II(b)	5.60	4.24										4.01	-	-	-	3.72		5.16 Hep III H-1	4.24 H-2	3.80 Hep I H-5

	(100.5)	(80.5)	(70.9)	(67.8)	(72.4)	(69.7)	3.62(64.6)	4.03 Hep I H-3
											Hep-III(c)	5.16(102.4)	4.00(71.4)	3.86(70.8)	3.81(67.0)	-(71.6)	-(70.3)	--(64.9)	5.60 Hep II H-14.24 Hep II H-2	4.01 H-2	3.80 Hep IV H-33.62 Glc I H-4
β-Glc-I(d)	4.61(103.9)	3.50(74.3)	3.43(77.5)	3.62(70.6)	3.51(74.6)	4.133.72(65.6)	-	4.17 Hep I H-44.11 Hep I H-6	3.52 H-53.43 H-3	5.22 Glc II H-1
											α-Glc-II(e)	5.22(102.2)	3.56(73.0)	3.84(73.8)	3.54(69.5)	3.96(72.4)	--(60.4)	-	4.11 Hep I H-6	3.56 H-2	4.62 Glc I H-1
Hep-IV(f)	4.94(100.0)	4.08(70.5)	3.80(71.0)	3.76(68.3)	-(70.3)	-(79.9)	--(64.0)	4.13 Glc I H-63.72 Glc I H-6	4.08 H-23.80 H-3

实施例7，表4.由小鼠#5融合体制备的mAb的摘要信息

MAbMh3-	IgG亚类	操作稀释度：1
			1	G3k	500
2	G2ak	200
			3*	G2aλ	未稀释
4*	G2aλ	未稀释
			5	G2aλ	未稀释
6	G3k	800
			7	G3	200
8	G3k	800
			9	G3k	1000
10	G3k	1600
			11	G3	1000
12	G3k	1000
			13	G3k	2000
14	G3k	1000
			15~	G2bλ	未稀释
16~	G2bλ	未稀释

^*，~；mAb 3-3和3-4以及mAb 3-15和3-16随后显示来自相同的克隆。

实施例8用于预防由兽类病原体溶血性曼氏杆菌，胸膜肺炎放线杆菌与多杀性巴氏杆菌所产生疾病的、基于LPS的糖结合物的筛选：结合化学以及小鼠免疫之后的免疫反应研究

为了制备糖结合物，LPS按下述过程进行衍生化。将来源于Mh losB突变株的LPS(145mg)和8K沉淀材料溶解于4N KOH(10mg/ml)并在125℃搅拌30h以脱除乙酰基，该Mh losB突变株具有目标结构。溶液冷却到室温，并以乙酸酐进行中和，这里乙酸酐用于重新N-乙酰化由该过程所产生的氨基。离心(9K，15分钟)除去沉淀盐，上清液上Sephadex G-25柱，以水为洗脱剂进行洗脱。收集糖阳性的组分，冻干，得到20-25％产率的KOH’d LPS(25mg 8K沉淀，33.3mg LPS)。产物在0.1M NaOH(10mg/ml)中室温处理2h以脱-O-乙酰基，在水中以SephadexG-25柱纯化，然后，冻干，获得约20％产率的KOH’d LPS。

通过¹H-NMR和ES-MS分析来进行质量控制。MS分析显示在KOH处理过的LPS材料中有一些异质性，所述异质性与末端庚糖残基和葡糖残基的可变缺失相一致。

去磷酸化作用

合并源自LPS或8K沉淀材料的产物，溶解(约10mg/ml)于含有重组碱性磷酸酶(Roche)(-140units/mg units alk.P/mg KOH’d LPS)的pH8.0的0.1M NH₄HCO₃缓冲液中，并于37℃搅拌4h进行去磷酸化作用。上述溶液加热到100℃保持5min，冷却，14K离心10min。上清冻干。

产物在水中以SephadexG-25柱脱盐，冻干，获得20％产率(48mg)的KOH’d alk.P’d LPS。通过¹H-NMR和CE-ES-MS分析来进行质量控制，这些分析证实了KOH处理的LPS的去磷酸化作用。

胺化作用

通过在600μl DMSO中溶解干燥的糖(48mg)，加入4800μl 2M NH4OAc甲醇溶液和120mg溶解于1200μl MeOH的NaCNBH₃，在pH8.3、50℃下反应72h，对目标aldehydo功能基团进行胺化。在N₂保护下蒸发MeOH，冻干产物并在水中以SephadexG-25柱纯化，冻干，获得约10％产率(32mg)的KOH’d alk.P’d胺化的LPS。通过¹H-NMR分析来进行质量控制，该¹H-NMR分析证实了KOH处理的LPS的胺化作用。

接头分子的附着

通过溶解干燥糖(32mg)于4000μl H2O中，加入4000μl MeOH，100μl squarate，在pH8.2(以三乙胺(4μl)调节)、室温下反应2h，每间隔15分钟检测pH，使接头分子(squarate)联接到产物氨基上。在N₂保护下蒸发MeOH，冻干产物并在水中以SephadexG-25柱纯化，冻干，获得约12％产率(30mg)的KOH’d alk.P’d胺化的squarated LPS。通过¹H-NMR、¹³C-¹H-NMR和CE-ES-MS分析进行质量控制，这些分析证实了squarate接头的联接。然而，MS分析显示只有50％材料带有squarate接头。

结合到蛋白载体上

通过在pH9.2室温下搅拌24h，将约20mg HSA连接到25倍摩尔过量的溶解于1ml 0.02M硼酸钠缓冲液中的squarate连接糖上，糖在反应开始时和反应6h后加入。24h后，取出一份，并通过MALDI-MS和SDS-PAGE检测，以糖特异性单克隆抗体G8进行Western印迹(图50)。最终反应混合物使用PBS(50mM磷酸钠，100mM NaCl，10mM柠檬酸钠，pH7.5)过Sepharose 6B柱纯化，以分离没有结合糖的分离物。与产物峰相对应的组分在Amicon ultra-15 10K cutoff spin柱中进行浓缩。对结合物的最终体系进行定量，通过BCA分析定量蛋白含量，通过PhOH/H₂SO₄方法确定糖含量，得出糖与蛋白的摩尔比为4.5∶1。同时，通过在1％乙酸中的纳米-电子-散射质谱分析对最终结合物和载体蛋白HAS进行了比较，结果显示了对应于HAS的预期分子量(图51a)以及与载体蛋白各种糖基化相一致的一系列峰(图51b)。

连接方案

步骤1

KOH处理Mh losB LPS

步骤2

alkP处理Mh losB KOH’d LPS

步骤3

alkP处理的Mh losB KOH’d LPS的胺化反应

步骤4

KOH’d alkP’d胺化的Mh losB LPS的squarate反应

步骤5

KOH’d alkP’d胺化的squarated Mh losB LPS的结合反应

结合物制备：

-Mh losB-HSA(约4CHO/CRM)，至小鼠

免疫过程

以结合物对6只6-8周龄的BALB/c小鼠进行免疫，作为对照，3只雌性6-8周龄的BALB/c小鼠以混合的糖和HAS进行免疫。所有疫苗均溶解于无菌PBS溶液，在Ribi佐剂中每0.1ml sc注射剂加有10μg糖。

小鼠按照如下时间表进行免疫：

0天   预抽血及初始注射

14天  第一次加强免疫

23天  试验性抽血

35天  第二次加强免疫

45天  小鼠抽血

在23天的试验性抽血以及在45天的最终抽血显示，#V2号小鼠表现出对糖抗原的IgG反应，如抗Mh losBLPS的LPS ELISA所揭示的那样(图52和53)。对来源于进行了三种免疫过程的#V2号小鼠的多克隆血清，对其与三种目标物交叉反应能力进行了检测。Ap、Mh与Pm的LPS和全细胞都能被该多克隆血清所识别(图54与55)。然而，来源于Neisseriameningitides株L3galE和L2galE的LPS和全细胞也能够分别在LPS和全细胞ELISA中所识别。这一现象归功于在KOH处理制备结合物的过程中糖抗原的部分降解，这会产生末端庚糖残基和己糖残基的各种形式缺失(见图49)。这将导致在最终结合物中有一部分这种糖抗原含有抗原决定簇，该抗原决定簇会模拟脑膜炎菌LPS区(用于测试多克隆血清V2)，进而导致这种已观察到的交叉反应活性。不过，用这种结合物血清进行免疫的小鼠培养到的血清能够识别来源于兽类病原体Ap、Pm和Mh的LPS和全细胞。

实施例9用对保守内核脂多糖特异性的单克隆抗体的杀菌实验

在D140时小鼠#1的多克隆血清识别Mh的完整细胞(图56)，并包含对Mh的内核LPS的特异性抗体(图57)，在杀菌实验中mAb G3，G8，3-5和3-16(图58-61)腹水连同对照腹水L2-16被用作杀菌实验的血清来源。该实验根据Sutherland A.D.1988.Vet.Microbiol.16：263-271的方法进行。简言之，在100ml BHI肉汤中，培养Mh细胞到～5×10³cfu/ml的生长水平。使用10ml的培养物，将其中的细胞在5000×g，4℃制成小球，并用D-PBS(含有Ca和Mg[Gibco # 14040-133])洗涤两次。最终的细胞小球再悬浮于10ml的D-PBS中。实验血清和腹水样品在56℃热灭活30min，以破坏内源补体。实验建立在96-孔，组织培养级，平底微量滴定板(NUNC)上，重复三次。每孔加入在D-PBS中适度稀释的抗血清20ul，接着加入细菌悬浮液(100ul)，将平板在RT培养15min。每孔加入补体(80ul，幼兔，#CL3441-S，Cedarlane)，将平板在37℃培养30min。将平板放置在冰上终止反应，每孔三分样品(50ul)涂板在BHI琼脂平板上，37℃培养过夜。每组实验中还包括只含有细菌悬浮液、有补体的细菌悬浮液和有适量稀释的抗体的细菌悬浮液的对照孔。

计数细菌的生长，计算相对于对照的致死百分数。

如下表和图62-64中所见，mAb G3和G8以及多克隆血清都促进MhA1 wt细胞的补体介导溶解作用。mAb 3-5和3-16的腹水的失效是由于这些血清的十分低的滴定度(操作稀释度1∶50相对于1∶10⁶)。

mAb G3和G8以及多克隆血清显示的杀菌活性阐明，Mh中对保守内核LPS表位特异性的抗体能够识别Mh全细胞，并且在功能上对Mh全细胞也是有活性的。

实施例9，表1.mAb G3和G8对Mh A1细胞的杀菌活性

实验条件	在50μl实验体积中Mh细胞的平均CFU(+/-SE)
									对照	1∶10,000	1∶20,000	1∶40,000	1×10-5	1×10-6	1×10-7	1×10-8
	Mh细胞单独	65+/-2.7	NA	NA	NA	NA	NA	NA									NA
Mh细胞+补体									55+/-4.6	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA
	Mh细胞+补体+G3	-	11+/-2.8	7+/-2.8	3+/-2.3	0	0	4+/-0.8									48+/-3.8
Mh细胞+G3									-	83+/-9.5	82+/-9	61+/-7.5	75+/-5.2	75+/-0.88	78+/-0.88	71+/-3
	Mh细胞+补体+G8	-	27+/-3	8+/-0.88	3+/-2.5	0	0	2+/-0.88									52+/-2.3
Mh细胞+G8									-	69+/-12	62+/-11	86+/-4.9	18+/-10	68+/-2.9	75+/-6	82+/-11

SE＝SD/√n 其中n＝样品容量

实施例9，表2.D140时多克隆血清Mh#1对Mh A1细胞的杀菌活性

实验条件	在50μl实验体积中Mh细胞的平均CFU(+/-SE)
					对照	1∶640	1∶1280	1∶1256
	Mh细胞单独	87+/-2.3	NA	NA					NA
Mh细胞+补体					80+/-6	NA	NA	NA
	Mh细胞+Mh#1 D140	NA	110+/-0.6	150+/-25					126+/-12
Mh细胞+补体+Mh#1 D140					NA	2+/-0.7	2+/-0.6	0

SE＝SD/√n其中n＝样品容量

实施例10使用对保守内核脂多糖特异性的单克隆抗体的被动保护实验

该实验根据Lopez et al.1982.Can，J.Comp.Med.46：314-316的方法使用如下所述的方法和改进进行。

小鼠和试剂：

在蛋白A柱上纯化mAb腹水的IgG，无菌过滤(图65)以用于被动保护实验。

试验的mAb G3和G8：G8，IgG2b，3.8mg/ml；G3，IgG2a，4.7mg/ml。

对照mAb：L2-16，IgG2b，1.9mg/ml。

Balb/c小鼠：40只雌性，6-8周龄，CRL.5只小鼠/组.

溶血性曼氏杆菌A1：7.5×10⁷cfu/小鼠.

实验计划和分组

组	处理试剂	处理条件
			A	-	-
B	对照MAB	体外温育
			C	G3	体外温育
D	G8	体外温育
			E	对照MAb	体内1小时
F	G3	体内1小时
			G	G8	体内1小时

D-1	mAb G3、G8和L2-16的纯化和定量
		D-1	在BHI琼脂上建造Mh A1平板
D0	使用Mh接种BHI肉汤在OD约1.2或者更高时收集Mh用于接种通过存活计数确定接种物将mAb IP给予E-G组小鼠将约108个Mh IN给予A组和E-G组小鼠将Mh与mAb一起体外培养30min将约108个预温育的Mh给予B-D组小鼠
		D1	每天观察小鼠并记录临床迹象至实验结束

D3	结束实验并收集：●肺的总体发病情况●切除肺以进行组织解剖

组	临床症兆i		宏观变化ii	组织学变化iii
					第2天	第3天
	A	++++iv					+++	+++v	+++vi
B			++++	++	+++	+++
	C	++(2)vii					-	++	++
D			++(2)	-	++	++
	E	++++					++(4)	++	+++
F			+++	-(4)	++	+到++
	G	+++					+到++(4)	++	+到++

ⁱ所有小鼠表现出不同程度的临床症兆，如粗糙的皮毛、脱水和不愿在DPI2上移动。然而，C和D组小鼠总体上是健康的，F和G组小鼠尽管有粗糙的皮毛，但是保持活跃。在DPI 3上，A和B组小鼠严重脱水，并体重降低，G组小鼠也有轻微的病状。

ⁱⁱ所有小鼠表现出不同程度的肺粘连(lung consolidarion)，并未采取尝试以确定涉及的面积大小。

ⁱⁱⁱ在各组之间的主要区别是，A、B和E组全部小鼠显示在他们的肺中比其他组的小鼠有更多的嗜中性粒细胞。然而，所有的小鼠，无论如何处理，都显示有某种程度的肺炎。

^iv++++：粗糙皮毛，中度到重度的体重降低，不愿移动；+++：粗糙皮毛，轻度到中度的体重降低和脱水，但保持活跃；++：粗糙皮毛并轻度的体重降低；+：轻度粗糙皮毛。

^v+++：中量面积的粘连；++：小面积的粘连。

^vi+++：中度的支气管肺炎伴随中量到大量的嗜中性粒细胞的出现和血管周围及支气管周围区域的淋巴细胞的显著渗入；++：微度到中度的支气管肺炎伴随少量的嗜中性粒细胞的出现和血管周围及支气管周围区域的淋巴细胞的渗入；+：微度的支气管肺炎伴随少量的嗜中性粒细胞的偶尔出现和血管周围及支气管周围区域的淋巴细胞的微度渗入。

^vii表现临床症状的小鼠数量

基于这个试验性的实验显示，mAb处理，特别是用溶血性曼氏杆菌的体外预温育，对临床症候和被感染小鼠的组织病理学上显示出中度影响。

图66显示对照小鼠B的中等大小的支气管腔中，中量的嗜中性粒细胞的出现，与发病机理相符，但是图67显示与图66同时杀死的C组小鼠的肺的一些区域中，显示出由于少量的淋巴样细胞的存在而引起的肺炎的消退，与通过体外预混合的mAb G3和Mh细胞提供的某种程度的保护一致。

生物保藏

溶血性曼氏杆菌菌株A1 losB于2005年5月4日在IDAC进行保藏。保藏编号为IDAC 040505-01。

                            序列表

<110>加拿大国家研究委员会(National Research Council of Canada)

<120>作为多物种疫苗候选物的保守性内核脂多糖表位

<130>PAT 2817W-90

<150>CA 2,467,329

<151>2004-05-14

<150>US 60/571,489

<151>2004-05-17

<160>6

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>waaQPM扩增的正向引物；具有BamHI位点用于克隆

<400>1

gagtaggatc ctgaaacatg ttccc                                      25

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>waaQPM扩增的反向引物，具有SalI位点用于克隆

<400>2

ggttgggtcg accaagccac attactg                                    27

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>losB-kpn引物

<400>3

atatggtacc tatcagcggt agagattcta ac                            32

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>losB-xba引物

<400>4

tgctctagac cgaacctgca ccaaaaagat ttaacgc                       37

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>与losB结构基因内的序列相对应的引物

<400>5

ccgctgcgag agataagtgg atactttatc                               30

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>与losB结构基因内的序列相对应的引物

<400>6

gacattggga tctttattta gatttcaaac cgac                          34

Claims (33)

1.一种分离的脂多糖部分，基本上由不含可变的外核寡糖链延伸的保守性二-葡糖基-四-庚糖基内核部分组成。

2.一种分离的脂多糖部分，基本上由通式I的葡糖基-庚糖基内核部分组成：

其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；R是H或者磷酸乙醇胺；R’″是H或者胸膜肺炎放线杆菌中的O-抗原；Kdo是3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；Q¹是H或者α-Glc；Q²是H、Kdo或者-P-R，其中P是磷酸酯，R是H或者磷酸乙醇胺；Q³是H或者去毒的脂质A；Q⁴是H或者

其中，R’和R″各自是H或者寡糖延伸，条件是如果R’″是H，且Q²是-P-R，其中R是H或者磷酸乙醇胺，那么Q¹是α-Glc。

3.一种分离的脂多糖部分，基本上由通式Ia的葡糖基-庚糖基内核部分组成；

其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；R是H或者磷酸乙醇胺；R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R’″是H或者胸膜肺炎放线杆菌中的O-抗原；Kdo是3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；Q¹是H或者α-Glc；Q²是H、Kdo或者-P-R，其中P是磷酸酯，R是H或者磷酸乙醇胺；脂质A是去毒的，条件是如果R’″是H，且Q²是-P-R，其中R是H或者磷酸乙醇胺，那么Q¹是α-Glc。

4.一种分离的脂多糖部分，基本上由具有结构I的二-葡糖基-四-庚糖基内核部分组成：

                                   结构I

其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；P是磷酸酯；R是H或者磷酸乙醇胺；R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R’″是H或者胸膜肺炎放线杆菌中的O-抗原；Kdo是3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；脂质A是去毒的。

5.一种分离的脂多糖部分，基本上由具有结构II的葡糖基-四-庚糖基内核部分组成：

                                   结构II

其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；R是H或者磷酸乙醇胺；R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R是H或者胸膜肺炎放线杆菌中的O-抗原；Kdo是3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；脂质A是去毒的。

6.权利要求1至5任一项的脂多糖部分，其中在内核部分中O-连接的基团在任意位置被取代。

7.一种药物组合物，包括权利要求1至6任一项的脂多糖部分，以及制药上可接受的载体。

8.权利要求7的药物组合物，其中制药上可接受的载体具有免疫原性。

9.一种功能性抗体，所述抗体针对溶血性曼氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌以及多杀性巴氏杆菌可发生交叉反应，并且所述抗体可结合权利要求1至6任一项的脂多糖部分中的表位。

10.一种制备和获得针对溶血性曼氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌以及多杀性巴氏杆菌的功能***叉反应抗体的方法，该方法包括：

(a)产生针对权利要求1至6任一项的脂多糖部分的抗体；

(b)将从步骤(a)获得的抗体针对溶血性曼氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌以及多杀性巴氏杆菌的多种菌株进行测试；

(c)选择与溶血性曼氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌以及多杀性巴氏杆菌的所有菌株都发生交叉反应的抗体。

11.权利要求7或8的组合物在制备治疗由巴斯德菌科的细菌感染所导致的疾病的药物中的应用，所述细菌具有该保守性内核结构。

12.权利要求7或8的组合物在制备治疗由曼氏杆菌、放线杆菌或巴氏杆菌属的细菌感染所导致的疾病的药物中的应用，所述细菌具有该保守性内核结构。

13.权利要求7或8的组合物在制备治疗由溶血性曼氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌或多杀性巴氏杆菌菌种的细菌感染所导致的疾病的药物中的应用，所述细菌具有该保守性内核结构。

14.根据权利要求11至13任一项的应用，其中所述疾病选自猪纤维蛋白出血性坏死性胸膜肺炎、禽霍乱、牛出血性败血病、猪萎缩性鼻炎、羊和牛肺炎巴斯德氏菌病(船运热)和羊败血病。

15.溶血性曼氏杆菌菌株A1 losB(IDAC 040505-01)。

16.一种减毒疫苗，包括巴斯德菌科的细菌菌株，所述细菌菌株缺少致病能力，并呈现来自保守性内核结构的脂多糖表位。

17.根据权利要求16的减毒菌株，其中所述细菌菌株选自曼氏杆菌、放线杆菌或巴氏杆菌属。

18.一种减毒疫苗，其包括在白细胞毒素基因上有突变的溶血性曼氏杆菌菌株A1 losB。

19.一种制备脂多糖部分的方法，所述脂多糖部分基本上由具有结构I的保守性二-葡糖基-四-庚糖基内核部分组成：

                                    结构I

其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；P是磷酸酯；R是H或者磷酸乙醇胺；R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R’″是H或者胸膜肺炎放线杆菌中的O-抗原；Kdo是3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；脂质A是去毒的；所述方法包括：

(a)从溶血性曼氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌或多杀性巴氏杆菌菌种中分离糖基转移酶基因失活的突变株，以使脂多糖部分以末端单元的形式呈现；

(b)在适于表达脂多糖部分的条件下，培养从步骤(a)中获得的溶血性曼氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌或多杀性巴氏杆菌的突变菌株；

(c)分离和鉴定得到的脂多糖部分；和

(d)使脂多糖部分的脂质A部分去毒。

20.一种制备脂多糖部分的方法，所述脂多糖部分基本上由具有结构I的保守性二-葡糖基-四-庚糖基内核部分组成：

                                      结构I

其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；P是磷酸酯；R是H或者磷酸乙醇胺R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R’″是H；Kdo是3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；脂质A是去毒的；所述方法包括：

(a)从溶血性曼氏杆菌菌种中分离losB基因失活的突变株；

(b)在适于表达脂多糖部分的条件下，培养从步骤(a)中获得的溶血性曼氏杆菌突变菌株；

(c)分离和鉴定得到的脂多糖部分；

(d)使脂多糖部分的脂质A部分去毒。

21.一种制备脂多糖部分的方法，所述脂多糖部分基本上由具有结构I的保守性二-葡糖基-四-庚糖基内核部分组成：

                                   结构I

其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；P是磷酸酯；R是H或者磷酸乙醇胺；R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R’″是H或者胸膜肺炎放线杆菌中的O-抗原；Kdo是3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；脂质A是去毒的；所述方法包括：

(a)从胸膜肺炎放线杆菌血清型1菌株中分离lbgA或rfbP基因失活的突变株；

(b)在适于表达脂多糖部分的条件下，培养从步骤(a)中获得的胸膜肺炎放线杆菌突变菌株；

(c)分离和鉴定得到的脂多糖部分；

(d)使脂多糖部分的脂质A部分去毒。

22.一种制备脂多糖部分的方法，所述脂多糖部分基本上由具有结构I的保守性二-葡糖基-四-庚糖基内核部分组成：

                                     结构I

其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；P是磷酸酯；R是H或者磷酸乙醇胺；R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R’″是H；Kdo是3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；脂质A是去毒的；所述方法包括：

(a)从多杀性巴氏杆菌菌株Pm70中分离PM0223或PM1143基因失活的突变株；

(b)在适于表达脂多糖部分的条件下，培养从步骤(a)中获得的多杀性巴氏杆菌突变菌株；

(c)分离和鉴定得到的脂多糖部分；

(d)使脂多糖部分的脂质A部分去毒。

23.一种单克隆抗体，其可与权利要求1至6任一项所定义的脂多糖部分中的表位相结合。

24.权利要求19至22任一项的方法，其进一步包括将所述脂多糖部分与所述内核脂多糖部分中包含的表位的特异性单克隆抗体接触，来识别该脂多糖部分。

25.权利要求24的方法，其中所述单克隆抗体如权利要求23所定义。

26.一种糖结合物，其包括与免疫原性载体相连接的、权利要求1至6任一项所定义的脂多糖部分。

27.根据权利要求26的糖结合物，其中脂多糖部分与免疫原性载体通过接头分子相连接。

28.权利要求26或27的糖结合物，其中所述接头分子选自squarate、胱胺、己二酸二酰肼、ε-氨基己酸、氯己醇二甲基缩醛、D-葡糖醛酸内酯和对硝基苯胺。

29.权利要求26至28任一项的糖结合物，其中所述的载体选自去毒绿脓杆菌毒素A、霍乱毒素/类毒素、百日咳毒素/类毒素、产气荚膜梭菌外毒素/类毒素、乙肝表面抗原、乙肝核心抗原、轮状病毒VP7蛋白、呼吸道合胞体病毒F和G蛋白、白喉类毒素CRM₁₉₇、破伤风类毒素TT、人血清白蛋白(HSA)、溶血性曼氏杆菌白细胞毒素类毒素、溶血性曼氏杆菌PlpE脂蛋白、胸膜肺炎放线杆菌OmlA、溶血性曼氏杆菌或者胸膜肺炎放线杆菌TbpA和B(转运结合蛋白)、溶血性曼氏杆菌唾液酸糖蛋白酶、胸膜肺炎放线杆菌选自Apx I到IV的Apx外类毒素、胸膜肺炎放线杆菌或者多杀性巴氏杆菌Plp-40脂蛋白、多杀性巴氏杆菌Omp28主要外膜蛋白、多杀性巴氏杆菌39kDa荚膜蛋白以及多杀性巴氏杆菌PlpB(39kDa交叉防护脂蛋白)。

30.一种疫苗组合物，其包括权利要求26至29任一项的糖结合物以及佐剂。

31.权利要求30的疫苗组合物，其中所述疫苗制成脂质体、古生菌体(archaeosome)或者来自古生菌脂质(archaeolipid)。

32.权利要求30或31的疫苗组合物，所述组合物在对哺乳动物进行免疫接种后，可诱导能与巴斯德菌科的细菌的全细胞发生交叉反应的抗血清。

33.一种多价疫苗组合物，其包括权利要求26至29任一项所定义的糖结合物以及佐剂的混合物。

Images