CN116920084A - 一种与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物,其中所述壁磷壁酸多糖包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元,其中部分所述核糖醇残基在3或4位被N‑乙酰基D‑葡糖氨基残基取代,且每个壁磷壁酸多糖分子均同时含有端基异构体构型为α和β的N‑乙酰基D‑葡糖氨基残基,并且其中所述载体蛋白质向缀合物提供至少一个被T辅助淋巴细胞识别的表位。本发明所述的与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物,应用于制备疫苗,在动物实验中均表现出较好的免疫活性,拥有广谱的抗菌活性,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物,属于医药技术领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌)隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus),有“嗜肉菌"的别称,是革兰氏阳性菌的代表。金葡菌是常见的人和动物机会致病菌,可定植于多种组织和器官中。在人类中,鼻子是最常见的定植位点。大约20-30%的健康人群持续存在着金葡菌,还有约30%的人群间歇性的携带金葡菌。鼻金葡菌定植化是社区和医院存在金葡菌感染的重要原因。金葡菌感染可引起多种疾病,包括:(1)皮肤和软组织感染,如疖病;(2)危及生命的感染,如肺炎和菌血症;(3)严重的并发症,如心内膜炎、脓毒性关节炎和骨髓炎。感染金葡菌的住院患者延长了住院时间,并增加了抗生素的使用量,提高了发病率、死亡率和治疗成本。
感染金葡菌后,通常可选用红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素或先锋霉素VI治疗,但由于抗生素的滥用,出现多种耐受抗生素的新菌株,特别是耐甲氧西林金葡菌菌株(Methicillin-resistant S.aureus,MRSA)的迅速蔓延使得单纯依靠抗生素治疗金葡菌引发的相关疾病变得越来越不可靠。MRSA导致的感染用抗生素疗法很难治愈且致死率高。因此,针对金葡菌疫苗的研发已广泛开展,虽然许多疫苗已经进入临床研究阶段,但目前还没有一款可以预防或治疗金葡菌感染的疫苗上市。
近年来,研究表明金葡菌表面的壁磷壁酸(Wall Teichoic acid,WTA)具有特异性的化学结构,是抗金葡菌疫苗开发的有效靶点。金葡菌WTA的主链由多聚1,5核糖磷酸酯(1,5-D-ribitol phosphate,RboP)重复单元组成,核糖醇上的羟基可以被D-丙氨酸和N-乙酰D葡糖氨基糖基选择性的修饰。目前,发现了三种N-乙酰D葡糖氨基糖基转移酶,tarS酶在C-4修饰β构型N-乙酰D葡糖氨基(β-1,4-GlcNAc),tarM酶在C-4修饰α构型N-乙酰D葡糖氨基(α-1,4-GlcNAc),tarP酶在C-3修饰β构型N-乙酰D葡糖氨基(β-1,3-GlcNAc)。近年来,人们已经化学合成了了单一糖基化构型修饰的WTA并制备成糖蛋白疫苗,通过动物实验表明这些疫苗可以诱导小鼠产生较高水平滴度的特异性IgG抗体。然而不同金葡菌菌株表达不同糖基化修饰构型的WTA,多种构型WTA组分的寡糖疫苗成为了新的方向。此外,天然提取的WTA存在均一性较差,质量难以控制的问题;而化学合成WTA存在合成步骤长、收率低等问题。
针对上述目前方法存在的问题,有必要寻求一种通过化学-酶法结合的方法,以合成多种构型的WTA。通过更简便的方法,得到多种构型的WTA,并进一步制备成糖蛋白结合疫苗从而应用于预防或治疗金葡菌的感染。
目前多组分寡糖疫苗的生产流程一般都是各单独组分寡糖与载体缀合后再通过一定的比例混合制备而成。这种类似鸡尾酒似的寡糖多组分疫苗需要多次与载体连接,经多次纯化,还需要按比例混合,增加了生产步骤,也不利于产品质量的控制。寻找一种新颖的多组分糖蛋白结合疫苗生产方法是大有脾益的。
发明内容
基于以上背景和当前技术难点,本发明基于WTA的三种糖基化修饰构型设计了化学-酶法结合的方法,合成了多种构型的WTA,并将合成的多组分壁磷壁酸多糖作为寡糖半抗原,与具有免疫原性的载体蛋白共价偶联制备得到的缀合物,可作为糖缀合疫苗。经验证,该方法制备的糖缀合疫苗具有较强的免疫原性,能诱导机体产生高滴度和多样的T细胞依赖的特异性IgG抗体。值得注意的是,本发明得到的单个WTA分子可以同时修饰多种糖基化构型,并通过进一步制备成寡糖疫苗,该新颖的多组分疫苗免疫产生的抗体可以识别含有不同WTA构型的金葡菌。这克服了目前金葡菌WTA结构多样性导致的疫苗普适性、制备和质量控制困难等问题。
为实现上述的技术目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一个方面,提供了一种与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物,所述多组分壁磷壁酸多糖缀合物包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元,其中部分所述核糖醇残基在3或4位被N-乙酰基D-葡糖氨基残基取代,且每个壁磷壁酸多糖分子均同时含有端基异构体构型为α和β的N-乙酰基D-葡糖氨基残基,所述多组分壁磷壁酸多糖与载体蛋白质共价结合形成所述缀合物,其中所述载体蛋白质向缀合物提供至少一个被T辅助淋巴细胞识别的表位。
可选的,在本发明的一种实施方式中,所述载体蛋白质包含至少一个T辅助表位的氨基酸链。
可选的,在本发明的一种实施方式中,所述壁磷壁酸多糖同时具有两种以上所述重复单元:
可选的,在本发明的一种实施方式中,所述壁磷壁酸多糖是通过化学酶法合成得到的,具体包括以下步骤:核糖醇-5-磷酸酯多聚物、糖供体与三种金黄色葡萄球菌壁磷壁酸N-乙酰D葡糖氨基糖基转移酶tarS,tarM和tarP其中至少两种,合成具有两种以上N-乙酰基D-葡糖胺基残基构型的金黄色葡萄球菌壁磷壁酸。
本发明方法包括tarS,tarM和tarP三种酶其中任意两种糖基转移酶催化方法,尤其是tarS,tarM两种酶共同作用的多种糖基转移酶依次催化方法,具体如下:
以5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰葡萄糖胺为糖基供体,通过多种糖基转移酶依次催化的方法,合成在一个WTA分子上同时含有β和α构型的N-乙酰D葡糖氨基残基修饰的壁磷壁酸;具体的为采用tarS,tarM两种酶先后依次催化的方法,其中tarS,tarM两种酶的先后次序可以依据实际需要进行调整,本发明不做限制。
本发明的具体方法包括以下步骤:
步骤一,化学合成结构均一的多聚的1,5核糖醇磷酸酯;
步骤二,采用酶法对所述1,5核糖醇磷酸酯多聚物进行糖基化修饰,即得。
可选的,在本发明的一种实施方式中,所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基为端基异构体构型α和端基异构体构型β。即所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基是端基异构体构型α和β的混合形式。
本发明所述合成的多组分壁磷壁酸多糖可以与载体蛋白连接形成缀合物,该缀合物可作为糖蛋白疫苗,并且其中所述载体蛋白质向缀合物提供至少一个被T辅助淋巴细胞识别的表位。研究表明,本发明所涉及的多种构型壁磷壁酸糖缀合物具有较强的免疫活性,能诱导机体产生高滴度和多样的T细胞依赖的特异性IgG抗体。值得注意的是,本发明得到的单个壁磷壁酸多糖分子可以同时修饰多种N-乙酰基D-葡糖胺基残基构型,并通过进一步制备成的寡糖疫苗免疫产生的抗体可以识别含有不同壁磷壁酸构型的金黄色葡萄球菌。
可选的,在本发明的一种实施方式中,所述的核糖醇-5-磷酸酯多聚物通过离子液体负载法高效且经济的得到。
可选的,在本发明的一种实施方式中,所述糖供体是5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰葡萄糖胺。
可选的,在本发明的一种实施方式中,所述壁磷壁酸多糖是通过化学酶法合成得到的,具体包括以下步骤:核糖醇-5-磷酸酯多聚物、糖供体与三种金黄色葡萄球菌壁磷壁酸N-乙酰D葡糖氨基糖基转移酶tarS,tarM和tarP其中至少两种,合成具有两种以上N-乙酰基D-葡糖胺基残基构型的金黄色葡萄球菌壁磷壁酸。
可选的,在本发明的一种实施方式中,在壁磷壁酸N-乙酰D葡糖氨基糖基转移酶存在下,核糖醇-5-磷酸酯多聚物修饰N-乙酰D葡糖氨基残基的数量与加入糖供体的量成正相关,具体为:当核糖醇-5-磷酸酯多聚物与糖供体的当量比为1:5时,修饰2个N-乙酰D葡糖氨基残基;当核糖醇-5-磷酸酯多聚物与糖供体的当量比为1:10时,修饰4个N-乙酰D葡糖氨基残基。
可选的,在本发明的一种实施方式中,一条核糖醇-5-磷酸酯多聚物依次经过tarS,tarM或tarM,tarS两种壁磷壁酸N-乙酰D葡糖氨基糖基转移酶催化后,合成具有β和α两种不同构型的N-乙酰D葡糖氨基残基构型的金黄色葡萄球菌壁磷壁酸。所述依次经过tarS,tarM或tarM,tarS两种酶催化指的是tarS,tarM两种酶以任意的先后次序进行均可,即可以是tarS+tarM的顺序,也可以是tarM+tarS的顺序。
可选的,在本发明的一种实施方式中,一条核糖醇-5-磷酸酯多聚物依次经过tarS,tarM两种壁磷壁酸N-乙酰D葡糖氨基糖基转移酶催化的反应方程式如下:
本发明的第二个方面,提供了一种多组分壁磷壁酸多糖的化学酶法合成方法,如以上任一所述的多组分壁磷壁酸多糖的化学酶法合成过程。
本发明的第三个方面,提供了一种多组分壁磷壁酸多糖,根据以上任一所述的多组分壁磷壁酸多糖的化学酶法合成得到。可选的,在本发明的一种实施方式中,所述多组分壁磷壁酸多糖具有两种以上N-乙酰基D-葡糖胺基残基构型,结构通式如下:
其中,R1和R2满足:
其中任意一种,或
其中任意一种,或
其中任意一种。
可选的,在本发明的一种实施方式中,基于上述多种糖基化构型WTA的抗原性,本领域基于常规研究思路可将其应用制备糖疫苗、或者基于其抗原性,将所述糖化合物作为分子识别标记用于携带药物、检测试剂等靶向不同WTA表型的金萄菌。
可选的,在本发明的一种实施方式中,本发明的多组分壁磷壁酸多糖缀合物是一种新颖模式的多组分WTA构型寡糖缀合物,所述寡糖缀合物由糖半抗原、连接臂及免疫载体依次连接构成。其中糖半抗原与传统的单一构型糖抗原不同,本发明的多组分糖抗原在一条1,5核糖醇磷酸酯多聚物上修饰了多种构型的N-乙酰D葡糖氨基,即采用以上所述的多组分壁磷壁酸多糖。
本发明第四方面,提供所述的与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物在制备疫苗中的应用,即提供一种寡糖疫苗,包含所述的与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物。动物免疫实验表明,本发明制备的糖缀合物疫苗免疫活性较强,均能在小鼠体内产生高滴度的IgG抗体,结果还表明,本发明所述的多组分壁磷壁酸多糖偶联后的糖蛋白缀合物免疫后可以产生针对多种WTA构型的IgG,这一结果显示本发明制备的糖缀合物是一种非常有潜力的抗金葡菌感染的糖疫苗。
本发明第五方面,提供所述寡糖疫苗在制备预防金葡菌感染药物中的用途。基于本发明研究提供的所述糖疫苗可用于预防多种不同WTA构型的金葡菌的感染,特别是针对一些MRSA。对医院和社区等高危人群预防金葡菌感染具有重要的意义。
以上一个或多个技术方案的有益效果是:本发明所述的与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物,应用于制备疫苗,在动物实验中均表现出较好的免疫活性,拥有广谱的抗菌活性,具有广阔的应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1:化合物6核磁图谱;
图2:化合物8核磁图谱;
图3:化合物10核磁图谱;
图4:化合物12核磁图谱;
图5:化合物13核磁图谱;
图6:化合物14核磁图谱;
图7:免疫后小鼠血清的抗体滴度;
图8:本发明缀合物的原理示意图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明实施例为一种与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物的制备方法,所述多组分壁磷壁酸多糖与载体蛋白质共价结合形成所述缀合物,其中所述载体蛋白质向缀合物提供至少一个被T辅助淋巴细胞识别的表位。该多组分壁磷壁酸多糖的制备方法是将化学方法与酶法相结合,具体包括以下步骤:
步骤一,以化学方法合成结构均一的核糖醇磷酸多聚物,如实施例1;
步骤二,通过三种糖基转移酶对糖链进行修饰(包括单一酶种类的修饰,如实施例2中的化合物7-12;及任意两种酶组合的修饰,如实施例2中的化合物13-14),实现结构复杂寡糖的多样化合成。
进一步的,单一酶种类的修饰如下:
所述的壁磷壁酸N-乙酰D葡糖氨基糖基转移酶tarS催化核糖醇-5-磷酸酯多聚物反应后,所述被N-乙酰D葡糖氨基残基修饰的部分重复单元具有以下结构或其盐:
所述的壁磷壁酸N-乙酰D葡糖氨基糖基转移酶tarM催化核糖醇-5-磷酸酯多聚物反应后,所述被N-乙酰D葡糖氨基残基修饰的部分重复单元具有以下结构或其盐:
所述的壁磷壁酸N-乙酰D葡糖氨基糖基转移酶tarP催化核糖醇-5-磷酸酯多聚物反应后,所述被N-乙酰D葡糖氨基残基修饰的部分重复单元具有以下结构或其盐:
以上单一酶种类的催化修饰后的产物再进一步经第二种酶催化修饰,得到同时含有端基异构体构型为α和β的N-乙酰基D-葡糖氨基残基的壁磷壁酸多糖分子。
同时本发明提供了合成寡糖在糖疫苗方向上的应用方法,把合成的寡糖与载体蛋白缀合,并在小鼠中体内实验验证其免疫活性。
实验采用试剂均为市售。
需要指出的是:酶法修饰后,其每条糖链上的N-乙酰氨基D葡萄糖数量是不均一的,而每条糖链上N-乙酰氨基D葡萄糖的平均个数通过核磁分析计算得到。
下面结合具体的实施例,对本发明做进一步的详细说明,应该指出,所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
1.化学法合成七聚核糖醇-5-磷酸衍生物
七聚核糖醇-5-磷酸衍生物的合成路线
具体操作如下:
1.1、4-((1-甲基咪唑-3-基)甲基)苄基(5-(2,3,4-三-O-苄基-D-核糖醇磷酸)戊基)氨基甲酸酯,六氟磷酸盐(化合物3,以下的化合物均直接以数字表示)的制备
4-((1-甲基咪唑-3-基)甲基)苄基-(5-羟基戊基)氨基甲酸酯,六氟磷酸盐1(480mg,1.0mmol)和1-O-磷酸三乙胺-2,3,4-O-苄基-O-三苯甲基-D-核糖醇2((1.25g,1.7mmol)真空干燥后溶于无水吡啶中,加入事先溶于吡啶的新戊酰氯(155μL,1.2mmol)并在室温下反应5h。再加入准备好的碘单质混合溶液(2eq的碘溶于450μL吡啶和50μL水的)中,室温下继续搅拌30min,浓缩反应液并用大量二氯甲烷溶解,加入饱和硫代硫酸钠和饱和氯化钠洗,有机相经无水硫酸钠干燥后过滤并浓缩。将浓缩后的粗产物用最少量的二氯甲烷溶解,并加入八倍体积的无水***,充分震荡后,离心(6000r.min-1,2min),取沉淀并继续重复二氯甲烷溶解无水***沉淀操作三次。沉淀后的产物溶于冰的2%盐酸/乙腈(v/v)混合液中,并在室温下反应1h,反应液加入甲苯稀释后浓缩。将浓缩后的粗产物用最少量的二氯甲烷溶解,并加入八倍体积的无水***,充分震荡后,离心(6000r.min-1,2min),取沉淀并继续重复DCM溶解***沉淀操作三次。得到淡黄色油状液体,即为4-((1-甲基咪唑-3-基)甲基)苄基(5-(2,3,4-三-O-苄基-D-核糖醇磷酸)戊基)氨基甲酸酯,六氟磷酸盐3(900mg,95%)。
1.2、4-((1-甲基咪唑-3-基)甲基)苄基(5-(2,3,4-三-O-苄基-D-核糖醇磷酸)戊基)氨基甲酸酯-(1→5)-2,3,4-三-O-苄基-D-核糖醇磷酸-(1→5)-2,3,4-三-O-苄基-D-核糖醇磷酸-(1→5)-2,3,4-三-O-苄基-D-核糖醇磷酸-(1→5)-2,3,4-三-O-苄基-D-核糖醇磷酸-(1→5)-2,3,4-三-O-苄基-D-核糖醇磷酸-(1→5)-2,3,4-三-O-苄基-5-O-三苯甲基-D-核糖醇磷酸,六氟磷酸盐(5)的制备
以化合物3为起始原料,重复合成化合物3的方法进行糖链的延申,得到化合物5(820mg,52%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.94(s,1H),7.61–6.80(m,125H),5.26(m,2H),5.03(m,2H),4.77–4.38(m,41H),4.37–4.04(m,25H),3.99–3.65(m,27H),2.99(t,J=6.9Hz,2H),1.45(q,J=7.2Hz,2H),1.37–1.32(m,2H),1.24–1.21(m,2H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ144.17,138.69,136.54,128.61,128.57,128.17,127.89,127.83,127.68,127.63,127.59,127.53,127.49,127.36,127.04,126.99,126.95,126.62,123.86,78.60,73.73,73.61,73.48,72.23,72.10,72.02,65.17,52.38,48.54,40.34,35.32,30.08,29.06,26.29,22.65.31PNMR(243MHz,CDCl3)δ0.52.MALDI-TOF-MS:calcd for C219H236N3Na9O52P7 3+[M-PF6+2Na]3+4163.3141,found 4162.9710.
1.3、5-氨基戊基-D-核糖醇磷酸-(1→5)-D-核糖醇磷酸-(1→5)-D-核糖醇磷酸-(1→5)-D-核糖醇磷酸-(1→5)-D-核糖醇磷酸-(1→5)-D-核糖醇磷酸-(1→5)-D-核糖醇磷酸-(1→5)-D-核糖醇磷酸化合物6的制备
化合物5(760mg,0.18mmol)溶于5mL甲醇/二氯甲烷(v/v=4/1)的混合溶液中并加入2滴甲醇钠(5mol/L)。室温下反应5h后加入少量H+树脂,搅拌30min至反应液呈中性过滤除去树脂并浓缩反应液。将浓缩后的产物溶于甲醇(2mL),蒸馏水(100μL)和甲酸(20μL)的混合溶液中,再加入与离子液体终产物质量相等的20%Pd(OH)2/C(w:w=1:1),在9bar氢气下的高压釜内反应7天。反应结束后用硅藻土过滤掉固体,并用MeOH和水洗多次。收集的滤液浓缩后溶于少量的蒸馏水中并倒入填充有Dowex 50WX8 Na+型树脂的重力柱,并用蒸馏水洗脱,收集产物并用冻干机冻干。冻干的粗产物再用装有葡聚糖LH-20填料柱纯化(蒸馏水为溶剂),收集产物合并后冻干机冻干即得到脱保护后的白色固体产物,即为化合物6(233mg,0.13mmol),产率为73%。
1H NMR(600MHz,D2O)δ4.05–3.47(m,51H),2.86(t,J=7.5Hz,2H),1.55(q,J=11.4,9.3Hz,4H),1.33(p,J=7.5Hz,2H).13C NMR(151MHz,D2O)δ72.05,71.67,71.14,70.84,65.96,62.31,39.39,29.09,29.05,26.27,22.02.31P NMR(243MHz,D2O)δ1.73.MALDI-TOF-MS:calcd for C40H85NNa8O50P7 3+[M+2H+Na]3+1780.1484,found1778.8164;C40H87NNa7O50P7 4+[M+4H]4+1759.1743,found 1759.4164.
实施例2酶法糖链修饰,合成复杂的寡糖
2.1TarP、TarS和TarM粗酶液的制备
构建好的分别可以表达TarP、TarS和TarM三种酶的大肠杆菌经发酵培养,离心收集菌体,具体的发酵培养方法可采取常规的通用培养方式,在本发明中不做限制。将收集到的菌体分多次加入15-20mL裂解液(20mmol Tris,5mmol MgCl2,pH 8)进行溶解,并将菌液转移至100mL烧杯中,用超声破碎仪对菌液进行超声,即得裂解菌液。超声使用方法:为保持低温环境,将100mL烧杯固定在冰上进行超声,超声过程要时刻观察,确保超声探头距离烧杯底部1cm左右,太高会影响裂解效果,条件为On 3s,Off 5s,超声30min。将上述的裂解液转移到50mL离心管中配平,在4℃、12000r/min条件下离心25min,取得得上清液即可直接后于之后的酶反应。
2.2单一糖基转移酶修饰糖链
下表1总结了单一糖基转移酶催化下的反应及结果。
表1单一糖基转移酶催化下的反应及结果
从表1的结果可以看出,TarP、TarS和TarM三种酶都可以进行单一糖基转移酶催化,获得对应的具有2/4个α/β构型的GlcNAc。
化合物7-12的制备过程分别如下:
化合物7的合成
将化合物6(5.0mg,2.8μmmol)和5个当量的5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰葡萄糖胺(9.3mg,14.2μmmol)溶于蒸馏水中(100μL),之后加入100μL的TarP粗酶液,室温下反应2h后。加入40μL的冰甲醇,摇晃均匀后,在4℃、8000r/rnin条件下离心5min使析出来的蛋白质分离。上清液冻干后过Dowex 50W X8 Na+树脂填装的离子交换柱,使用蒸馏水作用洗脱液。纯化后粗产物再经过葡聚糖凝胶填料LH-20纯化,使用蒸馏水作用洗脱液。收集纯化后的产物冻干即得到白色产物7(4.8mg,2.2μmmol),产率为79%。
1H NMR(600MHz,D2O)δ4.49(d,J=8.6Hz,2H),4.21–3.28(m,66H),2.87(t,J=7.9Hz,2H),1.94(s,6H),1.54(d,J=11.5Hz,4H),1.33(s,2H).
化合物8的合成
将化合物6(5.0mg,2.8μmmol)和10个当量的5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰葡萄糖胺(18.5mg,28.4μmmol)溶于蒸馏水中(100μL),之后加入100μL的TarP粗酶液,室温下反应2h后。加入40μL的冰甲醇,摇晃均匀后,在4℃、8000r/rnin条件下离心5min使析出来的蛋白质分离。上清液冻干后过Dowex 50W X8 Na+树脂填装的离子交换柱,使用蒸馏水作用洗脱液。纯化后粗产物再经过葡聚糖凝胶填料LH-20纯化,使用蒸馏水作用洗脱液。收集纯化后的产物冻干即得到白色产物8(4.7mg,2.2μmmol),产率为72%。
1H NMR(400MHz,D2O)δ4.56(d,J=8.4Hz,4H),4.08–3.40(m,85H),2.94(t,J=7.3Hz,2H),2.02(s,11H),1.69–1.59(m,4H),1.43–1.36(m,2H).
化合物9的合成
将化合物6(5.0mg,2.8μmmol)和5个当量的5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰葡萄糖胺(9.3mg,14.2μmmol)溶于蒸馏水中(100μL),之后加入100μL的TarS粗酶液,室温下反应2h后。加入40μL的冰甲醇,摇晃均匀后,在4℃、8000r/rnin条件下离心5min使析出来的蛋白质分离。上清液冻干后过Dowex 50W X8 Na+树脂填装的离子交换柱,使用蒸馏水作用洗脱液。纯化后粗产物再经过葡聚糖凝胶填料LH-20纯化,使用蒸馏水作用洗脱液。收集纯化后的产物冻干即得到白色产物9(4.7mg,2.2μmmol),产率为78%。
1H NMR(400MHz,D2O)δ4.73(d,J=8.3Hz,2H),4.45–3.73(m,53H),3.68–3.35(m,12H),3.00(t,J=6.1Hz,2H),2.07(s,5H),1.68(d,J=8.5Hz,4H),1.47(t,J=7.9Hz,2H).
化合物10的合成
将化合物6(5.0mg,2.8μmmol)和10个当量的5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰葡萄糖胺(18.5mg,28.4μmmol)溶于蒸馏水中(100μL),之后加入100μL的TarS粗酶液,室温下反应2h后。加入40μL的冰甲醇,摇晃均匀后,在4℃、8000r/rnin条件下离心5min使析出来的蛋白质分离。上清液冻干后过Dowex 50W X8 Na+树脂填装的离子交换柱,使用蒸馏水作用洗脱液。纯化后粗产物再经过葡聚糖凝胶填料LH-20纯化,使用蒸馏水作用洗脱液。收集纯化后的产物冻干即得到白色产物10(5.5mg,2.1μmmol),产率为76%。
1H NMR(600MHz,D2O)δ4.12–3.20(m,82H),2.73(d,J=12.7Hz,2H),1.94(s,12H),1.55(dd,J=15.4,8.1Hz,4H),1.33(d,J=12.8Hz,2H).
化合物11的合成
将化合物6(5.0mg,2.8μmmol)和5个当量的5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰葡萄糖胺(9.3mg,14.2μmmol)溶于蒸馏水中(100μL),之后加入100μL的TarM粗酶液,室温下反应2h后。加入40μL的冰甲醇,摇晃均匀后,在4℃、8000r/rnin条件下离心5min使析出来的蛋白质分离。上清液冻干后过Dowex 50W X8 Na+树脂填装的离子交换柱,使用蒸馏水作用洗脱液。纯化后粗产物再经过葡聚糖凝胶填料LH-20纯化,使用蒸馏水作用洗脱液。收集纯化后的产物冻干即得到白色产物11(4.3mg,2.0μmmol),产率为71%。
1H NMR(600MHz,D2O)δ4.68(d,J=3.5Hz,2H),3.99–3.39(m,55H),3.29–3.05(m,8H),2.63(t,J=7.5Hz,2H),1.68(s,6H),1.32(dd,J=15.1,7.6Hz,4H),1.10(d,J=9.0Hz,2H).
化合物12的合成
将化合物6(5.0mg,2.8μmmol)和10个当量的5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰葡萄糖胺(18.5mg,28.4μmmol)溶于蒸馏水中(100μL),之后加入100μL的TarM粗酶液,室温下反应2h后。加入40μL的冰甲醇,摇晃均匀后,在4℃、8000r/rnin条件下离心5min使析出来的蛋白质分离。上清液冻干后过Dowex 50W X8 Na+树脂填装的离子交换柱,使用蒸馏水作用洗脱液。纯化后粗产物再经过葡聚糖凝胶填料LH-20纯化,使用蒸馏水作用洗脱液。收集纯化后的产物冻干即得到白色产物12(4.9mg,2.0μmmol),产率为68%。
1H NMR(400MHz,D2O,60℃)δ5.09(d,J=3.6Hz,4H),4.12–3.82(m,78H),3.71–3.49(m,11H),2.90(s,2H),2.09(d,J=7.8Hz,12H),1.72(s,4H),1.50(s,2H).
2.3多种糖基转移酶依次修饰糖链
具体步骤为:将化合物7/9/11和5个当量的5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰葡萄糖胺溶于蒸馏水中(100μL),之后加入100μL的另外任意一种粗酶液,室温下反应2h后。加入40μL的冰甲醇,摇晃均匀后,在4℃、8000r/rnin条件下离心5min使析出来的蛋白质分离。上清液冻干后过Dowex 50W X8 Na+树脂填装的离子交换柱,使用蒸馏水作用洗脱液。纯化后粗产物再经过葡聚糖凝胶填料LH-20纯化,使用蒸馏水作用洗脱液。收集纯化后的产物冻干即得。
下表2总结了多种糖基转移酶依次催化下的反应及结果。
表2多种糖基转移酶依次催化下的反应及结果
从表2的结果可以看出,
(ⅰ)当以已经通过TarP酶修饰有2个β构型的GlcNAc的化合物7为底物时,再使用TarS和TarM两种酶进行多种糖基转移酶催化,体系并不发生反应,说明经TarP酶修饰后,无法再进行糖基转移酶催化反应。
(ⅱ)当以已经通过TarS或TarM酶修饰有2个α/β构型的GlcNAc的化合物9/11为底物时,再使用TarM或TarS酶进行多种糖基转移酶催化,体系可以继续修饰另一种不同构型的GlcNAc;而再使用TarP酶进行多种糖基转移酶催化,体系并不发生反应,说明经TarS或TarM酶修饰后,还可以继续使用TarM或TarS酶进行多种糖基转移酶催化,而不能与TarP酶继续反应。
因此,我们可以认为,TarP、TarS和TarM三种酶都可以进行单一糖基转移酶催化,获得对应的具有2/4个α/β构型的GlcNAc;而TarS和TarM酶还可以进行多种糖基转移酶催化,获得对应的具有2个α+2个β构型的GlcNAc,反应方程式如下。
化合物13、14的制备过程分别如下:
化合物13的合成
将化合物9(4.0mg,1.8μmmol)和5个当量的5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰葡萄糖胺(5.7mg,9.2μmmol)溶于蒸馏水中(100μL),之后加入100μL的TarM粗酶液,室温下反应2h后。加入40μL的冰甲醇,摇晃均匀后,在4℃、8000r/rnin条件下离心5min使析出来的蛋白质分离。上清液冻干后过Dowex 50W X8 Na+树脂填装的离子交换柱,使用蒸馏水作用洗脱液。纯化后粗产物再经过葡聚糖凝胶填料LH-20纯化,使用蒸馏水作用洗脱液。收集纯化后的产物冻干即得到白色产物13(3.7mg,1.4μmmol),产率为80%。
1H NMR(600MHz,D2O)δ4.22–3.62(m,62H),3.52–3.30(m,12H),2.72(s,2H),1.95–1.88(m,12H),1.57(ddt,J=36.7,14.1,7.5Hz,4H),1.36–1.28(m,2H).
化合物14的合成
将化合物11(4.5mg,2.3μmmol)和5个当量的5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰葡萄糖胺(7.3mg,11.6μmmol)溶于蒸馏水中(100μL),之后加入100μL的TarS粗酶液,室温下反应2h后。加入40μL的冰甲醇,摇晃均匀后,在4℃、8000r/rnin条件下离心5min使析出来的蛋白质分离。上清液冻干后过Dowex 50W X8 Na+树脂填装的离子交换柱,使用蒸馏水作用洗脱液。纯化后粗产物再经过葡聚糖凝胶填料LH-20纯化,使用蒸馏水作用洗脱液。收集纯化后的产物冻干即得到白色产物14(4.3mg,1.7μmmol),产率为73%。
1H NMR(400MHz,D2O,60℃)δ5.38(d,J=3.6Hz,2H),5.07(d,J=9.4Hz,2H),4.53–3.66(m,86H),3.51–3.06(m,2H),2.38(t,J=7.4Hz,12H),2.00(m,4H),1.78(m,2H).
实施例3多组分壁磷壁酸糖蛋白结合疫苗的免疫评价
3.1壁磷壁酸糖蛋白缀合物的制备
糖抗原的活化及与载体蛋白的缀合
将化学酶法合成的金葡菌壁磷壁酸多糖(3mg)和双琥珀酰亚胺戊二酸酯(9mg)溶解于N,N-二甲基亚砜和PBS磷酸缓冲液(pH 8.0,0.1M)的混合溶液中(1mL,v/v=4:1),室温反应4h后,反应液通过离心浓缩仪除去溶剂得到混合固体,用乙酸乙酯多次洗涤除去多余的双琥珀酰亚胺戊二酸酯从而得到寡糖半抗原氨基活化酯。将上述氨基活化的寡糖(3mg)分别与TT或HSA(6mg)载体蛋白溶于PBS磷酸缓冲液(pH8.0,0.1M)(0.5mL)中,在25℃下摇床反应3天,之后通过10kDa的超滤管除去未与蛋白连接的寡糖,纯化后的蛋白溶液冷冻干燥得到白色固体。
壁磷壁酸糖蛋白缀合物负载率的确定
得到的糖蛋白缀合物用蒸馏水配置成1mg/mL,并通过MALDI-TOF-MS测得平均分子量,再计算得到平均负载率。测得负载率为:6a,2.6%;8a,3.3%;10a,3.2%;12a,2.6%;13a,3.5%;14a,1.9%;6b,2.2%;8b,2.0%;10b,2.4%;12b,1.9%;13b,2.2%;14b,2.1%。
3.2壁磷壁酸糖蛋白缀合物6b,8b,10b,12b,13b,14b的免疫活性评价
寡糖蛋白缀合物6b,8b,10b,12b,13b,14b的免疫活性测试在小鼠(Balb/c,雌性,每组5只)体内进行,免疫方式为第0天初次免疫使用弗氏完全佐剂并采用肌内注射,第7、14和21天使用弗氏非完全佐剂并采用皮下注射,每次每只鼠注射0.1mL乳液(含3μg糖抗原)。第0、7、14、21天采用腿静脉取血样,第28天采用眼球取血样。以6a,8a,10a,12a,13a,14a为铺板底物酶联免疫吸附实验(ELISA)检测特异性抗体滴度,结果见图7。
小鼠经缀合物6b,8b,10b,12b,13b,14b免疫后,除了没有糖基化修饰的6b,其它都产生了高滴度的IgG抗体,说明糖蛋白缀合物8b,10b,12b,13b,14b诱导小鼠产生的免疫响应是T细胞参与的,该响应能够使宿主细胞产生长久的免疫记忆,进而起到抗金葡菌感染的作用。且新型的二价缀合物13b,14b同时产生了可以识别两种不同糖基化构型抗原的抗体。
3.3小鼠免疫后血清体外结合多款金葡菌能力的测定
下表3总结了实验所用8株金葡菌菌株的来源及基因表型。
表3金葡菌菌株的来源及基因表型
金黄色葡萄球菌菌株 | 来源 | tarS | tarM | tarP |
ATCC 6538(MSSA) | ATCC | + | - | - |
ATCC 25904(Newman MRSA) | ATCC | + | + | - |
ATCC 55804(MRSA) | ATCC | + | + | + |
ATCC 29213(MSSA) | ATCC | + | - | - |
2020(MRSA) | 医院分离 | + | - | + |
2101(MRSA) | 医院分离 | + | - | + |
2107(MRSA) | 医院分离 | + | - | + |
2403(MRSA) | 医院分离 | + | + | + |
将各个金葡菌菌株分别在SATA高盐培养基中,37℃、200rpm下培养过夜。取适量金葡(约1×106CFU)并用PBS-1%BSA洗涤两次,重悬于100μL PBS缓冲液中,加入相同体积的含豚鼠IgG抗体的PBS溶液(1μg.L-1),在37℃孵育1h后,PBS-1%BSA洗涤两次。然后与2μL的第28天待测血清在4℃下孵育1h。此后,将菌体用PBS-1%BSA洗涤两次,并与FITC连接的山羊抗小鼠IgG抗体(1μL溶在50μL PBS中)在4℃下孵育1h。最后用PBS-1%BSA洗涤细菌并悬浮在流式缓冲液(200μL)中,使用流式细胞仪进行FACS分析并在FlowJo软件上分析数据。对于测试的每种免疫血清,通过软件计算荧光强度的几何平均值(MFI)。然后根据一式三份测试的“测试样品”提供的三个MFI的平均值与“阴性对照组”血清提供的三个MFI的平均值之间的比率,计算每个测试样品“比值”,并记为n,n<2为-,2<n<4为+-,4<n<8为+,8<n<16为++,16<n为+++,如下表4所示。
表4不同血清的MFI比值
上表显示的结果非常清楚的表明:构建的多价糖蛋白缀合物13b和14b都可以诱导高滴度的特异性抗体,这些抗体可以有效的识别多种壁磷壁酸糖基转移酶基因表型的MSSA或MRSA,并且这种识别能力显著强于没有GlcNAc残基修饰的糖蛋白缀合物6b免疫后的血清,且不弱于甚至强于单组分GlcNAc残基修饰的糖蛋白缀合物8b、10b和12b免疫后的血清。
3.4小鼠免疫后血清体外介导调理吞噬作用杀伤多款金葡菌能力的测定
将SATA培养基下培养的金葡菌(约1×104CFU)与2μL待测小鼠血清和40μL OPK缓冲液(9.5mL Hanks含Ca2+和Mg2+缓冲液中加入0.5mL FBS和100mg gelatin)混合,置于96孔板中,每组三个平行。转移至二氧化碳培养箱中37℃孵育,30min后每孔再依次加入2μL兔补体和40μL分化后待用的HL-60细胞。96孔板在二氧化碳培养箱中37℃孵育2h,接着转移至4℃,孵育20min以终止反应。随后,每孔取5μL混合液涂布于LB琼脂皿上。将琼脂皿置于37℃下培养过夜,最后计数得到CFU值,并按照公式计算OPK值。
然后根据不同血清对不同菌株体外诱导的OPK水平,其OPK值记为n,n<15%为-,15%<n<30%为+-,30%<n<45%为+,45%<n<60%为++,60%<n为+++,如下表5所示。
表5不同血清对不同菌株体外诱导的OPK水平
上表显示的结果表明:构建的多价糖蛋白缀合物13b和14b都可以体外介导OPK效应,并显示出高效的杀伤活性。且在许多菌株中,两款多组分疫苗造成的杀伤优于单组分糖蛋白缀合物8b、10b和12b,这预示着多价糖蛋白缀合物13b和14b免疫产生的抗体或激发的免疫反应可以更有效的对抗多种壁磷壁酸糖基转移酶基因表型的MSSA或MRSA的感染,拥有广谱的抗菌活性。
3.5多组分壁磷壁酸糖蛋白结合疫苗的优点
如图8所示为本发明缀合物的作用原理示意图。在实施案例3.2中,化学酶法构建的同时含有α和β构型GlcNAc修饰的WTA多组分疫苗13b和14b,免疫后在体内可以同时产生高滴度的、可识别α和β构型GlcNAc修饰WTA的IgG抗体。在实施案例3.3中,多组分疫苗13b和14b免疫产生的抗体具有广谱的识别多种基因型金葡菌的能力。在实施案例3.4中,多组分疫苗13b和14b免疫产生的抗体介导调理吞噬作用,高效的杀伤多款MSSA和MRSA。这些结果表明多组分疫苗13b和14b具有成为预防或治疗金葡菌感染的潜力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物,其特征在于,所述多组分壁磷壁酸多糖包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元,其中部分所述核糖醇残基在3或4位被N-乙酰基D-葡糖氨基残基取代,且每个壁磷壁酸多糖分子均同时含有端基异构体构型为α和β的N-乙酰基D-葡糖氨基残基,所述多组分壁磷壁酸多糖与载体蛋白质共价结合形成所述缀合物,其中所述载体蛋白质向缀合物提供至少一个被T辅助淋巴细胞识别的表位。
2.根据权利要求1所述的缀合物,其特征在于,所述载体蛋白质包含至少一个T辅助表位的氨基酸链。
3.根据权利要求1所述的缀合物,其特征在于,所述壁磷壁酸多糖同时具有两种以上所述重复单元:
4.根据权利要求1所述的缀合物,其特征在于,所述缀合物结构通式如下:
其中,R1和R2满足:
和H;/>和H;其中任意一种,或
和H;/>和H;其中任意一种,或
R1=H;和/>和H;其中任意一种。
5.根据权利要求1所述的缀合物,其特征在于,所述多组分壁磷壁酸多糖是通过化学酶法合成得到的,具体包括以下步骤:核糖醇-5-磷酸酯多聚物、糖供体与三种金黄色葡萄球菌壁磷壁酸N-乙酰D葡糖氨基糖基转移酶tarS,tarM和tarP其中至少两种,合成具有两种以上N-乙酰基D-葡糖胺基残基构型的金黄色葡萄球菌壁磷壁酸。
6.根据权利要求5所述的缀合物,其特征在于,一条核糖醇-5-磷酸酯多聚物依次经过tarS,tarM或tarM,tarS两种壁磷壁酸N-乙酰D葡糖氨基糖基转移酶催化后,合成具有β和α两种不同构型的N-乙酰D葡糖氨基残基构型的金黄色葡萄球菌壁磷壁酸。
7.根据权利要求5所述的缀合物,其特征在于,所述的核糖醇-5-磷酸酯多聚物通过离子液体负载法得到。
8.根据权利要求5所述的缀合物,其特征在于,所述糖供体是5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰葡萄糖胺。
9.根据权利要求5所述的缀合物,其特征在于,在壁磷壁酸N-乙酰D葡糖氨基糖基转移酶存在下,核糖醇-5-磷酸酯多聚物修饰N-乙酰D葡糖氨基残基的数量与加入糖供体的量成正相关,具体为:当核糖醇-5-磷酸酯多聚物与糖供体的当量比为1:5时,修饰2个N-乙酰D葡糖氨基残基;当核糖醇-5-磷酸酯多聚物与糖供体的当量比为1:10时,修饰4个N-乙酰D葡糖氨基残基。
10.一种如权利要求1-9任一所述的缀合物,作为寡糖疫苗,在制备预防金黄色葡萄球菌感染药物中的用途。
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